bab 3 metode - IPB Repository

BAB 3
METODE
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Kegiatan penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan dari bulan Mei
sampai bulan Agustus 2011. Pelaksanaan penelitian ini bertempat di kandang Unit
Rehabilitasi dan Reproduksi (URR), Departemen Klinik, Reproduksi, dan
Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan-Institut Pertanian Bogor. Analisa sampel
darah dilakukan di Laboratorium Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan
Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan-Institut Pertanian Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spuit 10 ml, jarum 18
G, kapas, tabung reaksi, kertas label, pulpen, selotip, ice box, ice pack,
hemositometer, cover glass, pipet pengencer RBC, aspirator, tissue, mikroskop
cahaya, alat penghitung, tabung mikro kapiler, alat sentrifuse, penyumbat mikro
kapiler, International Micro Capillary Reader, spektrofotometer, dan pipet mikro.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya empat ekor kerbau
betina, alkohol, pengencer Hayem, antikoagulan Ethylene Diamine Tetraacetic
Acid (EDTA), dan reagen hemoglobin.
3.3. Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah jenis kerbau
lumpur sebanyak empat ekor. Keempat kerbau tersebut berjenis kelamin betina
berumur antara 2 sampai 2.5 tahun dengan bobot badan berkisar 250 kg sampai
300 kg. Kerbau tersebut berasal dari Kecamatan Tenjolaya, Kabupaten Bogor.
3.4. Tahap Persiapan
Persiapan yang dilakukan sebelum pengambilan sampel darah kerbau
meliputi persiapan kondisi kerbau. Hal yang dilakukan adalah membiarkan kerbau
beradaptasi terlebih dahulu dengan lingkungan (aklimatisasi) di kandang URR
selama 2 minggu. Kerbau tersebut ditempatkan pada kandang individu berukuran
15
2×2.5 meter. Persiapan lain adalah dengan pemberian pakan berupa hijauan pada
pagi dan sore hari. Pada siang hari kerbau sesekali dikeluarkan dari kandang untuk
mencari rumput sendiri dan berkubang di lumpur sekitar URR. Pemberian minum
dilakukan ad libitum. Obat cacing Albendzol dan vitamin B kompleks juga
diberikan sebelum penelitian untuk menjaga kondisi kerbau supaya dapat optimal.
3.5. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel darah dilakukan setiap dua hari sekali selama 10
minggu. Pengambilan darah dilakukan setiap pagi hari melalui Vena jugularis
menggunakan spuit 10 ml dan jarum 18 G. Darah diambil sebanyak kurang lebih
2 ml kemudian langsung dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Tabung yang
digunakan terlebih dahulu diberi label dengan keterangan tanggal pengambilan
dan keterangan kerbau. Tabung tersebut juga telah dilapis antikoagulan EDTA.
Tabung yang telah diisi dengan darah kemudian langsung ditutup menggunakan
sumbat penutup tabung. Proses homogenisasi antara darah dengan antikoagulan
yang ada di dinding tabung segera dilakukan dengan cara membuat gerakan angka
delapan. Sampel darah tersebut kemudian dimasukkan ke dalam ice box yang
didalamnya terdapat ice pack. Sampel darah kemudian dibawa ke laboratorium
fisiologi untuk dilakukan pemeriksaan darah.
3.6. Pemeriksaan Sel Darah Merah, Hemoglobin, dan Hematokrit
Pemeriksan darah yang digunakan sebagai variabel dalam penelitian ini
adalah jumlah sel darah merah, kadar hemoglobin, dan nilai hematokrit.
Perhitungan jumlah sel darah merah dilakukan secara manual dengan
menggunakan hemositometer. Darah diambil dengan menggunakan pipet
pengencer RBC yang bersih dan telah disambungkan dengan aspirator sampai
batas tera 0,5. Setelah itu, ujung pipet pengencer RBC dicelupkan ke dalam
larutan pengencer hayem dan larutan hayem diambil sampai batas tera 101.
Aspirator kemudian dilepas dari pipet pengencer RBC dan pangkal pipet ditutup
dengan ibu jari dan bagian ujungnya ditutup dengan jari tengah. Antara darah dan
larutan pengencer hayem dihomogenkan dengan melakukan gerakan angka
delapan mendatar. Setelah larutan homogen, cairan tersebut dibuang 3 sampai 5
16
tetes untuk mendapatkan bagian yang benar-benar homogen. Hasil pengenceran
kemudian diisikan ke dalam kamar hitung yang telah ditutupi cover glass dengan
cara menyentuhkan ujung pipet pengencer pada permukaan kamar hitung. Kamar
hitung kemudian didiamkan beberapa menit agar darah mengendap sempurna.
Kamar hitung yang telah terisi dilihat dengan mikroskop mula-mula dengan
perbesaran 10×10 kali untuk melihat apakah penyebaran darah telah merata.
Setelah penyebaran darah merata, perhitungan jumlah sel darah merah dapat
dilakukan dengan menghitung jumlah butir darah merah di dalam lima kotak yang
terletak di daerah sentral yaitu pada pojok kanan atas dan bawah, pokok kiri atas
dan bawah, serta satu kotak yang tepat berada di tengah dengan menggunakan
perbesaran 10×40 kali. Hasil perhitungan akhir yaitu Jumlah sel darah merah dari
perhitungan lima kotak tersebut dikalikan dengan 10.000 per mm3 (Theml et al.
2004). Kotak untuk menghitung jumlah sel darah merah pada kamar hitung
hemositometer dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3 Hemositometer Neubauer
Ket: Kotak eritrosit (lima kotak tengah; 1, 2, 3, 4, 5), Kotak leukosit
(empat kotak pinggir; A, B, C, D) (Haen 1995).
Pengukuran
spektrofotometer
kadar
(Theml et
hemoglobin
al.
2004).
dilakukan
Metode
menggunakan
alat
ini dilakukan dengan
menambahkan reagen untuk mengukur hemoglobin sebanyak 2,5 ml ke dalam
tabung kemudian ditambahkan sampel darah yang akan dianalisis sebanyak 10 µℓ.
Campuran larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex sampai
tercampur rata. Setelah itu dibaca kadar hemoglobinnya menggunakan alat
17
spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Perhitungan Kadar
Hemoglobin (gr%)= Absorban x 36,8 gr Hb/100ml.
Pembacaan
nilai
hematokrit
atau
PCV
dilakukan
menggunakan
International Micro Capillary Reader. Tabung mikro kapiler yang digunakan
adalah tabung mikro dengan panjang 7 cm dan diameter 0,1 mm. Darah
dimasukkan dalam tabung mikro kapiler dengan cara menempelkan bagian
ujungnya pada sampel darah dengan posisi mendatar atau sedikit ke bawah.
Bagian tabung mikro kapiler diisi darah hingga 70 sampai 90% dari panjang
tabung mikro kapiler. Tabung mikro kapiler kemudian dipegang secara horizontal
untuk mencegah darah menetes keluar. Setelah itu, bagian ujung tabung mikro
kapiler disumbat dengan penyumbat agar darah tidak keluar. Tabung mikro
kapiler kemudian disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm
dengan bagian yang tak tersumbat mengarah ke pusat sentrifuse. Hasil sentrifugasi
akan terlihat tiga lapisan yang terbentuk yaitu sel darah merah dibagian dasar
yang memadat, lapisan tipis seperti pita putih yang merupakan buffycoat yang
tersusun atas leukosit dan trombosit, dan lapisan paling atas berwarna bening
merupakan plasma yang terpisah dari benda-benda darah. Tabung mikro kapiler
yang telah disentrifugasi kemudian dibaca dengan menggunakan alat international
micro capillary reader (Theml et al. 2004).
3.7. Perhitungan Indeks Eritrosit
Kerr (2002) menunjukkan perhitungan Indeks eritrosit MCV, MCH, dan
MCHC dengan menggunkan persamaan berikut:
PCV

MCV (fl) = ∑RBC

MCH (pg) = ∑RBC

MCHC (gr/dl) = PCV 100
(juta )
10
Hb
(juta )
10
Hb
3.8. Metode Analisis Data
Data yang telah diperoleh dicari rataan dan simpangan bakunya kemudian
dianalisis secara deskriptif.