(IDNI) Untuk Produksi Sel Totipoten Sebagai Graft

Rektor Universitas Brawijaya
Ketua Lembaga Penelitian Universitas Brawijaya
DEWAN REDAKSI
Ketua
Prof. Dr. Ir. Syamsul Bahri, M.S
Anggota
Prof. Dr. Ir. Moch. Munir, M.S (Unibraw-2008)
Prof. Drs. Sutiman B. Sumitro, S.U.D. Sc (Unibraw-2008)
Prof. Dr. Ir. SM Sitompul (Unibraw-2008)
Prof. Dr. Ir. Luqman Hakim, M.S (Unibraw-2008)
Prof. Dr. Ir. Rustidja, M.S (Unibraw-2008)
Dr. Ir. Nasir Saieh (Balitkabi Deptan-2008)
Penyunting Ahli
Ir. Arifin Noor Sugiharto, M.Sc, Ph.D (Unibraw-2008)
Ir. Didik Suprayogo, M.Sc, Ph.D (Unibraw-2008)
Dr. Ir. Moch. Sahid (Balittas Deptan-2008)
Brian O Flaherty (Ahli Bhs inggris-2008)
Dra. Francien Herien Tomasowa., Ph.D (Lab. Bhs. Unibraw-2008)
Drs. Adiono, M.A., Ph.D (Lab. Bhs. Unibraw-2008)
Penyunting Pelaksana
Drs. Sofy Permana, MSc, DSc (Unibraw-2008)
AgustinaTri Endharti, S.Si., Ph.D (Unibraw-2008)
Sekretariat
Pujiono, SH
Alamat Redaksi/Penerbit
Lembaga Peneiitian Universitas Brawijaya
Jl. Veteran, Malang - 65145
Telp. (0341) 575824, 551611 psw. 301, Fax. (0341) 575828 E-mail:
[email protected]
Metode Intracytoplasmic Direct Nuclear Injection (Idni) Untuk Produksi
Sel Totipoten Sebagai Graft
Budi Siswanto*, Sri Rahayu** dan Gatot Ciptadi***
♦Fakultas Kedokteran/RSUD Syaiful Anwar, **Fakultas MIPA-Biologi ***Fakultas Peternakan Universitas
Brawijaya, Malang
Abstrak
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memproduksi sel-sel totipoten yang diperoleh dari kultur embrio
hasil rekonstruksi dengan transfer nukleus menggunakan donor sel fetal fibroblast. Teknik ini
dimaksudkan untuk menghasilkan sel-sel totipoten sebagai sumber graft yang nantinya akan dapat
digunakan untuk kepentingan transpalantasi sel. Embrio rekonstruksi dihasilkan dengan menggunakan
teknik IDNI (Intracytoplasmic Direct Nuclear Injection) langsung ke dalam sitoplasma. Pada tahun
pertama dilakukan serangkaian penelitian tentang sistem kultur sel donor, uji viabilitas, ukuran sel pada
kondisi konfluen dan starvasi serta uji aktivasi sel (reprograming) oosit resipien. Metode penelitian yang
digunakan adalah eksperimen laboratorium .Sel primer yang digunakan sebagai sel donor adalah sel
animal fetal fibroblast dilakukan kultur in vitro dalam kondisi tercapai konfluen dan dalam medium
kultur serum stan>asi. Sel donor dikultur (konsentrasi 8 - 9 x 104 cell/ml) dalam TCM 199 yang
disuplementasi dengan 10%FBS selama2-3 subkulture hingga tercapai kondisi yang stabil dan homogen
untuk dilakukan pemanenan sel. Kultur dilakukan dalam inkubator CO2 5 % dengan temperatur 38 °C.
Selanjutnya dilakukan tripsinasi dalam Dulbeccos PBS bebas ion Ca 2+ dan Mg2 yang mengandung 0.1 %
tripsin (w/v) (Sigma) dan 0.1 % (w/v) EDTA dan selanjutnya siap digunakan sebagai donor. Sampling
sejumlah sel donor ini kemudian dilakukan uji % sel hidup, ukuran sel dan fase pertumbuhan sel donor.
Sel donor kemudian diinsersikan pada sel oosit enukleasi dimana telah dilakukan kultur sebelumnya
secara in vitro pada fase metafase II (M-II). Data yang diamati adalah: tingkat konfluensi sel donor,
viabilitas sel, tingkat keberhasilan enukleasi, transfer inti dan aktivasi oosit resipien rekontruksi. Hasil
penelitian tahun pertama menunjukkan bahwa viabilitas sel donor fetal vibroblast masing masing adalah
78.30 + 2.89 % (standart 10 % FBS) dan 72.67 + 2.52 (serum starvasi pada subkultur pertama. Ukuran sel
donor adalah kecil (3-4 um : 27.97 - 28.82 %); ukuran sedang (5 - 6 urn: 45.65 - 46.6 % dan ukuran besar
23.78 - 24.54 %). Tingkat keberhasilan enukleasi sel resipien setelah konfirmasi dengan H-33342 adalah
sekitar 51.55 % dan menghasilkan keberhasilan injeksi intrasitoplasma sekitar 45.78 %. Aktivasi dengan
induksi buatan menggunakan ethanol dan Ca ionophore masih menghasilkan embrio cleavage yang
rendah yaitu sekitar 6.23 -10.29 %. Kesimpulan penelitian tahun pertama adalah: (1). metode
Intracytoplamic Direct Nuclear Injection (IDNI) dapat menghasilkan embrio rekonstruksi yang mengalami
cleavage. (2),Tingkat keberhasilan aktivasi oosit rekonstruksi yang masih rendah (6.23 - 10.29 %) bisa
ditingkatkan dengan menggunakan bahan induksi aktivasi yang lebih baik diantaranya dengan kombinasi
ethanol/Ca ionophore dengan bahan inhibitor fosforilasi. Disarankan (1). Perlu dilakukan penelitian
lanjut tentang metode aktivasi sel rekonstruksi dengan kombinasi bahan ethanol/Ca ionophore dengan
bahan-bahan inhibitor fosforilisasi seperti 6—DMAP dan Cycloheximide. (2). Perlu dilakukan analisis
selulerterjadinya kerusakan-kerusakan organel sitoplasma setelah dilakukan enukleasi, (3). Perlu
dilakukan analisis terjadinya apoptosis dini/lanjut pada sel donor yang digunakan
dalam penelitian.
Kata Kunci : Embrio Rekonstruksi, totipoten, graft, intra cyitoplasma injection
The Implementation Of Intracytoplasmic Direct Nuclear Injection Method For Producing
Embryonic Totipotent Cells As Graft
Abstract
The implementation of intracytoplasmic direct nuclear injection method for producing
embryonic totipotent cells as graft. The aims of the research are to produce tot potent cells resulted
from reconstructed embryos transferred using fetal fibroblast donor cells. Reconstructed embryo yielded
with intracytoplasm direct nuclear injection. In the future, totipotent cell are targeted as graft resources
for cells transplantation. Method used is experimental. Primer cell is animal fetal fibroblast cultured in
standard (10 % FBS) and serum starvation (0.5 % FBS). Cells culture done using CO2 incubator 5 % 30 oC.
Cells are cultured in 2 -3 passages and then using as donor cells after trypsinized with 0.1% trypsin-EDTA
(Sigma). Data observed are, cell growth, viability, cell morphology and size, enucleation rate and
injection rate and activation (cleavage) of reconstructed cells. Result of 1 "■ year result showed that
viability is 78.30 % (10 % FBS) and 72.67 % (-.5 % FBS). Cell size was dominated by medium size cell (5 - 6
urn) with about 45.65 % to 46.6 %). Meanwhile, enucleation rate is 51.55 % followed by 45. 78 % of
normal injection Using IDNI method. Low activation still achieved using ethanol and Ca ionophore
induction, ranged from 6.23 % - 10.29 %.It was concluded that IDNI can be use as method of
reconstructed embryo. Improvement of activation rate can be increased by addition of phosphorilation
inhibitors agent like 6-DMAP. It is necessarily to done research on improving of activation method,
analyze of celluler damage after enucleation and analysis of early and late apoptosis of donor cells.
Key words: Reconstructed Embryo, totipotent, graft, intra cytoplasm direct nuclear injectio