instruksi kerja laboratorium biologi tanah - Tanah UB

Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
INSTRUKSI KERJA
LABORATORIUM BIOLOGI TANAH
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2011
1
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
Instruksi Kerja
Laboratorium Biologi Tanah
Jurusan Tanah
Fakultas Pertanian
Universitas Brawijaya
Kode Dokumen
:
0040207300
Revisi
:
2
Tanggal
:
08 Juni 2011
Diajukan oleh
:
Tim Unit Jaminan Mutu
Ketua,
ttd
Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU
Dikendalikan oleh
:
Sekretaris Jurusan
ttd
Dr. Ir. Sugeng Prijono, SU
Disetujui oleh
:
Ketua Jurusan
ttd
Prof. Dr. Ir. Zaenal Kusuma, SU
2
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
DAFTAR ISI
Halaman
Daftar Isi
iii
Daftar Gambar
iii
1. Analisa Lignin
…………………………………………………………………………………
1
2. Analisa Polyphenolic
………………………………………………………………………….…….
3. Fraksionasi Bahan Organik berdasarkan ukuran
partikel dengan metode POM
……………………………………………………………………….……….
4. Pengamatan Makrofauna Tanah : Cacing Tanah dan
Rayap………………………………………………………………………
5. Pengamatan Mikroorganisme tanah
metode Slide Contact
……………………………………………………………………………………
6. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan
……………………………………………………………………
3
6
8
12
15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.
Skema prosedur fraksionasi bahan organic
berdasarkan ukuran partikel (Particulate Organic
Matter = POM)……………………………………………………………
7
2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap
di Lapangan………………
9
3
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
ANALISIS LIGNIN
(Kode : 0040207301)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter
konsentrasi Lignin.
2. ALAT dan BAHAN
A. Bahan pereaksi
1. Acid detergent solution
8 g CTAB ( cetylmethyl-ammonium bromide) dilarutkan
dalam 400 ml H2SO4, 0.5 ( larutkan 28 ml H2SO4 pekat p.a ke
dalam aquadest sampai mencapai volume 1000 ml),
2. Antifoam solution
2.5 ml silicon antifoam 30% dilarutkan dalam 100 ml
aquadest. Silicon antifoam : 30 ml silicon antifoam dilarutkan
dalam 100 ml aquadest, dan
3. H2SO4 72%
Larutkan 720 ml H2SO4 pekat p.a ke dalam aquadest sampai
mencapai volume 1000 ml.
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium dan Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. DEFINISI
5. URAIAN PROSEDUR
1. Timbang 0.5 g contoh tanaman (WI) dan tambahkan 25 ml
acid detergent solution dan 1 ml antifoam ke dalam 250 ml
botol volumetric,
2. Panaskan sampai T = 150oC selama 1 jam, setelah mendidih
(turunkan suhu pada awal terjadinya pembuihan dan
dikocok sambil digoyang untuk beberapa waktu),
3. Kemudian disaring dalam filter glass crucible ( W2) dan cuci
dengan aceton ( 1 kali saja) dan disusul dengan air panas
sampai tidak berwarna,
4
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
4. Crucible dan isinya di oven pada T = 105oC selama 24 jam
dan didinginkan dalam desikator dan timbang ( W3),
5. Crucible dan isinya ditempatkan dalam beaker glass dan
tambahkan H2SO4 72% secukupnya sampai setengah dari
volume crucible dan didiamkan selama 3-4 jam,
6. Gunakan vacum pump untuk membilas / menyedot dan
setelah bersih dibilas dengan air panas sampai tidak asam (
tidak berwarna dan tidak berbuih),
7. Crucible dan isi dioven pada T = 105oC selama 24 jam,
dinginkan dan timbang ( W4), sedangkan isinya diabukan
pada T = 500oC untuk waktu 4-5 jam, dinginkan dan
timbang ( W5 ).
PERHITUNGAN :
ADF ( % ) = ( W3 – W2) X 100
W1
ADL (%) = (W4 – W5) X 100
W1
Keterangan :
ADF : Acid Detergent Fiber
ADL : Acid Detergent Lignin
W : Weight (g)
5
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
ANALISIS POLYPHENOLIC
(Kode : 0040207302)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan mengukur kualitas bahan organik menggunakan parameter
konsentrasi polyphenolic.
2. ALAT dan BAHAN
a. Bahan Pereaksi
1. Methanol 50 %
Larutkan 101.01 ml methanol 99% dalam 200 ml aquadest.
2. Sodium Carbonat ( Na2CO3 17%)
25.5 g Na2CO3 dalam 124.5 ml aquadest dilarutkan dalam
beaker glass.
3. Sodium tungstate ( Na2WO4)
4. Asam orthophosphoric.
5. Asam phosphomolybdic.
6. Asam tannic.
7. Reagent Folin-Denis
25g sodium tungstate + 5 g asam phosphomolybdic dan 12.5
asam orthophosphoric dimasukkan ke dalam 250 ml botol
volumetrik yang berisi 187.5 ml aquadest. Kemudian di
reflux selama 2 jam dan diencerkan untuk 250 ml dengan
menggunakan aquadest.
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. DEFINISI
5. URAIAN PROSEDUR
Membuat Standart
1. Siapkan 0,1 mg/ml asam tannic.
2. Larutkan 0.01 g asam tannic dalam 100 ml botol volumetrik
dengan aquadest.
3. Pipet 0,1,2,3,4,5 dan 6 ml dari 0.1 mg/ml asam tannic
dimasukkan dalam 50 ml cuvet yang berisi 20 ml aquadest.
6
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
4. Tambahkan 2.5 ml reagent Folin- Denis dan 10 ml Na2CO3
17% dan kemudian dibaca dengan spectrophotometer,
absorbance 760 nm.
Cara Kerja :
1. Timbang 0.75 g contoh tanaman dan diekstrak dengan 20
ml methanol 50% dalam beaker glass 100 ml kemudian
tutup dengan para film atau aluminium foil.
2. Didihkan dalam water bath pada T = 70-80oC selama 1 jam
dan hasil ekstraksi disaring dengan kertas saring
(Whatman No. 42) dan dibilas dengan menggunakan
methanol 50 % kemudian diencerkan sampai 50 ml dalam
botol volumetrik ( konsentrasi = 15 mg/ ml ).
3. Pipet 1 ml hasil ekstraksi ke dalam cuvet 50 ml dan
tambahkan 20 ml aquadest, 2.5 ml reagent Folin Dennis
dan 10 ml Na2CO3 ( sodium carbonat 17%), kemudian
encerkan sampai 50 ml dengan menggunakan aquadest dan
diamkan selama 20 menit.
4. Baca dengan menggunakan Spectrophotometer, absorbance
760 nm.
Perhitungan :
1. Carilah persamaan regresi dari larutan standart.
2. Tentukan TAE sampel dan TAE blanko (X) berdasarkan
persamaan regresi diatas.
Keterangan :
TEP : Total Extractable polyphenols (mg)
TAE : Tannic Acid Equivalent (mg)
W : weight of sample (g)
7
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
Tabel Pengamatan :
A. Tabel Pengamatan
X
Y
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
∑=
X2
XY
Y2
Catatan : X = konsentrasi larutan standart (mg/ml), Y = absorbance
Sampel
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Y bacaan
8
TAE sampel
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
FRAKSIONASI BAHAN ORGANIK TANAH
METODE POM
(Kode : 0040207303)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan mempelajari dinamika karbon dalam tanah, melalui
pemisahan partikel bahan organik tanah berdasarkan distribusi
ukuran partikel dengan menggunakan Metode POM (Particulate
Organic Matter)
2. ALAT dan BAHAN
1. Satu set ayakan basah : ukuran kasa 2 mm, 250 μm,
μm dan 50 μm.
2. Tanah segar.
3. Na hexametaphosphate (hanya untuk tanah liat).
150
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. DEFINISI
Fraksi BOT berukuran pasir (5.0 mm – 2.0 mm) biasanya lebih
labil daripada BOT berukuran liat dan debu (Tiesen dan
Steward, 1983). Bahan organic tanah yang mempunyai ukuran
pasir selanjutnya oleh Cambardella dan Elliot (1992) disebut
dengan bahan organic berukuran partikel (particulate organic
matter = POM).
Prinsip penetapan fraksi BOT berdasarkan ukuran partikel
adalah menentukan jumlah absolute dan proporsi relative C
dan N dari partikel organic dalam tanah. Metode penetapan
fraksi POM dari TSBF (Okalebo, 1993) adalah metode yang
relative cepat, murah dan tidak menimbulkan pencemaran
lingkungan karena hanya menggunakan air. Klasifikasi ukuran
partikelnya sedikit berbeda dengan POM dari Cambardella dan
Elliot (1992); pada teknik dari TSBF POM adalah fraksi BOT
berukuran 50-250 nm. POM adalah fraksi bahan organic yang
mudah didekomposisi, oleh karena itu dalam mempelajari
dinamika C fraksi ini sangat penting untuk ditetapkan.
9
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
Mengingat pentingnya fraksi BOT dalam mempelajari dinamika
C di daerah tropis, maka pemilihan teknik penetapan fraksi
BOT yang murah dan cepat dengan hasil yang baik sangat
dibutuhkan.
5. URAIAN PROSEDUR
1. Ambil 25 g subsample tanah segar kemudian tentukan
kandungan air tanahnya. Bila tanah yang dimiliki adalah
tanah kering udara, maka tanah harus dibasahi terlebih
dahulu pada kapasitas lapang selama 1-2 minggu, kemudian
tetapkan kadar air tanahnya.
2. Atur ayakan diatas mesin kocok dengan urutan ayakan 2 mm
diatas 250 μm, 150 μm, 50 μm, yang terbawah adalah
penampung.
3. Timbang 500 g contoh tanah basah (segar) dan letakkan
pada ayakan ukuran kasa 2mm, pengayakan basah dapat
dimulai.
4. Setelah 20 menit ambil semua partikel yang terdapat pada
ayakan 2 mm, 250 μm, 150 μm, dan 50 μm secara terpisah.
5. Keringkan masing-masing fraksi tersebut dalam oven pada
suhu 650C selama 24 jam, timbang berat keringnya dan
tetapkan kandungan C dan N nya.
6. Tetapkan juga total C dan N dari total tanah.
Gambar 1. Skema prosedur fraksionasi bahan organic berdasarkan
ukuran partikel (Particulate Organic Matter = POM)
10
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
PENGAMATAN DAN INDENTIFIKASI
MAKROFAUNA TANAH : CACING TANAH DAN RAYAP
(Kode : 0040207304)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan melakukan pengamatan biodiversitas makrofauna (cacing
tanah dan rayap) masing-masing menggunakan metode monolit
yang dimodifikasi oleh BGBD (2005) dan metode transek.
2. ALAT dan BAHAN
Alat yang diperlukan meliputi :
1. Cetok,
2. nampan (4 buah),
3. pinset serangga,
4. kuas lukis,
5. bingkai kuadrat dari besi ukuran 25 x 25 x 10 cm,
6. Frame 50 cm x 50 cm
7. pensil 2B,
8. kertas HVS yang telah dipotongi untuk label, dan
9. Botol film.
Bahan:
1. Formalin 4%
2. Ethanol 70%
3. Air bersih
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. DEFINISI
Fauna tanah berperanan penting dalam mempertahankan:
ketersediaan hara (misalnya mikoriza dan rhizobium), porositas
dan infiltrasi air tanah (misalnya cacing tanah). Dengan
demikian, laju limpasan permukaan dan erosi bisa dikurangi
sehingga produktivitas tanah dan tanaman dapat dipertahankan.
Untuk itu pemahaman akan pentingnya peran fauna tanah dalam
proses-proses biologi tanah sangat diperlukan.
Metode monolit untuk pengambilan sampel cacing tanah
diadopsi dari prosedur ASB ( Swift and Bignell, 2001) yang
11
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
dimodifikasi (BGBD, 2005). Fungsinya adalah
mengkoleksi cacing tanah dan makroarthropoda.
untuk
Metode standar untuk pengambilan contoh rayap di lapangan
adalah metode transek semi kuantitatif 100 m X 2 m yang bisa
disederhanakan menjadi 20 x 2 m. Data yang dihasilkan dari
pengukuran dengan metode semi kuantitatif transek merupakan
data kualitatif bukan merupakan nilai mutlak. Namun data ini
memiliki
tingkat
keakuratan
tinggi.
Metode
transek
dideskripsikan pertama kali oleh Jones dan Eggleton (2000).
5. URAIAN PROSEDUR
Skema pengambilan contoh makrofauna tanah (cacing tanah dan
rayap) dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini:
1. Monolith cacing tanah (0.5x0.5 m2)
2. Transek semi kuantitatif untuk pengambilan contoh rayap
Gambar 2. Posisi Pengambilan Sampel Cacing Tanah dan Rayap di
Lapangan.
12
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
A. Cara Kerja Pengambilan Sampel Cacing Tanah dengan Metode
Sampling Monolit
Pada setiap sistem penggunaan lahan ditentukan 4-6 titik
monolit. Pada hutan ditentukan 4 monolit cacing tanah yakni 1
monolit berukuran 25 cm x 25 cm x 10 cm dan 3 monolit
lainnya berukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm, sedangkan pada
lahan pertanian misalnya perkebunan sawit diambil 6 monolit
masing-masing dengan ukuran 50 cm x 50 cm x 10 cm.
Pengambilan contoh monolit dilakukan pada lapisan (1)
seresah, di atas tanah mineral (2) tanah kedalaman 0-10 cm,
(3) tanah kedalaman 10-20 cm, dan (3) tanah kedalaman 20-30
cm.
B. Cara Kerja Pemilahan Sampel Cacing Tanah dengan Metode
Hand Sortir
1. Lapisan tanah yang diperoleh dari tiap monolit per lapisan
kedalaman dimasukkan ke dalam nampan.
2. Setiap cacing yang ditemukan diambil secara manual (hand
sortir).
3. Cacing tanah tidak langsung dimasukkan ke dalam ethanol
70% tetapi terlebih dahulu dimasukkan ke dalam nampan
yang sudah diisi air. Tujuan perlakukan ini pertama, untuk
menghilang tanah yang menempel pada tubuhnya. Kedua,
cacing dimasukkan dalam nampan kedua yang berisi etanol
70 % untuk relaksasi. Ketiga, cacing dimasukkan dalam
formalin 4% selama beberapa detik hingga tubuhnya kaku.
Keempat, cacing tanah siap dimasukkan dalam botol film
yang berisi ethanol 70 % dan sudah diberi label.
C. Cara Pengambilan Sampel Rayap
1. Tali sepanjang 20 m ditarik dan dipasang di permukaan
tanah sebagai garis tengah transek (midline of transect).
Jaraknya dari sub-plot pengambilan monolit adalah 8
meter. Pemilihan lokasi untuk transek dilakukan dengan
mempertimbangkan
jarak
terhadap
monolit,
dan
kemiringan lahan. Transek diletakkan sejajar kontur.
2. Transek dibagi dalam 4 seksi berukuran 5 x 2 m
(selanjutnya disebut seksi 1, seksi 2, seksi 3, seksi 4). Tiap
seksi dibagi oleh garis tengah transek menjadi 8 sub seksi
13
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
yaitu S1 kiri dan kanan, S2 kiri dan kanan, S3 kiri dan
kanan, S4 kiri dan kanan. Satu orang kolektor bekerja di
satu seksi.
3. Dalam setiap sub seksi digali 6 monolit kecil berukuran 12 x
12 x 10 cm. Pada lima menit pertama, kolektor menggali
monolit 1, tanah dimasukkan ke dalam nampan.
Pengambilan contoh rayap dilakukan secara in situ dengan
hand sortir.
4. Contoh rayap yang diperoleh, baik dari kasta pekerja
maupun prajurit, dimasukkan ke tabung film berisi etanol
70 % dan diberi label. Kolektor diberi waktu 5 menit untuk
menggali, memilah, memilih dan mengkoleksi contoh ke
dalam tabung film sekaligus memberikan label. Setelah
lima menit pertama berlalu, kolektor segera pindah ke
monolit berikutnya. Sehingga total waktu yang dibutuhkan
untuk menyelesaikan pengambilan contoh pada 6 monolit
kecil adalah 30 menit.
5. Selama lima belas menit berikutnya, dilakukan pengambilan
contoh pada lokasi alam kecil (micro sites) yang
diperkirakan representatif untuk mendapatkan rayap untuk
tiap sub seksi, misalnya:
a. Pada tanah yang terdapat remukan dan sisa-sisa lapukan
kayu
b. Posisi samping kayu-kayu mati, tunggul
c. Pada tanah dengan akumulasi humus yang tebal di
bawah pohon, dan diantara perakaran.
d. Disamping sarang rayap, gundukan, dan sarang karton,
jalan rayap pada pepohonan dan sarang-sarang di atas
pohon hingga ketinggian 2 m di atas permukaan tanah.
14
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
PENGAMATAN MIKROORGANISME TANAH
METODE SLIDE CONTACT
(Kode : 0040207305)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan melakukan pengamatan mikroorganisme dalam tanah
menggunakan metode slide kontak.
2. ALAT dan BAHAN
1. Tabung reaksi 25 ml untuk pengenceran,
2. Gelas slide yang disterilkan dengan api sebelum digunakan.
3. Larutan Bengal Rose Fenol: larutan 1.0 g Bengal Rose dan
0.01g CaCl2.2H2O dalam 100 ml akua-fenol 5% .
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Iswandi Anas.1989.
Petunjuk Laboratorium, Biologi Tanah dalam Praktek,
Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut
Pertanian Bogor.
4. DEFINISI
Cara slide kontak adalah pengamatan mikroorganisme tanah
yang menempel pada gelas slide yang dibenamkan ke dalam
tanah selama beberapa waktu. Tujuan dari cara slide kontak ini
adalah untuk mengamati populasi mikroorganisme tanah dalam
keadaan alami. Pemindahan mikroorganisme ke dalam gelas
slide
memungkinkan
pengamatan
yang
baik
karena
menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh adanya partikel
tanah.
Pembenaman gelas slide dilakukan secara hati-hati ke dalam
tanah, untuk mendapatkan sampel mikroorganisme tanah
dilakukan dengan cara menggosokkan bongkah tanah pada
permukaan slide tersebut. Bila gelas slide dibenamkan untuk
beberapa waktu di dalam tanah, kelompok organisme yang
dapat menempel pada permukaan slide dapat diamati. Bila
dikerjakan dengan hati-hati seandainya ada pembentukan spora
maka spora tersebut dapat diusahakan agar tetap utuh.
15
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
Demikian pula pengamatan terhadap sifat – sifat koloni, bahan
yang digunakan mikroorganisme sebagai sumber energi dan
responnya terhadap faktor lingkungan dan sebagainya dapat
dilakukan.
Cara ini mempunyai arti yang sangat penting dalam mengamati
hubungan penyusunan dan morfologi mikroorganisme dalam
tanah. Pembuatan foto akan sangat berguna dalam
penyampaian apa yang diperoleh. Dengan memanfaatkan gelas
slide yang berbeda baik dari segi waktu dan lama inkubasinya,
maka urutan proses ekologi dari mikroorganisme dapat diamati
dan dipelajari.
Metode ini adalah metode kualitatif dan dengan cara ini isolasi
sukar dilakukan. Koloni berkembang sesuai pada tempatnya
pada gelas slide. Bila isolasi dan identifikasi lebih lanjut
dikehendaki, hal ini dapat dilakukan akan tetapi tidak semua
organisme dapat tumbuh pada media buatan. Pemasukan gelas
slide ke dalam tanah akan mengubah keadaan alami dengan
terbentuknya permukaan yang baru untuk kolonisasi, akan
tetapi pengaruhnya sukar dievaluasi.
5. URAIAN PROSEDUR
1. Buatlah celah di dalam tanah dengan mengusahakan sedikit
mungkin gangguan pada tanah. Untuk ini dapat digunakan
pisau.
2. Masukkan dengan hati-hati gelas slide dengan arah vertikal,
sampai tersisa kira-kira 1.5 cm dari permukaan tanah.
Tekan kembali tanah ke arah gelas slide.
3. Gelas slide diinkubasi sesuai dengan waktu yang
dikehendaki, biasanya sekitar 1-3 minggu.
4. Bersihkan permukaan gelas slide sebelah atas dari tanah,
kemudian tarik gelas slide dari belahan yang tidak
terganggu dengan mengangkat gelas slide tersebut secara
hati-hati.
Setelah agregat tanah yang menempel pada gelas slide
dilepaskan, kering udarakan gelas slide tersebut. Dengan
bantuan aliran air, partikel tanah yang menempel pada
permukaan tanah yang tidak terganggu dilepaskan dengan
hati-hati sampai hanya ada lapisan tipis yang tertinggal.
Bersihkan permukaan gelas slide pada
16
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
belahan yang terganggu dengan kain basah yang steril.
Lengketkan mikroorganisme tanah pada gelas slide dengan
membiarkan gelas slide tersebut kering udara dan panaskan
di atas nyala api.
5. Tempatkan gelas slide di atas bejana air yang mendidih dan
basahi selama 6 sampai 10 menit dengan Bengal Rose
Fenol. Bila perlu tambahkan Bengal Rose Fenol agar gelas
slide tersebut tidak kering. Buang kelebihan pewarna
dengan mencuci gelas slide dengan air sampai tidak ada
pewarna yang tercuci bersama air cucian.
6. Keringkan gelas slide tersebut dan amati gelas slide dengan
menggunakan mikroskop.
17
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
ISOLASI MIKROBIA DARI LINGKUNGAN
(Kode : 0040207306)
1. RUANG LINGKUP
Instruksi kerja ini berlaku bagi mahasiswa ataupun analis yang
akan melakukan isolasi mikrobia dari lingkungan.
2. ALAT dan BAHAN
Alat dan bahan yang diperlukan dalam kegiatan pembuatan
media dan sterilisasi secara aseptik yakni Erlenmeyer, cawan
petri, kertas payung, plastik wrapping, kapas, benang kasur,
autoklaf, Media TPC sebagai media isolat total mikrobia,
Nutrien Agar (NA) sebagai media isolat bakteri, Potato
Dextrose Agar (PDA) sebagai media isolat fungi.
Berikut ini alat dan bahan yang diperlukan untuk sterilisasi
dengan pembakaran Jarum oose, bunsen, korek api, media
padat dalam cawan petri (berisi Na/PDA).
Sedangkan alat dan bahan berikut ini digunakan dalam
sterilisasi dengan Panas basah Bertekanan Tinggi (autoklaf):
Media PDA dan NA dalam tabung reaksi, cawan petri steril,
kertas payung, kapas, benang kasur dan inkubator.
Alat dan bahan yang diperlukan dalam isolasi mikrobia dari
lingkungan :
1. Sampel air rendaman bahan kompos.
2. Aquades steril dalam erlenmeyer (45 ml)
3. Aquades steril dalam tabung reaksi (9 ml)
4. Media Nutrien agar (NA)
5. Media Potato Dextrose Agar (PDA)
6. Oose
3. REFERENSI
Prosedur Layanan Analisa Laboratorium, Panduan Analisa
Biologi Tanah.
4. DEFINISI
Mikrobia yang berasal dari lingkungan, berada dalam populasi
campuran. Mikrobia di alam sangat jarang berada dalam spesies
tunggal. Dalam bidang bioteknologi, ketersediaan biakan murni
sangatlah penting. Selain itu pemeliharaan kemurnian isolat
18
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
selama penyimpanan juga sangat perlu mendapatkan perhatian,
karena berkaitan dengan didapatkannya produk atau metabolit
tertentu dari suatu spesies tunggal yang hanya dapat dipelajari
apabila spesies tunggal mikroba terpisah dari populasi
campuran. Untuk itu perlu dilakukan isolasi/pemisahan untuk
mendapatkan mikroba biakan murni.
Untuk melakukan isolasi mikroba alat-alat yang digunakan dalam
kegiatan di laboratorium harus disterilisasi. Sterilisasi adalah
suatu usaha atau tindakan untuk membebaskan alat atau media
dari mikroba. Hal ini diperlukan agar mikroba yang ingin
ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas dari mikroba lain.
Suatu alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau bahan
terbebas dari mikroba, baik dalam bentuk sel vegetatif maupun
spora. Dengan kata lain dalam bahan dan alat yang akan
digunakan tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan
kehadirannya, baik yang menggangu atau merusak media.
Sterilisasi terdiri dari beberapa cara. Pemilihan cara sterilisasi
ditentukan berdasarkan sifat alat atau bahan yang akan
disterilisasi dan tujuan sterilisasi.
Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan teknis aseptis
untuk mencegah ataupun mengurangi kontaminasi yang tidak
diinginkan, karena setiap benda yang digunakan maupun pekerja
dilaboratorium dapat menjadi kontaminasi.
5. URAIAN PROSEDUR
1. Prosedur umum yang harus diperhatikan dalam teknik aseptis
yakni :
a. Disinfektan area kerja. Meja yang akan digunakan terlebih
dahulu
diberi
disinfektan
untuk
membunuh
mikroorganisme yang ada.
b. Jarum oose. Pemindahan mikroorganisme dari kultur cair
maupun padat ke medium lain membutuhkan jarum oose.
Sterilisasi dari jarum oose ini dengan cara membakar
jarum tersebut dengan api bunsen hingga berwarna
merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum maupun setelah
jarum digunakan.
c. Mulut tabung. Sterilisasi pada mulut tabung reaksi atau
erlenmeyer dapat dilakukan dengan membakar mulut
tabung setelah tutup kapas dibuka dan sesaat sebelum
menutup kembali.
19
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk
melakukan inokukasi maupun setelah ditutup, tepi cawan
petri didekat di api bunsen. Selama inokulasi, bagian
cawan petri yang terbuka, didekatkan ke api bunsen
untuk mencegah kontaminasi mikroba yang berasal dari
udara.
2. Prosedur Sterilisasi
A. Pembuatan Media dengan sterilisasi secara Aseptik
Cara kerja:
a) Media TPC, Nutrien Agar dan Potato Dextrose Agar
ditimbang masing-masing 2 gram.
b) Masing-masing media dilarutkan dalam aquades 100
ml.
c) Dilarutkan sampai mendidih.
d) Masukkan dalam erlenmeyer dan ditutup dengan
kapas.
e) Semua bahan dan alat dimasukkan dalam autoklaf
selama 15 menit dengan tekanan 1 atmosfir, dan
dengan suhu 1210C.
B. Sterilisasi dengan pembakaran
Cara kerja:
a) Nyalakan lampu bunsen, atur nyala api secara
maksimal.
b) Ambil jarum oose, bakar mulai dari bagian pangkal
kawat oose secara perlahan menuju ujung kawat jarum
oose. Pembakaran jarum oose ini dilakukan sampai
kawatnya merah membara.
c) Goreskan masing-masing jarum oose tersebut pada
permukaan media padat dalam cawan petri.
d) Inkubasi media tersebut pada 300C selam 48 jam.
e) Amati mikroba yang tumbuh.
C. Sterilisasi dengan Panas Basah Bertekanan Tinggi
(autoklaf)
Cara Kerja:
1. Tutup tabung reaksi yang berisi media dengan kapas,
beberapa tabung diikat jadi satu dan bagian tutupnya
dibungkus dengan kertas payung. Sisakan satu tabung
untuk tidak disterilkan.
2. Isi autoklaf dengan aquades sampai permukaan air
dibawah ansang autoklaf.
3. Masukkan semua alat dan bahan kedalam autoklaf.
20
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
4.
Tutup autoklaf dan kencangkan setiap mur pada
penutupnya sampai kencang.
5. buka klep pada pengatur tekanan uap air, dan
biarkan sampai mendidih.
6. Tutup klep tersebut setelah air mendidih dan media
disterilkan selama 15 menit pada suhu 1210C dan
tekanan 1 atmosfir.
7. Setelah selesai sterilisasi maka matikan autoklaf dan
tunggu sampai dingin.
8. Buka autoklaf dan tunggu sampai media agak dingin
(450C).
9. Tuangkan media (PDA dan NA) pada cawan petri
steril.
10. Inkubasi media tersebut selama 48 jam dengan suhu
380C.
11. Amati pertumbuhan mikroba.
3. Isolasi Mikrobia dari Lingkungan
Teknik isolasi/pemisahan dilakukan dengan berbagai cara,
antara lain: melakukan pengenceran berseri dilanjutkan
dengan mebiakkan pada media yang sesuai yaitu dengan
metode cawan tung (pour plate) dan cawan gores (streak
plate)
Cara Kerja :
1. Pembuatan Seri Pengenceran
Bahan yang akan dijadikan sebagai bahan pembuatan
isolat merupakan air rendaman yang berasal dari
bahan kompos kampus yang telah diinkubasi kemudian
direndam selama 7 hari, diambil sebanyak 5 ml
kemudian secara aseptis masukkan ke dalam 45 ml
aquades steril. Kemudian dilakukan homogenitas
dengan memvortek sampel. Sampel yang telah
homogen ini disebut dengan pengenceran 10 -1. Dari
sampel ini diambil 0,1 ml dan dimasukkan kedalam
cawan Petri steril dan ditambahkan dengan media yang
sesuai. Dari pengenceran 10-1 diambil 1 ml dan secara
aseptis dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi
9 ml aquades steril dan dihomogenasi dengan vortek.
Pengenceran ini disebut dengan pengenceran 10 -2. Dari
pengenceran ini diambil 1 ml sampel untuk dimasukkan
pada tabung reaksi berisi aquades berikutnya. Dan
0,1ml dimasukkan kedalam cawan petri steril. Dengan
21
Instruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah FP UB
cara yang sama akan didapatkan pengenceran 10-3 dan
seterusnya sampai pada pengenceran 10-6.
2. Metode Cawan Tuang (pour plate)
Masing –masing pengenceran berseri tersebut, diambil
0,1 ml sampel dan dimasukkan dalam cawan petri
steril. Untuk mengisolasi bakteri maka ditambahkan
dengan media Nutrien Agar, sedangkan untuk
mengisolasi jamur ditambahkan media Potato Dextrose
Agar. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk
bakteri selama 24 jam sedangkan untuk jamur
dilakukan inkubasi selama 3 x 24 jam.
3. Metode Cawan Gores (steak plate)
Media Nutrien Agar dan Potato Dextrose agar
dituangkan secara aseptis kedalam cawan petri steril.
Biarkan memadat. Setelah media memadat, sampel
dari pengenceran berseri diambil dengan menggunakan
oose dan dilakukan teknik penggoresan. Sampel yang
digores cukup satu oose. Sebelum berpindah dari satu
kuadran ke kuadran berikutnya oose disterilkan
terlebih dahulu, selanjutnya penggoresan dilanjutkan
kembali .
Dua metode ini dilakukan secara bergantian agar dapat
diketahui metode mana yang dapat menghasikan
banyak bakteri.
4. Penyimpanan Biakan Murni
Biakan murni (isolat) yang diperoleh dari tiga tahap,
selanjutnya dapat disimpan pada jangka waktu yang
lama, dengan cara memindahkan kedalam media agar
miring (slant agar) yang mengandung media yang
sesuai (Nutrien agar atau Potato Dextrose agar).
22