Bab III Metodologi Penelitian Metode, bahan dan alat yang

Bab III
Metodologi Penelitian
Metode, bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini akan dipaparkan
pada bab ini.
III.1 Rancangan Penelitian
Secara garis besar tahapan penelitian dijelaskan pada diagram dibawah ini.
Isolat MDR TB rpoB termutasi, katG315
tidak termutasi
- Amplifikasi gen katG menggunakan metode PCR
- Elektroforesis gel agarosa
- Sequencing
- Analisis in silico
Fragmen gen katG
terjadi mutasi selain S315T ?
Ya, Terjadi perubahan asam amino atau
tidak? terjadi perubahan struktur protein
KatG?
Tidak
Mutasi di luar area penelitian
Gambar III.1 Diagram alur penelitian. Terlihat pada diagram di atas tahapan
penelitian meliputi: amplifikasi DNA menggunakan metode PCR, elektroforesis
gel agarosa, sequencing, dan analisis in silico.
III.2 Peralatan dan Bahan
Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan dan
bahan yang lazim digunakan dalam penelitian biokimia dan rekayasa genetika.
III.2.1. Peralatan
Peralatan gelas yang digunakan meliputi gelas kimia, gelas ukur, labu takar, labu
erlenmeyer, cawan petri, dan botol reagen. Peralatan non gelas yang digunakan
meliputi mikropipet Eppendorf dengan tip pipet mikro ukuran 2,5 µL, 10 µL, 100
µL dan 1000 µL. Tabung mikro (Eppendorf, Jerman) ukuran 500 µL dan 1500
µL. Selain itu digunakan juga alat-alat lain seperti gunting, alumunium foil, dan
parafilm.
Alat pengukur massa digunakan neraca analitis digital Explorer (Ohaus, AS).
Sterilisasi alat menggunakan Autoclave Electric Pressure Steam Sterilized model
No.25 (All American, AS). Penyimpanan bahan-bahan PCR menggunakan deep
freezer Caravell dengan suhu tetap yaitu -20oC. Proses PCR menggunakan alat
PCR merek Gene Amp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). Analisis hasil
PCR
dengan
cara
elektroforesis
gel
agarosa
menggunakan
perangkat
elektroforesis Mini Dubcell GT BASe DNA Biorad (Biorad, AS) dan untuk
visualisasi hasil elektroforesis digunakan lampu UV dengan panjang gelombang
312 nm. Gel elektroforesis difoto dengan kamera digital Canon Power Shoot
A400.
III.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sampel penelitian, yaitu
isolat L5 MDR-TB yang telah diisolasi pada penelitian sebelumnya, M.
tuberculosis H37Rv (ATCC25618). Bahan untuk membuat master mix yaitu
komponen-komponen stok pereaksi PCR dengan merk MDBio. Inc. meliputi 5
µL-1 enzim Taq DNA Polimerase, dNTP 10 mM, primer KF (katG forward) dan
primer KR (katG reverse) masing-masing 30 pmol µL-1, buffer Taq DNA
polymerase 10x, MgCl2 25 mM dan ddH2O steril.
Analisis hasil PCR menggunakan gel agarosa 1,5% (b/v), 0,5 µg mL-1 EtBr,
buffer elektroforesis (running buffer) TAE 1x (40 mM tris asetat dan 1 mM
EDTA pH 8,0 (Merck), dan loading buffer (sukrosa 50%, Merck), 0,1 M EDTA
dan 0,1% bromfenol biru pH 8,0 (Pharmacia). Sebagai penanda (marker) dalam
gel elektroforesis digunakan plasmid pUC19/HinfI 60 ng µL-1. Penanda ini akan
menghasilkan lima pita dalam gel elektroforesis yang masing-masing berukuran
1419 pb, 517 pb, 397 pb, 214 pb, dan 75 pb.
III.3 Metode Penelitian
Metode yang dipakai dalam penelitian ini meliputi pemilihan sampel, amplifikasi
DNA, elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida, dan analisis in
silico.
III.3.1 Pemilihan Sampel
Isolat yang digunakan berasal dari kelompok penelitian M.Tuberculosis KK
Biokimia ITB yang didapatkan dari spesimen klinis berupa dahak atau cairan
paru-paru penderita TB pada laboratorim BPLK, Departemen Kesehatan dan
Rumah Sakit Rontisulu, Bandung.
Berdasarkan data karakteristik isolat yang didapatkan dari hasil PCR Multiplek
pada penelitian sebelumnya, 42 isolat MDR TB yang telah diisolasi dapat
dikelompokkan menjadi empat kelompok, yaitu: isolat yang mengalami mutasi
G944C baik pada gen katG yang mengode enzim KatG dan mengalami mutasi
pada posisi 1578-1580 dan 1593-1595 atau salah satunya pada gen rpoB pengode
RNA polimerase sub unit β, isolat yang termutasi pada gen katG G944C tetapi
tidak termutasi pada gen rpoB, isolat yang termutasi pada gen rpoB tetapi tidak
termutasi pada gen katG dan isolat yang tidak termutasi baik pada gen katG atau
gen rpoB.
Pada penelitian ini digunakan isolat yang termutasi gen rpoB pada posisi 15931595 atau mengalami mutasi pada kodon 531 sub unit β RNA polimerase tetapi
tidak mengalami mutasi G944C gen katG atau Ser315Thr pada enzim KatG.
Adapun isolat yang digunakan adalah isolat L5 yang mengalami Ser531Leu pada
sub unit β RNA polimerase dan M. tuberculosis H37Rv sebagai kontrol wild type.
Setelah itu dilakukan amplifiksi gen katG kontrol wild type dan isolat tersebut.
III.3.2 Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA untuk perbanyakan gen katG dilakukan dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan adalah primer KF dan
KR, kedua primer ini mengamplifikasi mulai urutan basa 738 sampai 1172 dan
kedua primer ini juga mengamplifikasi daerah sebelum dan sesudah kodon 315.
Fragmen DNA yang dihasilkan dari amplifikasi kedua primer berukuran 0,43 kb
(Mokrousov et al., 2003; Mokrousov et al., 2002a). Adapun sekuen primer yang
digunakan adalah:
Tabel III.1 DNA primer yang digunakan dalam penelitian
Primer
Urutan nukleotida
KF
5’-GCA GAT GGG GCT GAT CTA CG-3’
KR
5’-AAC GGG TCC GGG ATG GTG-3’
Sumber: Mokrousov et al., 2003; Mokrousov et al., 2002a
Tahap persiapan amplifikasi dilakukan dengan membuat master mix dalam tabung
eppendorf 1500 µL dengan campuran yang terdiri dari buffer PCR 10x, MgCl2 3
mM, primer KF 30 pmol, primer KR 30 pmol, dNTP 10 mM yang terdiri dari
dATP, dGTP, dCTP dan dTTP serta Taq DNA Polymerase 5 u/µL yang
ditambahkan terakhir kali. Perbanyakan dilakukan dengan menambahkan 5 µL
template DNA sampel kedalam 20 µL campuran master mix dalam satu tabung
PCR. Kontrol positif dibuat dengan komposisi reaksi yang sama tetapi template
yang digunakan adalah M. tuberculosis H37Rv. Digunakan juga kontrol negatif
dengan campuran reaksi yang sama tetapi template diganti dengan ddH2O steril.
Proses PCR dilakukan dengan tahapan sebagai berikut, tahap denaturasi awal
pada 96oC selama 3 menit, kemudian 30 siklus PCR dengan masing-masing
siklus terdiri dari denaturasi pada 94oC selama 1 menit, penempelan primer
(annealing) pada 50oC selama 40 detik, dan perpanjangan rantai pada 72oC
selama 30 detik dan pemantapan pada 72oC selama 3 menit (Noviana, H, 2007).
Hasil PCR disimpan pada suhu -20oC.
III.3.3 Analisis hasil PCR
Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dibuat dengan
melarutkan 0,6 gr agarosa dalam 40 mL buffer TAE 1x kemudian dipanaskan
hingga agarosa larut. Larutan didinginkan hingga kira-kira mencapai suhu 60oC
dan ditambahkan 2,0 µL EtBr 10 mg mL-1. Campuran kemudian dituang ke dalam
cetakan elektroforesis berukuran 6x10 cm yang sebelumnya telah dipasang sisir
pembentuk sumur dan didiamkan hingga membentuk gel padat.
Hasil PCR diambil sebanyak 5 µL dan dicampur dengan 2 µL loading buffer
kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebagai penanda (marker) DNA
digunakan pUC19/HinfI 60 ng/µL sebanyak 5 µL dicampur dengan 2 µL loading
buffer. Alat elektroforesis dihubungkan dengan sumber arus listrik dan diatur pada
tegangan 80 Volt selama 30 menit menggunakan buffer TAE 1x sebagai running
buffer. Pita DNA dianalisis dengan melihat gel elektroforesis di atas sinar UV
pada panjang gelombang 312 nm dan difoto dengan kamera digital. Untuk
mengetahui ukuran fragmen DNA yang dihasilkan maka pita hasil PCR
dibandingkan dengan pita penanda (marker).
Untuk memperbanyak hasil PCR dilakukan dengan cara melakukan PCR untuk
sampel yang sama berulang-ulang. PCR dilakukan hingga sampel berjumlah 600800 ng atau lebih, dengan konsentrasi 15 ng/µL yang merupakan jumlah minimal
untuk melakukan 1 kali reaksi sequencing.
III.3.4 Penentuan urutan nukleotida
Untuk keperluan urutan nukleotida, sampel hasil PCR dikumpulkan hingga
berjumlah antara 600-800 ng. Selain itu, disiapkan juga primer KF dengan
konsentrasi 10 pmol/3 µL dalam tabung mikro lalu dibungkus dengan parafilm.
Untuk satu kali reaksi sequencing dibutuhkan 2,5 µL primer dengan konsentrasi
10 pmol/3 µL.
Peentuan urutan nukleotida (sequencing) dilakukan oleh Macrogen Inc. dengan
menggunakan metode Dideoksi Sanger dan mengikuti prosedur BigDye TM
Terminator. Urutan nukleotida dibaca secara otomatis menggunakan alat
Automatic Sequencer 3730xl.
III.3.5 Analisis in silico
Analisis in silico meliputi analisis hasil sequencing dan pemodelan struktur enzim
KatG M. tuberculosis menggunakan program PYMOL. Analisis hasil sequencing
dilakukan dengan cara membandingkan urutan nukleotida sampel terhadap urutan
nukleotida M. tuberculosis galur murni H37Rv menggunakan program
SeqmanTM versi 4.0.0 dan Meg align versi 4.00 dari DNA*STAR untuk
mengetahui adanya mutasi pada fragmen hasil amplifikasi.
Pemodelan struktur enzim KatG dimulai dengan pengambilan struktur enzim
KatG M. tuberculosis yang terdpat di www.pdb.org dengan kode ISJ2, file
struktur enzim tersebut berbentuk PDB. Setelah itu file dibuka pada program
PYMOL untuk mengetahui residu asam amino yang mengalami mutasi.