BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari

advertisement
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove
Bakteri selulolitik diisolasi dari tanah rhizosfer yang merupakan lapisan
tanah tempat perakaran tanaman yang sangat kaya akan nutrisi baik berasal dari
eksudat akar maupun dari aktivitas organisme dalam tanah (Rao, 1994). Sampel
tanah yang di ambil berasal dari 4 rhizosfer tanaman yang berbeda yaitu pada
tanah rhizosfer Avicennia germinans, Avicennia officinalis, Excoecaria agallocha
dan Hibiscus tilliaceus. Dari hasil isolasi ditemukan koloni bakteri yang diduga
merupakan bakteri selulolitik pada ulangan pertama sebanyak 16 isolat,
sedangkan pada ulangan kedua ditemukan sebanyak 11 isolat, dan pada ulangan
ketiga ditemukan sebanyak 16 isolat. Sehingga dari hasil isolasi pada ulangan
pertama, kedua, dan ketiga didapatkan sebanyak 43 isolat bakteri yang diduga
merupakan bakteri pendegradasi selulosa.
Pada ulangan pertama koloni bakteri tersebut banyak ditemukan pada
tanah rhizosfer A. officinalis, yaitu sebanyak 8 isolat. Namun pada ulangan kedua
hanya ditemukan 3 isolat.Pada ulangan kedua, pada tanah rhizosfer A. germinans,
ditemukan koloni bakteri terbanyak dibandingkan pada ulangan pertama dan
ketiga yaitu sebanyak 5 isolat. Sedangkan pada ulangan ketiga ditemukan
sebanyak 5 isolat yang jumlahnya lebih banyak dibandingkan dengan isolat yang
ditemukan pada ulangan pertama dan kedua. Untuk hasil lebih rinci dapat dilihat
pada tabel 4.1.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Tabel 4.1Hasil Isolasi Bakteri Selulolitik pada Tanah Mangrove
LOKASI
1. Tanah
Rhizosfer
Avicennia
germinans
2. Tanah
Rhizofer
Avicennia
officinalis
3. Tanah
Rhizosfer
Excoecaria
agallocha
4. Tanah
Rhizosfer
Hibiscus
tilliaceus
Jumlah
Kode Isolat Bakteri yang Ditemukan pada Ulangan KeI
II
III
IIS1C1
IIIS1C1
IIS1C2
IS1C1
IIIS1C2
IIS1C3
IS1C2
IIIS1C3
IIS1C4
IIIS1C4
IIS1C5
IS2C1
IS2C2
IS2C3
IIS2C1
IIIS2C1
IS2C4
IIS2C2
IIIS2C2
IS2C5
IIS2C3
IIIS2C3
IS2C6
IS2C7
IS2C8
IS3C1
IIIS3C1
IS3C2
IIS3C1
IIIS3C2
IS3C3
IIS3C2
IIIS3C3
IS3C4
IIIS3C4
IIIS4C1
IIIS4C2
IS4C1
IIS4C1
IIIS4C3
IS4C2
IIIS4C4
IIIS4C5
16
11
16
Keterangan : IS1C1 Angka I menunjukkan ulangan kesatu, S1 menunjukkan
sampel tanah kesatu dan C1 menunjukkan isolat pertama pada media CMC
Pengamatan pertumbuhan bakteri selulolitik dari tanah perakaran
mangrove dilakukan pada saat hari ke-5 setelah isolasi. Dari hasil isolasi
didapatkan isolat bakteri yang kemudian dipindahkan ke dalam media NA untuk
stok kultur. Koloni yang ditemukan pada media CMC agar cawan pada tiga kali
pengulangan sebagian besar sama yaitu didominasi oleh koloni putih susu,
kuning, berpendar biru dan transparan. Semua isolat tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam media NA.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Setelah dilakukan pemurnian dengan memindahkan isolat pada media
NA miringkemudian dilakukan uji screening dengan menanam kembali isolat
bakteri tersebut kedalam media CMC agar dan ditumbuhkan selama 5 hari.
Menurut Wenzel (2002), aktivitas bakteri dalam mendegradasi selulosa dapat
diamati setelah pertumbuhan selama 96-120 jam atau selama 5 hari. Setelah
inkubasi selama 5 hari, maka dilakukan uji potensi dalam mendegradasi selulosa
yang ada pada media CMC agar yang kemudian ditetesi oleh pewarna Congo red
sehingga terlihat adanya zona bening disekitar koloni bakteri selulolitik.
Pada hasil uji screening ternyata tidak semua isolat yang diduga
merupakan bakteri selulolitik, dapat mendegradasi selulosa. Dari 43 isolat yang
ditemukan, hanya 19 isolat yang terbukti mampu mendegradasi selulosa yaitu
pada ulangan pertama sebanyak 13 isolat, pada ulangan kedua dan ketiga masingmasing 3 isolat yang menunjukkan hasil positif dengan adanya zona bening (clear
zone) saat setelah ditetesi oleh Congo red. Tabel 4.2 menunjukkan isolat yang
positif mendegradasi selulosa dan yang tidak.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Tabel 4.2 Hasil uji screening isolat bakteri selulolitik
Kode isolat
IS1C1
IS1C2
IS2C1
IS2C2
IS2C3
IS2C4
IS2C5
IS2C6
IS2C7
IS2C8
IS3C1
IS3C2
IS3C3
IS3C4
IS4C1
IS4C2
IIS1C1
IIS1C2
IIS1C3
IIS1C4
IIS1C5
IIS2C1
IIS2C2
IIS2C3
IIS3C1
IIS3C2
IIS4C1
IIIS1C1
IIIS1C2
IIIS1C3
IIIS1C4
IIIS2C1
IIIS2C2
IIIS2C3
IIIS3C1
IIIS3C2
IIIS3C3
IIIS3C4
IIIS4C1
IIIS4C2
IIIS4C3
IIIS4C4
IIIS4C5
Hasil uji
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Keterangan :
+ : Hasil uji positif (terdapat zona bening (clear zone))
- : Hasil uji negatif (tidak terdapat zona bening (clear zone))
Selulosa sebagai senyawa yang paling banyak di bumi tersusun atas
8000-12000 unit glukosa dengan ikatan β-1,4-glukosida. Ikatan β-1,4-glukosida
pada serat selulosa dapat dipecah menjadi monomer glukosa oleh selulase yaitu
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
suatu enzim yang terdiri atas tiga tipe enzim utama yaitu endo-1,4-β-glukanase,
ekso-1,4-β-glukanase dan 1,4- β-glukosidase (Fikrinda dkk., 2000)
Bakteri selulolitik mampu menghasilkan endo-1,4-β-glukanase, ekso-1,4β-glukanase dan 1,4- β-glukosidase yang bekerja secara sinergis dalam
mendegradasi selulosa (Lynd et al., 2002; Badrian and Valášková, 2008 dalam
Shukla dan Varma, 2011). Enzim endo-1,4-β-glukanase memecah rantai selulosa
secara acak kemudian ekso-1,4-β-glukanase akan menghilangkan glukosa maupun
selobiosa dari sisa rantai selulosa yang tidak terdegradasi, dan 1,4-β-glukosidase
akan menghidrolisis selobiosa dan molekul selodextrin terlarut lainnya menjadi
molekul glukosa (Enari, 1983 dalam Fikrinda dkk., 2000; Bakshi dan Varma,
2008 dalam Shukla dan Varma, 2011).
Rantai panjang selulosa yang terdapat di dalam media CMC yang bersifat
amorf (tidak beraturan) sangat mudah dipecah oleh bakteri selulolitik (Goto et al.,
1992 dalam Fikrinda dkk., 2000), sehingga aktivitas enzim selulase pada substrat
CMC merupakan aktivitas enzim endo-1,4-β-glukanase yang bekerja pada rantai
dalam CMC menghasilkan oligo-sakarida atau rantai selulosa yang lebih pendek
(Meryandini dkk., 2009). Selulosa yang terdapat dalam media CMC pada cawan
di sekitar koloni bakteri akan habis digunakan sehingga pada saat pewarnaan
dengan Congo redterdapat zona terang karena tidak ada ikatan antara selulosa dan
Congo red, sedangkan pada daerahyang masih terdapat selulosa akan berikatan
dengan pewarna Congo red dan media akan berwarna merah.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Dari 19 isolat yang menunjukkan hasil positif dengan menunjukkan
adanya zona bening (clear zone) kemudian dilakukan pengamatan makroskopis
dan mikroskopis koloni. Untuk hasil yang lebih rinci dapat dilihat pada tabel 4.3
Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Koloni
No
Kode isolat
1.
IS2C1
Bentuk
Circular
2.
IS2C2
Irreguler
3.
IS2C3
Irreguler
4.
5.
IS2C4
IS2C5
Circular
Circular
6.
IS2C7
Irreguler
7.
8.
9.
10.
IS2C8
IS3C1
IS3C2
IS3C3
Circular
Circular
Circular
Circular
11.
IS3C4
Irreguler
12.
13.
14.
IS4C1
IS4C2
IIS2C1
Circular
Circular
Circular
15.
IIS2C3
Irreguler
16.
17.
IIS3C1
IIIS1C3
Circular
Circular
18.
IIIS3C3
Irreguler
19.
IIIS4C3
Circular
Karakter Koloni
Warna
Tepi
Putih susu
Entire
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Putih susu
Entire
Putih susu
Entire
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Putih susu
Entire
Putih susu
Entire
Putih susu
Entire
Putih susu
Entire
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Kuning
Entire
Kuning
Entire
Putih susu
Entire
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Kuning
Entire
Putih susu
Entire
Transparan
Berpendar
Entire
biru
Kuning
Entire
Elevasi
Convex
Karakter Sel
Bentuk
Gram
Batang
Positif
Flat
Batang
Negatif
Flat
Batang
Negatif
Convex
Convex
Batang
Batang
Positif
Positif
Flat
Batang
Negatif
Convex
Convex
Convex
Convex
Batang
Batang
Batang
Batang
Positif
Positif
Positif
Positif
Flat
Batang
Negatif
Convex
Convex
Convex
Batang
Batang
Batang
Positif
Positif
Positif
Flat
Batang
Negatif
Convex
Convex
Batang
Batang
Positif
Positif
Flat
Batang
Negatif
Convex
Batang
Positif
Berdasarkan tabel morfologi makroskopis dan mikroskopis koloni, isolat
IS2C1, IS2C4, IS2C5, IS2C8, IS3C1, IS3C2, IS3C3, IIS2C1, dan IIIS1C3 memiliki karakter
morfologi yaitu berbentuk bulat (circular) dengan tepi rata (entire), elevasinya
cembung (convex) dan berwarna putih susu serta memiliki bentuk batang dengan
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Gram positif. IsolatIS2C2, IS2C3, IS2C7, IS3C4, IIS2C3, dan IIIS3C3 juga memiliki
kesamaan karakter morfologi yaitu memiliki bentuk yang tidak beraturan
(irregular), dengan tepi rata (entire), elevasi datar (flat) dan berwarna transparan
serta berpendar biru, memiliki bentuk batang dengan Gram negatif. Pada isolat
IS4C1, IS4C2, IIS3C1, dan IIIS4C3 memiliki kesamaan morfologi yaitu memiliki
koloni dengan bentuk bulat (circular), dengan tepi rata (entire), elevasi cembung
(convex) berwarna kuning serta memiliki bentuk batang yang tidak beraturan dan
Gram positif.
4.2 Identifikasi Bakteri Selulolitik
Bakteri pendegradasi selulosa yang berhasil diisolasi dari tanah di
kawasan mangrove wonorejo berjumlah 19 isolat yang kemudian dilakukan
identifikasi dengan menggunakan uji fisiologis bakteri untuk mengetahui genus
dari bakteri yang ditemukan.Karakter fisiologis masing-masing bakteri dapat
dilihat pada tabel 4.4.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Tabel 4.4 Karakteristik fisiologis isolat bakteri selulolitik
Karakteristik
fisiologis
Skripsi
Kode Isolat
IS2C1
IS2C2
IS2C3
IS2C4
IS2C5
IS2C7
IS2C8
IS3C1
IS3C2
IS3C3
IS3C4
IS4C1
IS4C2
IIS2C1
IIS2C3
IIS3C1
IIIS1C3
IIIS3C3
IIIS4C3
Lysine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ornithine
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
H2S
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Glucose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mannitol
-
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
+
-
Xylose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
ONPG
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Indole
-
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
-
+
-
-
+
-
Urease
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
V-P
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Citrate
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
TDA
-
+
+
-
-
+
-
-
-
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
Gelatin
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Malonate
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Inositol
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Sorbitol
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Rhamnose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Sucrose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Lactose
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Arabinose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Adonitol
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Raffinose
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Salicine
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
-
+
Arginine
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Berdasarkan tabel karakteristik fisiologis, isolat IS2C1, IS2C4, IS2C5, IS2C8,
IS3C1, IS3C2, IS3C3, IIS2C1, dan IIIS1C3 memiliki kesamaan karakter fisiologis yaitu
pada uji dekarboksilase asam amino Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil
positif namun tidak pada Ornithine. H2S tidak diproduksi oleh isolat ini, begitu
pula pada uji indole isolat ini menunjukkan hasil yang negatif terhadap
pembentukan Indole. Pada uji Urease dan uji penggunaan Citrate, isolat ini
menunjukkan hasil positif. Pada uji fermentasi karbohidrat, isolat ini hanya
mampu menghidrolisis Lactose dan tidak dapat menghidrolisisInositol, Sorbitol,
Rhamnose, Sucrose, Arabinose, Adonitol, Raffinose dan Salicin. Isolat ini juga
dapat menghidrolisis ONPG, dan Gelatine namun tidak dapat membentuk acetoin
pada V-P, menghasilkan enzim Citrase, dan tidak mendeaminasi Tryptophan pada
TDA. Dari hasil uji kenampakan morfologi koloni hingga karakter fisiologis
bakteri tersebut, maka kelompok isolat tersebut memiliki karakteristik yang sama
dengan genus Bacillus berdasarkan kunci determinasi oleh Koneman et al., (1988)
yang dapat dilihat pada lampiran 3.
Pada isolat IS4C1, IS4C2, IIS3C1, dan IIIS4C3 memiliki kesamaan karakter
fisiologis yaitu pada uji dekarboksilase asam amino yang meliputi dekarboksilase
Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil positif namun tidak pada Ornithine. H2S
tidak diproduksi oleh isolat ini. Sedangkan pada uji Indole, isolat ini menunjukkan
hasil yang negatif. Pada uji Urease, isolat ini menunjukkan hasil positif begitu
pula pada uji penggunaan Citrate, yang juga menunjukkan hasil positif.
Sedangkan pada uji fermentasi karbohidrat yang meliputi Inositol, Sorbitol,
Rhamnose,
Skripsi
Sucrose,
Lactose,
Arabinose,
Adonitol,
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Raffinose
dan
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Salicinemenunjukkan hasil yang negatif. Kelompok isolat ini memiliki kesamaan
karakter dengan Genus Cellulomonas berdasarkan kunci determinasi pada
penelitian yang dilakukan oleh Stackebrandt et al. (2002) yang dapat dilihat pada
lampiran3.
Isolat IS2C2, IS2C3, IS2C7, IS3C4, IIS2C3, dan IIIS3C3 juga memiliki
kesamaan karakteristik pada uji fisiologis seperti pada uji dekarboksilase asam
amino Lysine, dan Arginine menunjukkan hasil positif namun tidak pada asam
amino Ornithine. H2S tidak diproduksi oleh isolat ini. Sedangkan pada uji Indole,
isolat ini menunjukkan hasil yang positif. Pada uji Urease, isolat ini menunjukkan
hasil positif begitu pula pada uji penggunaan Citrate. Pada uji fermentasi
karbohidrat yang meliputi Inositol, Sorbitol, Rhamnose, Sucrose, Lactose,
Arabinose, Adonitol, Raffinose dan Salicine menunjukkan hasil yang negatif.
Kelompok isolat ini memiliki kesamaan karakter dengan Genus Pseudomonas
berdasarkan kunci determinasi pada Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology Ninth Edition (2000) yang dapat dilihat pada lampiran 3.
Dari hasil isolasi dan identifikasi bakteri selulolitik pada tanah mangrove
Wonorejo Surabaya didapatkan 3 genus bakteri selulolitik yaitu Bacillus yang
ditemukan pada rhizosfer A. germinans, A. officinalis, dan E. agallocha,
Pseudomonas yang ditemukan pada rhizosfer A. officinalis, dan E. agallocha,
Cellulomonas yang ditemukan pada rhizosfer E. agallocha dan H. tilliaceus.
Menurut Rao (1994), bakteri selulolitik yang dapat ditemukan di dalam tanah
antara lain: Bacillus, Bacteriodes, Cellafalcicula, Cellulomonas, Cellvibrio,
Clostridium, Chromobacterium, Corynebacterium, Cythopaga, Polyangum, dan
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga
Pseudomonas. Namun sampai saat ini belum banyak penelitian yang
menyebutkan bakteri-bakteri apa saja yang terdapat di dalam tanah rhizosfer pada
mangrove. Keberadaan bakteri selulolitik pada rhizosfer tanaman-tanaman
mangrove ini juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan di sekitar tempat tumbuh
tanaman tersebut, antara lain kelembapan, pH, suhu, dan salinitas. Kelembapan
dan pH merupakan faktor yang mempengaruhi kehidupan bakteri di dalam tanah
(Rao, 1994). Meskipun berasal dari lingkungan normal (suhu >4°C - <40°C dan
pH >5 - <8.5) mikroba selulolitik ada yang mampu menghasilkan selulase yang
dapat beraktivitas pada lingkungan ekstrem dan enzim tersebut dapat digunakan
dalam banyak aplikasi bioteknologi (Busto et al., 1995 dalam Fikrinda dkk.,
2000). Pada lokasi penelitian ini terukur suhu tanah dalam kisaran 26-28oC yang
merupakan suhu normal pertumbuhan bakteri. Aktivitas minimum enzim selulase
yang dihasilkan oleh bakteri yaitu pada suhu 25oC sedangkan aktivitas maksimum
pada suhu 60oC (Yin et al., 2010). pH tanah pada lokasi penelitian ini berkisar
antara 6,5-8,5 yang merupakan jenis tanah basa. Pada penelitian yang dilakukan
oleh Fikrinda dkk. (2000), bakteri penghasil selulase dapat ditemukan pada
kisaran pH 4 hingga 11. Seperti pada Bacillus yang memiliki kisaran pH 4,5-11.
Tanah di kawasan mangrove Wonorejo Surabaya juga memiliki salinitas antara 025‰. Menurut Wijiyono (2009), banyaknya bakteri pada kisaran salinitas 1020‰ dan 20-30‰ menunjukkan bahwa tiap organisme memiliki toleransi
terhadap salinitas dan pada tingkatan salinitas tertentu merupakan lingkungan
yang mendukung bakteri untuk tumbuh dan berkembang.
Skripsi
Eksplorasi Bakteri Selulolitik dari Tanah Mangrove Wonorejo Surabaya
Reanida, Pramita P.
Download