Deteksi Helicobacter pylori pada Anak Menggunakan

HASIL PENELITIAN
Deteksi Helicobacter pylori pada Anak Menggunakan
Teknik PCR dan Kultur Feses
Wayan Sulaksmana*, Sukardi*, Abdul Razak*, Zainul Mutaqqin**
*Sub Divisi Gastro-Hepatologi SMF Anak, Fakultas Kedokteran Universitas Mataram/RSUP Nusa Tenggara Barat
**Unit Riset Biomedik RSUP Nusa Tenggara Barat, Undonesia
ABSTRAK
Latar belakang: Manifestasi klinis infeksi H. pylori pada anak tidak spesifik. Diagnosis ditegakkan berdasarkan gejala klinis dan pemeriksaan
endoskopik. Pada anak pemeriksaan endoskopi memerlukan ketrampilan khusus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan H.
pylori berdasarkan kultur dan pemeriksaan PCR (polymerase chain reaction) primer glmM (UreC) pada feses anak yang dirawat di RSUP MataramNTB dengan diagnosis awal diare. Hasil: Dari November 2011-April 2012 diperoleh 35 spesimen feses anak diare yang memenuhi syarat. H.pylori
positif pada 9 pasien (25,71%), 3 (16,6%) berusia 0-1 tahun. Kultur feses positif pada 3 (8.57%) kasus. Simpulan: H. pylori dapat dideteksi dengan
metode kultur bakteriologi dan PCR. Diperlukan penelitian lanjutan dengan sampel lebih besar pada populasi anak normal atau dengan gejala
gastrointestinal.
Kata kunci: Helicobacter pylori, kultur feses, PCR
ABSTRACT
Background: Clinical manifestations of Helicobacter pylori (H. pylori) infection in children are not specific, and diagnosis through endoscopic
examination in children needs special skills. This study aims to determine H. pylori by culture and PCR primers glmM (UreC) in the feces of
children diagnosed as diarrhea treated at the Department of Pediatrics, Mataram University, West Nusa Tenggara. Result: From November 2011April 2012, 35 specimens have been obtained, Nine was positive for H. pylori (25.71%) 3 were from patients aged 0-1 years (16.6%). H. pylori was
positive in 3 (8.57%) stool culture and PCR was positive in 9 (25.71%) patients. Conclusion: H. pylori infection can be detected by bacteriological
culture and PCR. Detection of Helicobacter pylori in Children Using PCR Technique and Stool Cultures. Wayan Sulaksmana, Sukardi,
Abdul Razak, Zainul Mutaqqin.
Key words: Helicobacter pylori, feces culture, PCR
LATAR BELAKANG
Helicobacter pylori adalah kuman gram positif
berbentuk spiral atau batang bengkok yang
hidup di mukosa lambung manusia. Kuman
ini diketahui sebagai penyebab utama
penyakit gastroduodenal seperti gastritis
kronis, ulkus lambung, ulkus duodenum, dan
karsinoma lambung di kemudian hari. 2 Infeksi
Helicobacter pylori merupakan infeksi yang
umum terjadi di seluruh dunia. Prevalensi
H. pylori di negara berkembang dilaporkan
lebih tinggi dibandingkan di negara maju dan
sudah dimulai pada anak-anak dan bahkan
pada bayi usia 6 bulan. Diperkirakan 80% anak
di bawah usia 10 tahun di negara berkembang
terinfeksi H. pylori.1
Penelitian hubungan manifestasi klinis dan
infeksi H. pylori pada anak belum sebanyak
yang dilakukan pada orang dewasa. Beberapa
Alamat korespondensi
data menunjukkan bahwa infeksi H. pylori
pada anak sebagian besar asimtomatis atau
menunjukkan gejala gastrointestinal tidak
spesifik; beberapa peneliti menghubungkan
infeksi H. pylori dengan gejala klinis sakit
berulang. Gejala klinis yang dianggap sebagai
alarm infeksi H. pylori pada anak adalah
malabsorpsi dengan penurunan berat badan,
gangguan pertumbuhan, anemia defisiensi
besi, diare berulang, dan malnutrisi.3
Sebagaimana penyakit infeksi bakteri pada
umumnya, diagnosis keberadaan kuman H.
pylori penting untuk pengobatan. Beberapa
jenis pemeriksaan telah dikembangkan
untuk maksud tersebut, antara lain kultur
biopsi lambung, rapid urease test, tes
immunoserologi (deteksi antibodi dan
antigen).4 Akhir-akhir ini sejalan dengan
perkembangan biologi molekuler, terdapat
pemeriksaan PCR (Polymerase Chain Reaction)
yang bisa dilakukan baik pada spesimen
biopsi lambung, saliva, dental plaque, maupun
feces.5,9,14
Keberadaan H. pylori pada lambung anak
telah lama diketahui dan dikaitkan dengan
timbulnya gastritis antrum maupun ulkus
duodenum.6,10-1 Namun, karena tindakan
endoskopi pada anak sangat jarang dan tidak
mudah dilakukan, diperlukan cara diagnosis
lain yang bersifat non-invasif. Keberadaan
H. pylori pada feces telah lama dilaporkan
namun sampai sekarang masih merupakan
kontroversi berkaitan dengan viabilitasnya.
Sementara itu deteksi serologi pada pasien
anak di RSUP NTB diperoleh hasil 20-49%
positif antibodi terhadap H. pylori.7,8,12
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
email: [email protected]
CDK-212/ vol. 41 no. 1, th. 2014
37
HASIL PENELITIAN
keberadaan H. pylori berdasarkan kultur dan
PCR feces pada pasien anak dengan diagnosis
awal diare. Penelitian ini belum pernah
dilakukan di Indonesia, oleh karena itu sangat
penting dilakukan guna menentukan teknik
diagnostik yang tepat terhadap infeksi H.
pylori pada anak.
BAHAN DAN CARA
Pengumpulan spesimen feses
Spesimen berupa feses diperoleh dari pasien
anak dengan diagnosis diare yang dirawat di
ruang Dahlia RSU Provinsi Nusa Tenggara Barat.
Spesimen diambil dengan menggunakan
kontainer plastik yang dilengkapi dengan stik
pengambil feses dengan volume minimal 5
ml.
Kultur Bakteriologik
Karena feses mengandung empedu yang
dapat mematikan H. pylori, maka perlakuan
awal sebelum penanaman menjadi sangat
penting. Pada penelitian ini digunakan teknik
sentrifugal untuk memisahkan H. pylori dari
komponen feses.8
DNA akhirnya tertampung dalam recovery
tube dan siap digunakan sebagai template
pada proses PCR.
Amplifikasi DNA
Untuk mendeteksi DNA dan gen glmM (dulu
disebut UreC) dengan cagA digunakan
sepasang primer dengan urutan basa sebagai
berikut 9:
glmM1 5’AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3’
glmM2 5’-AAGCTTACTTTCTAACACTAACGC-3’
menggunakan
(Biorad, USA).
GelDoc
Imaging
System
HASIL
Selama periode bulan November 2011 hingga
akhir April 2012 diperoleh 35 spesimen
feses yang memenuhi syarat penelitian ini.
Prevalensi H.pylori berdasarkan distribusi
umur ditampilkan pada tabel 1, sedangkan
persentase H.pylori pada feses berdasarkan
kultur dan PCR dapat dilihat pada tabel 2.
Tabel 1 Prevalensi H. pylori berdasarkan ditribusi umur
Urutan primer tersebut diambil dari Lu et
al (1999) dengan ukuran panjang produk
amplifikasi sekitar 294bp. PCR dilakukan
dengan menggunakan kit reagen FastStartPCR
Master (Roche 04710436001) dalam volume
reaksi 50uL yang terdiri atas buffer PCR,MgCl2
25mM, dNTP mix, primer 2,5 pmol, TaqPol
0,25U dan 5 uL DNA template. Proses
amplifikasi dilakukan dalam mesin iCycler
(Biorad,USA) dengan kondisi denaturasi 94oC
selama 3 menit masing-masing sebanyak
35 siklus. Produk PCR kemudian dianalisa
Kelompok Umur
Hp+
Hp-
0-12
3 (16,66%)
15 (83,33%) 18
Total
13-24
4 (33,33%)
8 (66,66%)
>24
2 (40%)
3 (60%)
5
Total
9
12
35
12
Tabel 2 Persentase H. pylori pada feses berdasarkan kultur
dan PCR
Metode
Jumlah
Persentase
Kultur (+)
3/35
8,57%
PCR (+)
9/35
25, 71%
Kultur H. pylori menggunakan media Trypticase
Soy Agar yang ditambahi darah 10%, suplemen
Dent dan Skirrow 2 mL/500mL media dan
suplemen isovitalex atau vitox 10ml/500ml.
Inkubasi dilakukan dalam inkubator CO2 yang
memberikan suasana mikroaerofilik dengan
konsentrasi O2 5%, CO2 10%, dan N2 85% selama
2 x 24 jam suhu 37oC. Koloni yang diduga H.
pylori selanjutnya diperiksa secara mikroskopik
dengan pengecatan Gram, uji biokimiawi dan
dikonfirmasi menggunakan pemeriksaan PCR
untuk gen spesifik H. pylori.13
Ekstraksi DNA
DNA diekstrak dari feses menggunakan
reagen High Pure PCR Template Preparation
Kit (Roche, #11796828001). Mula-mula bahan
feses diambil menggunakan lidi kapas atau
cotton bud dan dilarutkan dalam 200uL
buffer lisis dan 25 uL proteinase K. Kemudian
divortex dan diinkubasi pada 56oC selama 15
menit. Setelah ditambahi 250uL alkohol dan
diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar,
larutan dipindah ke spin column, diputar
6800g selama 1 menit. Collection tube pada
spin column diganti baru sambil ditambahkan
wash buffer dan diputar 6800g selama 1
menit. Setelah collection tube diganti dengan
recovery tube, dimasukkan 50uL akuades dan
selanjutnya diputar 12000g selama 1 menit.
38
Gambar 1 Morfologi H. pylori yang diisolasi dari feces diamati menggunakan pewarnaan Gram (1000x)
Gambar 2 Pita DNA hasil amplifikasi gen glmM H. pylori pada spesimen feses
CDK-212/ vol. 41 no. 1, th. 2014
HASIL PENELITIAN
PEMBAHASAN
Gejala klinis infeksi H. pylori pada populasi
anak masih belum diketahui pasti, termasuk
hubungan antara nyeri perut berulang
dengan adanya infeksi H. pylori. Sebuah studi
menunjukkan bahwa 85% anak-anak terinfeksi
H. pylori mempunyai kelainan gambaran
histologik, walau tidak tampak ulkus atau
nodul15. Studi epidemiologik menunjukkan
di negara berkembang kebanyakan anakanak sejak awal telah menderita infeksi akut
H. pylori. Pada penelitian ini ditemukan infeksi
H. pylori positif pada 9(25,71%) anak, 3(16,,6%)
pada anak usia 0 – 1 tahun.
Kultur H. pylori pada feses anak dan pasien
diare dewasa di Gambia, Afrika,13 menunjukkan
bahwa fisiologi saluran cerna pada masa
awal pertumbuhan sangat mendukung
proses penularan fekal-oral. Ukuran saluran
cerna yang relatif pendek dan adanya infeksi
akut yang menyebabkan hypochlorhydria,
memungkinkan terbawanya H. pylori melewati
usus besar yang selanjutnya diekskresikan
bersama feses.
Pada penelitian ini, dari 35 spesimen feses yang
diperiksa, sebanyak 3 spesimen atau 8,57%
kultur H. pylori positif dan 9 spesimen (25,71%)
PCR H. pylori positif. Hal ini menunjukkan bahwa
pemeriksaan laboratorium infeksi H. pylori dapat
dari specimen feses, meski kaitannya dengan
patogenesis diare belum diketahui. Hasil
tersebut juga sesuai dengan teori mengenai
rute penularan H. pylori secara fekal-anal.
SIMPULAN
Infeksi Helicobacter pylori merupakan salah
satu penyakit infeksi yang banyak dilaporkan
di dunia, bahkan sudah dimulai pada usia
muda. Keberadaan H. pylori pada feses dapat
dideteksi dengan metode kultur bakteriologi
dan PCR.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Subagyo B. Diagnosis Dan Tatalaksana Helicobacter pylori pada Anak. Dalam: Naskah Lengkap KONAS III Badan Kordinasi Gatroenterologi Anak Indonesia(BKGAI): 6-8 Desember, 2007:
Surabaya; 2007.h.7-14.
2.
Megraud F. Epidemiology of Helicobacter pylori infection. In: Rathbone BJ, Heatley RV, eds. Helicobacter pylori and gastrointestinal disease. Oxford: Blackwell Scientific; 1992. pp. 107–23.
3.
Hegar B. Infeksi Helicobacter pylori pada anak, J. Sari pediatric 2000;2(2):82-8.
4.
Lage AP, E Godfroid, A Fauconnier, et al,. Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR: comparison with other invasive techniques and detection of cagA gene in gastric biopsy
specimens. J Clin Microbiol. 1995 ; 33: 2752-6.
5.
Dore MP, Osato MS, Malaty HM, Graham DY. Characterization of a culture method to recover Helicobacter pylori from the feces of infected patients. Helicobacter. 2000 Sep;5(3):165-8.
6.
Hill R, Pearman J, Worthy P, Caruso V, Goodwin S, Blincow E. Campylobacter pyloridis and gastritis in children. Lancet. 1986;1:387. [PubMed]
7.
Sumarsidi D, Gunawan S, Sumoharjo S, Muttaqin Z. et al Helicobacter pylori infection among kindergarten children in Mataram J. Gastroenterol. Hepatol., 2000;15(12): H1-H2(1).
8.
Thomas J. Culture Helicobacter pylori from faeces, In Lee A, Megraud F. eds.: Helicobacter pylori: techniques for clinical diagnosis and basic research, Tokyo: WB. Saunders, 1996 pp. 20611.
9.
Lu JJ, Perng CL, Shyu RY et al Comparison of five methods for detection of Helicobacter pylori DNA in gastric tissue. J. Clin. Microbiol. 1999: 772-4.
10. Cadranel S, Goossens H, De Boeck M, Malengreau A, Rodesch P, Butzler JP. Campylobacter pyloridis in children. Lancet. 1986;1:735–6. [PubMed]
11. Drumm B, Sherman P, Cutz E, Karmail M. Association of Campylobacter pylori on the gastric mucosa with antral gastritis in children. N Engl J Med. 1987;316:1557–61. [PubMed]
12. Weaver LT, Shepherd AJ, Doherty CP. Helicobacter pylori in the faeces? An Internat. J.Med. 92 (7): 361-364.
13. Thomas JE, Gibson G, Darboe M, Dale A, Weaver LT. Isolation of Helicobacter pylori from human faeces. Lancet 1992; 340:1094–5.
14. Kabir, S. Detection of Helicobacter pylori in feces by Culture, PCR and Enzyme Immunoassay. J. Clin. Microbiol. 2001;50:1021-9.
15. Hegar B, Muzalkadin Helicobacter pylori infectionin Children with Recurrent Abdominal Pain. Indon. J. Gastroenterol., Hepatol. and Digestive Endoscopy 2001;2(2):1-4.
CDK-212/ vol. 41 no. 1, th. 2014
39