Keefektifan bakteri endofit dan plant growth
advertisement
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2010 – Maret 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan di Rumah Kaca serta di Kebun Percobaan, University Farm, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bakteri endofit yang digunakan diperoleh dari penelitian sebelumnya yang diisolasi dari batang tanaman tomat sehat di wilayah Bogor, Cipanas, dan Lembang yaitu isolat dengan kode BL10, BC4, dan BC10 (Damayanti 2010). Bakteri PGPR yang digunakan yaitu Pseudomonas fluorescens RH4003 dan Bacillus subtilis AB89 yang merupakan koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB (Nawangsih 2006). Bakteri Ralstonia solanacearum diisolasi dari tanaman tomat yang terserang layu bakteri, tanaman sampel berasal dari Lembang, Bandung. Dalam penelitian digunakan pula tanah dari lapangan yang telah mengandung bakteri R. solanacearum yang diambil di sekitar pertanaman tomat yang terserang layu bakteri dan tanah steril. Digunakan pula pupuk kandang untuk menambah unsur hara tanah. Bahan-bahan kimia yang digunakan terdiri dari media TZC, King’s B Agar (KBA), media cair 523, nutrient agar dan nutrient broth. Benih tomat yang digunakan dalam pengujian adalah varietas Arthaloka. Pot tray dan polybag digunakan dalam pembibitan dan pengujian tanaman tomat di rumah kaca. Metode Penelitian Penyiapan tanaman uji Varietas tomat yang digunakan dalam pengujian yaitu varietas Arthaloka. Media tanam yang digunakan dalam pembibitan yaitu kompos dan sekam dengan perbandingan 1:1. Benih tomat disemai pada pot tray dengan dua benih tiap lubang. Setelah disemai, benih disiram secukupnya kemudian pot tray ditutup menggunakan koran selama dua hari untuk menjaga kelembaban. Bibit disiram 13 setiap dua hari sekali. Setelah berumur tiga minggu bibit tomat dipindah tanam pada polybag untuk aplikasi di rumah kaca dan dipindah tanam ke lahan untuk aplikasi di lapangan. Polybag yang digunakan berdiameter 20 cm dengan media tanam yang terdiri dari tanah, kompos, dan tanah yang telah terinfestasi bakteri R. solanacearum. Tanah dan kompos dicampur lalu disterilkan. Tanah yang terinfestasi bakteri patogen berasal dari lapangan di sekitar pertanaman tomat yang terserang layu bakteri dan ditambah dengan biakan bakteri patogen yang telah diisolasi dari tanaman tomat yang terserang layu bakteri. Suspensi bakteri patogen yang digunakan sebanyak 600 ml dalam media cair 523. Kemudian suspensi terebut dilarutkan dalam 2 liter air. Media tanam tersebut dimasukkan ke dalam polybag dengan susunan dari bawah yang terdiri dari tanah steril ± 6 cm, tanah terinfestasi bakteri patogen ± 9 cm, lalu ditutup lagi dengan tanah steril ± 10 cm. Isolasi bakteri R. solanacearum Isolasi bakteri patogen dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB. Tanaman sampel diperoleh dari Lembang, Bandung. Tanaman dicuci lalu batangnya dipotong melintang. Potongan batang tersebut dicelupkan ke dalam air steril dalam tabung reaksi. Massa bakteri (oose) yang mirip dengan benang-benang putih halus akan keluar dari potongan batang selama beberapa menit. Batang dibiarkan tercelup beberapa saat sampai air steril menjadi keruh. Massa bakteri (oose) patogen dari hasil isolasi diambil sebanyak 100 µl dengan pipet volumetrik dan disebar pada media TZC, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 24-48 jam. Setelah 24-48 jam akan terlihat koloni bakteri patogen seperti pada Gambar 1. Koloni yang digunakan untuk infestasi tanah adalah yang virulen ditandai dengan bentuk koloni berlendir (fluidal) dan dibagian tengah berwarna merah muda. 14 Gambar 1 Hasil isolasi patogen; R. solanacearum pada media TZC Peremajaan bakteri endofit, PGPR, dan bakteri patogen (R. solanacearum) Bakteri endofit yang digunakan diperoleh dari penelitian sebelumnya yang diisolasi dari batang tanaman tomat sehat yang dipilih diantara tanaman tomat yang terserang parah oleh layu bakteri (Damayanti 2010). Sumber bakteri endofit tersebut diisolasi dari pertanaman tomat di daerah Bogor, Lembang, dan Cipanas. Kode isolat yang digunakan dalam penelitian yaitu BL10, BC4, dan BC10. Bakteri endofit hasil isolasi pada penelian sebelumnya dan bakteri PGPR yang ada di laboratorium disimpan dalam media cair yang mengandung gliserol 20% pada suhu -20 0C. Bakteri endofit dan PGPR diremajakan terlebih dulu pada media nutrient agar dalam cawan petri (Gambar 2). Sebelum digunakan untuk pengujian, bakteri patogen diremajakan pada media King’s B Agar (KBA) dan diinkubasikan selama 24-48 jam pada suhu kamar (Gambar 2). Bakteri patogen diremajakan pada media King’s B untuk dilihat koloni tunggalnya. 15 a b c d e f Gambar 2 Hasil peremajaan bakteri endofit, PGPR, dan R. solanacearum; bakteri endofit Bacillus amyloliquefaciens (BL10) a), bakteri endofit Staphylococcus epidermidis (BC4) b), bakteri endofit isolat BC10 c), bakteri PGPR B. subtilis AB89 (B12) d), bakteri PGPR P. fluorescens RH4003 (P1) e), R. solanacearum pada media King’s B f) Penyiapan suspensi bakteri patogen, endofit, dan PGPR Permukaan media King’s B Agar yang telah ditumbuhi bakteri patogen disiram dengan 6 ml air steril dan digosok menggunakan jarum ose hingga bakteri terlepas dari media dan membentuk suspensi. Suspensi tersebut diambil sebanyak 6 ml menggunakan pipet volumetrik lalu diinokulasikan ke dalam media cair 523 yang ditambah dengan supernatan daun tomat sebanyak 100 µl. Kemudian 16 suspensi tersebut dikocok menggunakan shaker selama 24-48 jam. Supernatan dibuat dengan cara mencampur 0,5 gram daun tomat dengan air steril 10 ml lalu ditumbuk dan diambil ekstraknya sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan ke dalam Eppendorf. Eppendorf yang berisi ekstrak daun tomat disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 25 0C selama lima menit. Suspensi bakteri patogen tersebut disiapkan sebanyak 600 ml. Bakteri endofit dan PGPR yang digunakan diambil dari stok yang disimpan pada suhu -20 0C. Bakteri tersebut didiamkan beberapa saat sampai mencair. Setelah mencair, suspensi bakteri diambil sebanyak 100 µl menggunakan pipet volumetrik dan masing-masing bakteri disebar pada permukaan media nutrient agar dalam cawan petri. Cawan yang telah diinokulasi bakteri endofit dan PGPR kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 24-48 jam. Pada permukaan media yang telah ditumbuhi bakteri endofit dan PGPR selanjutnya disiram dengan 5 ml air steril dan digosok menggunakan jarum ose hingga bakteri terlepas dari media agar dan membentuk suspensi. Selanjutnya suspensi tersebut diambil sebanyak 1 ml menggunakan pipet volumetrik dan diinokulasikan ke dalam media cair nutrient broth 250 ml, lalu dikocok menggunakan shaker selama 24-48 jam. Kerapatan bakteri yang digunakan yaitu 108-109 cfu/ml. Pengujian pengaruh aplikasi bakteri endofit dan PGPR terhadap penyakit layu bakteri pada tomat Percobaan di Rumah Kaca Percobaan di rumah kaca dilakukan pada dua musim yaitu musim kemarau (bulan September-November) dan musim penghujan (bulan Desember-Maret). Bibit tomat yang telah berumur 3 minggu disiram akarnya dengan agens biokontrol sesuai perlakuan. Untuk perlakuan tunggal setiap bibit disiram sebanyak 50 ml agens biokontrol dan untuk perlakuan kombinasi disiram sebanyak 25 ml dari masing-masing agens biokontrol yang dikombinasikan. Sebelumnya, agens biokontrol yang akan digunakan dilarutkan terlebih dulu. Suspensi agens biokontrol dalam 250 ml media cair nutrient broth diambil sebanyak 200 ml lalu dilarutkan dalam 1800 ml air. Sehingga diperkirakan 17 populasi bakteri adalah 108-109 cfu/ml. Untuk pelakuan kontrol, bibit tomat disiram dengan air sebanyak 50 ml tanpa diberi perlakuan agens biokontrol. Perlakuan yang diberikan terdiri dari 12 perlakuan termasuk kontrol dan tiap perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Perlakuan tersebut yaitu: K = perlakuan kontrol diberi patogen tetapi tanpa agens biokontrol P1 = P. fluorescens RH4003 B12 = B. subtilis AB89 BC4 = bakteri endofit isolat BC4 BC10 = bakteri endofit isolat BC10 BL10 = bakteri endofit isolat BL10 P1 + BC4 = P. fluorescens RH4003 + bakteri endofit isolat BC4 P1 + BC10 = P. fluorescens RH4003 + bakteri endofit isolat BC10 P1 + BL10 = P. fluorescens RH4003 + bakteri endofit isolat BL10 B12 + BC4 = B. subtilis AB89 + bakteri endofit isolat BC4 B12 + BC10 = B. subtilis AB89 + bakteri endofit isolat BC10 B12 + BL10 = B. subtilis AB89 + bakteri endofit isolat BL10 Bibit tomat yang telah diberi perlakuan tersebut didiamkan selama satu hari, selanjutnya bibit tomat dipindah tanam pada polybag. Media tanam terdiri dari tanah yang telah mengandung R. solanacearum dari lapangan dan ditambah dengan tanah yang telah terinfestasi patogen R. solanacearum (patogen tersebut dibiakkan dalam media cair 523) serta tanaman tomat yang terserang layu bakteri. Tanaman tomat yang terserang layu bakteri tersebut dipotong-potong dan ditambah air. Potongan tanaman beserta airnya kemudian dicampur dengan tanah yang mengandung R. solanaceaum. Sebanyak 600 ml suspensi biakan bakteri patogen dilarutkan dalam 2 liter air lalu dicampur dengan tanah dari lapangan. Lokasi untuk tiap perlakuan dilakukan secara acak. Setiap unit perlakuan di rumah kaca terdiri dari lima tanaman. Setiap ulangan terdiri dari 12 plot, sehingga dalam satu lahan terdiri 36 plot/ petak. Penyiraman dengan air dalam rangka pemeliharaan dilakukan setiap dua hari sekali. Namun jika tanah masih cukup lembab, maka tanaman tidak disiram. Tanaman tomat dipasang ajir setelah satu minggu dari waktu pindah tanam. 18 Peubah yang diamati yaitu kejadian penyakit, masa inkubasi, bobot kering, dan tinggi tanaman. Pengamatan dilakukan selama 9 minggu dan data diambil setiap dua hari sekali. Kejadian penyakit (Kp) dihitung menggunakan rumus: Selain kejadian penyakit dihitung pula nilai AUHPGC (Area Under Height of Plant Growth Curve) dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalam Cooke 1998) sebagai berikut: y = laju pertambahan tinggi tanaman t = hari Serta dihitung pula nilai AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalam Cooke 1998) sebagai berikut: y = persentase kejadian penyakit t = hari Percobaan di Lapangan Percobaan di lapangan dilakukan pada bulan Juli-Oktober 2010. Bibit tomat yang telah berumur 3 minggu disiram dengan agens biokontrol. Perlakuan yang diberikan sama dengan perlakuan di rumah kaca. Namun jumlah suspensi agens biokontrol yang digunakan yaitu sebanyak 100 ml untuk aplikasi tunggal dan 50 ml dari masing-masing agens biokontrol untuk aplikasi kombinasi. Kontrol disiram dengan 100 ml air. Setelah disiram, bibit akan dipindah tanam di lapangan pada plot percobaan di luar rumah kaca yaitu di Kebun Percobaan, University Farm, IPB. Media tanam di lapangan berbeda dengan media tanam untuk percobaan di rumah kaca. Tanah di lapangan hanya ditambah dengan kompos karena tanah sudah 19 mengandung patogen R. solanacearum. Kondisi lahan di lapangan berlereng antara blok satu dengan blok yang lain. Lahan yang digunakan dipersiapkan dengan membuat bedengan dan dilakukan pemupukan pada setiap lubang tanam. Dalam satu blok terdiri dari 12 bedeng. Dalam satu bedeng/ setiap unit perlakuan ditanam dengan 20 bibit tomat, setiap lubang tanam terdiri dari satu bibit tomat. Jarak tanam yang digunakan yaitu 60 x 75 cm. Setiap ulangan terdiri dari 12 plot, sehingga dalam satu lahan terdiri 36 plot/ petak. Perawatan yang dilakukan di lapangan hanya mencakup penyiangan. Pengamatan di lapangan dilakukan selama 9 minggu dan peubah yang diamati yaitu kejadian penyakit layu bakteri. Pengamatan terhadap kejadian penyakit dilakukan setiap satu minggu sekali. Kejadian penyakit dihitung dengan menggunakan rumus sama seperti di rumah kaca. Serta dilakukan perhitungan terhadap nilai AUDPC menggunakan rumus sama seperti di rumah kaca. Dilakukan pula perhitungan terhadap index penekanan penyakit (keefektifan pengendalian) dengan rumus: DIc = AUDPC pada kontrol DIb = AUDPC pada perlakuan agens biokontrol Untuk mengetahui tingkat sinergisme antara dua agens biokontrol diprediksi menggunakan rumus Abbott’s (Guetsky et al. 2002 dalam Nawangsih 2006), yaitu: E(exp) = a + b ΜΆ a x b/ 100 dan SF (Synergy Factor) = E(obs)/E(exp) a = keefektifan pengendalian oleh agens biokontrol I b = keefektifan pengendalian oleh agens biokontrol II E(exp) = keefektifan pengendalian dugaan oleh campuran agens biokontrol E(obs) = keefektifan pengendalian oleh campuran berdasarkan hasil pengamatan 20 Nilai SF = 1 ; interaksi antar agens biokontrol bersifat additif SF < 1 ; interaksi antar agens biokontrol bersifat antagonis SF > 1 ; interaksi antar agens biokontrol bersifat sinergis Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan kelompok sebagai ulangan. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (anova) dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1 dan dilanjutkan dengan uji Duncan dan Dunnett masing-masing pada taraf 5% untuk pengujian di rumah kaca. Pengujian di lapangan menggunakan uji lanjut Duncan dan Dunnett masing-masing pada taraf 10%.
