fakultas biologi - SILAB - Sistem Informasi Laboratorium UGM
advertisement
FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI POLIMORFISME BERDASARKAN AMPLIFIKASI DNA No. Dokumen Halaman Tgl. Terbit Revisi : IKU/5.4/BI-GT/POL-01 : 1 dari 4 : 28/10/15 :0 METODE UJI POLIMORFISME BERDASARKAN AMPLIFIKASI DNA 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk mengukur persentase polimorfisme berdasarkan metode PCR untuk mengamplifikasi DNA dengan penanda molekular RAPD atau ISSR sehingga diperoleh analisis variasi genetik dari sampel jaringan tumbuhan, jaringan hewan, rambut, sel mukosa mulut dan mikroorganisme. 2. ACUAN NORMATIF Ford-Lioyd, B. 1996. Measuring Genetic Variation Using Molecular Marker. International Plant genetic Resources Institute. Karp, A., S. Kresovich, K. V. Bhat, W. G. Ayad and T. Hodgkin. 1997. Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. International Plant genetic Resources Institute. Sambrook, J., E. F. Fritch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. Volume 1-3. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press., Cold Spring Harbor. Sulandari, S. Dan M. S. A. Zein. 2003. Panduan Praktis Laboratorium DNA. Bodang Zoologi, Pusat Penelitian Biologi-LIPI. Vierling, R. A and H. T. Nguyen. 1992. Use of RAPD markers to determine the genetics diversity of diploid , wheat genotype. Theoretical and Applied Genetics, 84 : 835-838. Waugh, R. and W. Powell. 1992. Using RAPD markers for crop improvement. Trenes in Biotechnology, 10 : 186-191. Yuwono, T. 2006. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta Pengesahan Nama Tanda Tangan Tanggal Dibuat oleh Subakir Diperiksa oleh Ganies Disahkan oleh Niken 26/10/15 27/10/15 28/10/15 Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada. FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI POLIMORFISME BERDASARKAN AMPLIFIKASI DNA No. Dokumen Halaman Tgl. Terbit Revisi : IKU/5.4/BI-GT/POL-01 : 2 dari 4 : 28/10/15 :0 3. ISTILAH DAN DEFINISI Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) adalah salah satu ketegori dari reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer tunggal Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) adalah salah satu ketegori dari reaksi PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer tunggal mikrosatelit, sehingga akan mengamplifikasi daerah di antara mikrosatelit tersebut. 4. CARA UJI 4.1. Prinsip Polimorfisme diketahui berdasarkan pesentase jumlah lokus polimorfik yang dihasilkan dengan jumlah total lokus yang teramplifikasi dikalikan 100%. Persentase polimorfisme di atas 60% menunjukkan variasi genetik tinggi dan jika nilainya di bawah 40% menunjukkan variasi genetik yang rendah. 4.2. Bahan DNA genom yang berasal dari total DNA baik hewan, tumbuhan maupun manusia yang telah dianalisis kualitatif dan kuantitatif, kit PCR, loading dye, marker, gel agarose, TBE, tip pipet kuning dan putih, microtube 1,5 mL, PCR-tube 200 µL, TBE 10X (ROCHE), pewarna (FloroSafe DNA Stain 1 st BASE), kertas parafilm, akuades, akuabides, PCR-grade water, primer RAPD atau ISSR serta Ladder 100bp (Vivantis). 4.3. Peralatan Pipet mikro (SOCCOREX), vorteks, sentrifuse (Gyro Spin GYROZEN), oven/inkubator (memmert), microwave (iwave LG), lemari pendingin, mesin PCR gradien suhu (Thermo Cycler), elektroforator (Mupid-exu ADVANCE). 4.4. Persiapan pengujian Hasil isolasi DNA udang galah yang telah diuji secara kulaitatif maupun kuantitatif kemudian diamplifikasi dengan dua primer ISSR menggunakan kit Pengesahan Nama Tanda Tangan Tanggal Dibuat oleh Subakir Diperiksa oleh Ganies Disahkan oleh Niken 26/10/15 27/10/15 28/10/15 Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada. FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI POLIMORFISME BERDASARKAN AMPLIFIKASI DNA No. Dokumen Halaman Tgl. Terbit Revisi : IKU/5.4/BI-GT/POL-01 : 3 dari 4 : 28/10/15 :0 PCR DreamTaq Green PCR Master Mix (2X). Pemilihan dua primer ISSR berdasarkan pada hasil optimasi yang menunjukkan polimorfisme dan pita hasil amplifikasi yang jelas. Optimasi suhu annealing (penempelan primer) dilakukan untuk memperoleh suhu yang tepat yang dapat menghasilkan pita hasil amplifikasi yang jelas. Suhu annealing yang digunakan dalam optimasi berdasarkan perkiraan melting temperature (TM) masing-masing primer. 4.5. Prosedur pengujian Amplifikasi DNA dilakukan dengan mesin PCR BOECO Thermal Cycler TCPRO. Sebelumnya dilakukan terlebih dahulu pembuatan Premix PCR sesuai dengan komposisi yang tertera pada protocol master mix PCR dengan sedikit modifikasi. Komposisinya dapat meliputi 12.5 µL KAPA Taq Extra HotStart ReadyMix (2x), 200 ng DNA template, 100 pmol primer ISSR, dan ddH2O steril. Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR yang diatur sesuai dengan prosedur pada protocol master mix PCR dengan modifikasi dengan 35x siklus antara lain Predenaturasi 95 ˚C, 3 menit; Denaturasi 95 ˚C, 15 detik; Annealing 45-48 ˚C, 15 detik; Elongation 72 ˚C, 45 detik; Post elongation 72 ˚C, 5 menit; dan Endless 72 ˚C. 4.6. Perhitungan Produk amplifikasi PCR dianalisis menggunakan elektroforesis dengan membuat campuran loading dye dengan DNA ladder di atas parafilm dengan perbandingan 1µL loading dye dan 3 µL DNA ladder menggunakan micropipette 10 µL. Kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumuran gel agarosa 2% yang direndam dalam buffer TBE 0.5x di dalam tangki elektroforator. Gel agarosa hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan ethidium bromide dan diamati dengan UV transiluminator. Ukuran pita DNA dapat ditentukan dengan membandingkan jarak perpindahan pita DNA sampel dengan jarak migrasi DNA ladder.Penentuan ukuran pita-pita Pengesahan Nama Tanda Tangan Tanggal Dibuat oleh Subakir Diperiksa oleh Ganies Disahkan oleh Niken 26/10/15 27/10/15 28/10/15 Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada. FAKULTAS BIOLOGI LABORATORIUM GENETIKA & PEMULIAAN INSTRUKSI KERJA UJI POLIMORFISME BERDASARKAN AMPLIFIKASI DNA No. Dokumen Halaman Tgl. Terbit Revisi : IKU/5.4/BI-GT/POL-01 : 4 dari 4 : 28/10/15 :0 DNA dilakukan dengan cara mengukur jarakmigrasi standar dari sumuran. Ukuran fragmen DNA ladder yangdiketahui kemudian dihitung logaritmanya. Nilai logaritma ini dijadikansebagai sumbu Y dan jarak migrasi standar sebagai sumbu X.Berdasarkan kedua sumbu tersebut, kemudian diperoleh persamaan garislinear Y=aX+b. Ukuran-ukuran pita DNA hasil amplifikasi pada masing-masing sampel dapat diketahui dengan memasukkan nilai terukur dalam persamaan garis tersebut. Nilai Y yang diperoleh dihitung nilai antilognya (10^Y) dan hasil tersebut merupakan ukuran panjang basayang teramplifikasi. 5. PENGENDALIAN MUTU 1. Optimalisasi reksi PCR sangat perlu dilakukan agar supaya pita DNA yang terbentuk mempunya tingkat reproduksibilitas yang tinggi 2. Optimalisasi ini meliputi konsentrasi template DAN, konsentrasi primer, volume template DNA dan primer, suhu annealing dan jenis kit PCR 3. Semakin tinggi indeks similaritas yang terbentuk, menandakan bahwa hubungan kekerabatan fenetik yang terjadi semakin dekat dan sebaliknya, semakin rendah indeks similaritas yang terbentuk semakin rendah hubungan kekerabatan fenetik antar kultivar yang ada. Pengesahan Nama Tanda Tangan Tanggal Dibuat oleh Subakir Diperiksa oleh Ganies Disahkan oleh Niken 26/10/15 27/10/15 28/10/15 Isi Dokumen ini tidak diperkenankan untuk disalin atau digandakan tanpa seijin dari Manajer Puncak Laboratorium Penelitian Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada.
