Kenapa normalisasi data analisis ekspresi gen penting untuk

17
Kenapa normalisasi data analisis ekspresi gen penting untuk memahami
fisiologi tanaman perkebunan
Analisis ekspresi gen dapat diukur secara akurat dan cepat dengan menggunakan teknik
Real-Time PCR. Evaluasi kritis terkait kebenaran data yang dihasilkan menjadi tantangan
para peneliti pengguna teknologi tersebut. Oleh sebab itu, normalisasi data merupakan
faktor penting, dimana diperlukan gen acuan untuk validasi data ekspresi. Aplikasi teknik
tersebut pada tanaman perkebunan telah digunakan untuk analisis debit tinggi.
Studi tentang profil ekspresi gen umumnya dilakukan dengan mengandalkan bioteknik
seperti Microarray dan Northern blot karena kemampuan menganalisis banyak gen secara
simultan atau aspek ekonomi [1]. Namun teknik Real-Time PCR atau yang sering disebut
Quantitative PCR (qPCR) dianggap yang paling akurat dan dapat diandalkan untuk validasi
data ekspresi yang diperoleh dari metode lain. Tidak diragukan lagi, keunggulan dari teknik
tersebut terdapat pada sensitivitas, deteksi reaksi, kecepatan analisis dan pengukuran yang
tepat dari suatu sampel [2]. Terlebih, tingkat ekspresi untuk beberapa gen acapkali sangat
kecil sehingga qPCR menjadi satu-satunya teknik yang dapat mendeteksi sejumlah kecil dari
transkrip mRNA. Tetapi jika Real-Time PCR diharapkan mencapai performa terbaiknya,
sangatlah penting untuk melakukan normalisasi terhadap data dan memvalidasi hasil
analisis.
Eksperimen menggunakan qPCR sering tidak dirancang dengan baik sehingga sukar untuk
dibuktikan keakuratannya. Peneliti yang tidak melakukan evaluasi kritis dalam aplikasi
teknik kuantifikasi transkrip tersebut akan menghasilkan data yang tidak reliable. [3]. Hal
tersebut nampaknya menjadi masalah penting dimana qPCR digunakan sebagai metode
validasi dari teknik lain. Sebagai contoh, permasalahan sering timbul dari perbedaan
kuantitas mRNA hasil ekstraksi diantara sampel dan performa dari qPCR itu sendiri [4].
Untuk meminimalisir pengaruh faktor-faktor tersebut, normalisasi data ekspresi gen wajib
diterapkan sebelum tingkat ekspresi sebuah gen pada waktu dan kondisi tertentu dapat
dipastikan.
Kenapa hal tersebut diperlukan? Secara prinsip, teknik ekspresi gen apapun berusaha untuk
menghitung kuantitas dari transkrip mRNA di dalam sebuah sampel biologis. Sebagaimana
diketahui, kuantitas tersebut ditentukan oleh aktivitas transkripsi yang mana kadarnya
berbeda untuk jaringan yang berbeda. Oleh karena itu, normalisasi ekspresi gen dari tiap
sampel harus dilakukan. Normalisasi transkrip mRNA umumnya dilakukan dengan
mengukur rasio dari transkrip mRNA target dan mRNA total. Namun karena lazimnya di
dalam sel semua mRNA merupakan subyek vaasai dan efisiensi yang tergantung pada sel,
kuantifikasi jumlah transkrip gen target dapat dilakukan dengan membandingkan kuantitas
dari transkrip gen yang relatif stabil di dalam sel, yaitu gen-gen housekeeping [5].
Gen-gen yang tergolong dalam kelompok housekeeping paling dikenal di literatur adalah
gliseraldehida-3-fosfat (GAPDH), β-aktin, protein ribosom (RPL), ubiquitin (Ubi), β-tubulin
(Tub), 18S RNA ribosom (18S rRNA) dan kinase fosfogliserat (PGK). Akan tetapi, meskipun
ekspresi dari gen-gen kelompok tersebut disinyalir konstitutif (terus-menerus), variasi kecil
dalam tingkat sel hingga jaringan dibuktikan masih terjadi [6,7]. Hal tersebut membuktikan
bahwa gen-gen tersebut sangat spesifik untuk spesies tanaman dan tidak dapat digunakan
secara umum pada spesies tanaman yang lain [8]. Oleh karena itu, validasi awal perlu
dilakukan ketika gen-gen housekeeping disarankan untuk digunakan sebagai gen acuan atau
calibrator pada spesies tanaman baru atau pada kondisi eksperimental baru.
www.ibriec.org | Desember 2014 | 2(2), 17-19
Riza Arief Putranto – Peneliti BPBPI
18
Tanaman perkebunan sebagai tanaman berkayu
cenderung memiliki konstitusi genom yang kompleks
dengan duplikasi gen yang rumit [10,11].
Normalisasi data ekspresi menggunakan gen acuan
telah dilakukan secara sistematis pada beberapa
laboratorium tingkat dunia. Hal tersebut bertujuan
untuk membedakan secara akurat ekspresi gen
spesifik dari famili multigenik. Dengan demikian,
hasil eksperimen tersebut dapat dipastikan
kebenarannya. Di sisi lain, analisis ekspresi tersebut
ditujukan untuk mengungkap fisiologi spesifik dari
tiap
spesies
tanaman
perkebunan
seperti
produktivitas karet pada tanaman karet [7], proses
embriogenesis somatik pada tanaman kelapa sawit
[12] dan ketahanan terhadap cekaman kekeringan
pada tanaman tebu [13].
Penggunaan analisis ekspresi gen pada tingkat lebih
lanjut dapat diaplikasikan untuk mengukur secara
empiris kuantitas total transkriptom (keseluruhan
gen) saat tanaman terserang penyakit. Grup peneliti
dari Malaysia telah menggunakan teknik ekspresi gen
dengan normalisasi data untuk mengukur total gen
yang terinduksi saat akar tanaman kelapa sawit
Gambar 1. Ilustrasi hasil analisis
terserang Ganoderma [14]. Penggunaan spesifik
ekspresi gen yang telah dinormalisasi
menggunakan gen acuan. Perbedaan analisis ekspresi gen pada sub-jaringan tertentu pun
ekspresi antar jaringan dapat diban- menghasilkan data yang baik setelah normalisasi.
Grup peneliti gabungan Indonesia dan Prancis telah
dingkan satu sama lain [9].
membuktikan ekspresi diferensial dari gen-gen
penginduksi perakaran pada jaringan akar tunggang, lateral ordo 1 dan ordo 2 pada tanaman
karet [9]. Hasil-hasil eksperimen yang akurat tersebut diperoleh dengan melakukan
normalisasi terhadap gen-gen housekeeping spesifik untuk jaringan tersebut (Gambar 1).
Hal ini membuktikan sekali lagi pentingnya normalisasi data ekspresi gen.
Saat ini, dengan bantuan software seperti GenormPLUS, NormFinder dan BestKeeper, peneliti
dapat memilih gen acuan secara tepat melalui analisis statistik dan skoring. Akan tetapi, cara
klasik menggunakan tabel Excel masih dapat diterima dalam publikasi internasional. Sistem
fisiologi dari suatu tanaman merupakan sistem yang tidak stabil dan berubah sesuai kondisi
lingkungan. Mengingat tanaman merupakan organisme sesil (tidak dapat bergerak), analisis
fisiologi wajib dilakukan dalam kontrol yang ketat. Dengan demikian, prediksi akhir
mengenai kondisi fisiologi tersebut dapat memberikan hasil yang dapat dipercaya.
Referensi
1. Mallona I, Lischewski S, Weiss J, Hause B, Egea-Cortines M (2010) Validation of
reference genes for quantitative real-time PCR during leaf and flower development
in Petunia hybrida. BMC Plant Biology 10: 4-4.
www.ibriec.org | Desember 2014 | 2(2), 17-19
Riza Arief Putranto – Peneliti BPBPI
19
2. Gachon C, Mingam A, Charrier B (2004) Real-time PCR: what relevance to plant studies?
Journal of Experimental Botany 55: 1445-1454.
3. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, et al. (2009) The MIQE
Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR
Experiments. Clinical Chemistry 55: 611-622.
4. Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A (2005) Real-time RT-PCR normalisation;
strategies and considerations. Genes Immun 6: 279-284.
5. Rebouças EdL, Costa JJdN, Passos MJ, Passos JRdS, Hurk Rvd, et al. (2013) Real time
PCR and importance of housekeepings genes for normalization and quantification of
mRNA expression in different tissues. Brazilian Archives of Biology and
Technology 56: 143-154.
6. Marum L, Miguel A, Ricardo CP, Miguel C (2012) Reference Gene Selection for
Quantitative Real-time PCR Normalization in Quercus suber. PLoS ONE 7: e35113.
7. Li H, Qin Y, Xiao X, Tang C (2011) Screening of valid reference genes for real-time RTPCR data normalization in Hevea brasiliensis and expression validation of a sucrose
transporter gene HbSUT3. Plant Sci 181: 132-139.
8. Remans T, Smeets K, Opdenakker K, Mathijsen D, Vangronsveld J, et al. (2008)
Normalisation of real-time RT-PCR gene expression measurements in Arabidopsis
thaliana exposed to increased metal concentrations. Planta 227: 1343-1349.
9. Putranto RA, Sanier C, Leclercq J, Duan C, Rio M, et al. (2012) Differential gene
expression in different types of Hevea brasiliensis roots. Plant Sci 183: 149-158.
10. Rahman AYA, Usharraj A, Misra B, Thottathil G, Jayasekaran K, et al. (2013) Draft
genome sequence of the rubber tree Hevea brasiliensis. BMC Genomics 14: 75.
11. Motamayor J, Mockaitis K, Schmutz J, Haiminen N, III D, et al. (2013) The genome
sequence of the most widely cultivated cacao type and its use to identify candidate
genes regulating pod color. Genome Biology 14: r53.
12. Chan P-L, Rose RJ, Abdul Murad AM, Zainal Z, Leslie Low E-T, et al. (2014)
Evaluation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Oil Palm Elite
Planting Materials Propagated by Tissue Culture. PLoS ONE 9: e99774.
13. Silva RLdO, Silva MD, Ferreira Neto J, Costa R, Nardi CHd, et al. (2014) Validation of
Novel Reference Genes for Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR in
Drought-Stressed Sugarcane. The Scientific World Journal 2014: 12.
14. Tee S-S, Tan Y-C, Abdullah F, Ong-Abdullah M, Ho C-L (2013) Transcriptome of oil
palm (Elaeis guineensis Jacq.) roots treated with Ganoderma boninense. Tree
Genetics & Genomes 9: 377-386.
www.ibriec.org | Desember 2014 | 2(2), 17-19
Riza Arief Putranto – Peneliti BPBPI