AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI AKTIF EKSTRAK METANOL

AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI AKTIF
EKSTRAK METANOL DAUN PEGAGAN (Centella asiatica L)
TERHADAP Staphylococus aureus
KARYA TULIS ILMIAH
OLEH
ALPIYAH NINGSIH
NIM 12.003
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN
PUTRA INDONESIA MALANG
JULI 2015
AKTIVITAS ANTIBAKTERI FRAKSI AKTIF
EKSTRAK METANOL DAUN PEGAGAN (Centella asiatica L)
TERHADAP Staphylococus aureus
KARYA TULIS ILMIAH
Diajukan kepada
Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang
untuk memenuhi salah satu persyaratan
dalam menyelesaikan program D III
bidang Farmasi
OLEH
ALPIYAH NINGSIH
NIM 12.003
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN
PUTRA INDONESIA MALANG
JULI 2015
LEMBAR PERSEMBAHAN
THANKS FOR ALL

ABSTRAK
Ningsih, Alpiyah. 2015. Aktivitas Antibakteri Fraksi Aktif Ekstrak Metanol Daun
Pegagan (Centella asiatica L) terhadap Staphylococus Aureus. Karya Tulis
Ilmiah. Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang.
Pembimbing Dra. Misgiati, A.Md., M.Pd.
Kata Kunci : Pegagan (Centella asiatica (L), aktivitas antibakteri, metode
Fraksinasi, Staphylococus aureus.
Pegagan (Centella asiatica (L) merupakan tanaman liar, yang dapat dimanfaatkan
sebagai tanaman obat. Masyarakat memanfaatkan daun pegagan sebagai obat batuk,
penambah nafsu makan dan penyembuh luka. Daun pegagan memiliki kandungan
yang bermanfaat sebagai antibakteri, senyawa yang diduga bersifat sebagai
antibakteri adalah senyawa triterpenoid. Penelitian sebelumnya, ekstrak daun pegagan
menunjukkan aktivitas terhadap bakteri E.coli, dalam ekstrak daun pegagan masih
berupa senyawa multi komponen, sehingga perlu dilakukan fraksinasi dari ekstrak
daun pegagan dengan menggunakan beberapa pelarut untuk mengetahui seyawa yg
mempunyai aktivitas optimal sebagai antibakteri. Proses fraksinasi menggunakan
beberapa pelarut yaitu n-heksan,etil asetat, butanol). Tujuan penelitian ini yaitu untuk
mengetahui aktivitas antibakteri fraksi aktif masing-masing pelarut terhadap aktivitas
bakteri Staphylococus aureus. Hasil penelitian uji aktivitas antibakteri menunjukkan
adanya perbedaan daya hambat yang signifikan dari masing-masing pelarut. Pelarut
yang optimal dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococus aureus yaitu
hasil fraksinasi menggunakan pelarut etil asetat dengan rata-rata daya hambat sebesar
1.786 cm, pelarut butanol memiliki daya hambat lebih kecil dibandingkan hasil
fraksinasi etil asetat yaitu sebesar 1.636 cm, sedangkan hasil fraksinasi dengan
pelarut n-heksan memiliki rata-rata daya hambat paling minimal yaitu sebesar 0.202
cm. Peneliti menyarankan menggunakan pelarut semi polar dalam proses ekstraksi
karena pelarut tersebut memilki daya hambat maksimal dalam menghambat
pertumbuhan Staphyolococus aureus.
i
ABSTRACT
Ningsih, Alpiyah. 2015. Antibacterial Activities Active Fraction Methanol Pegagan
Leaf Extract ( Centella asiatica L) On Staphylococus aureus. Scientific
Papper. Academy of Food and Pharmacy Analys Putra Indonesia Malang.
Supervisor by Dra. Misgiati, A.Md., M.Pd.
Keyword : Pegagan leaf (Centella asiatica L), antibacterial activities, fractionation
method, Staphylococus aureus.
Pegagan leaf (Centella asiatica L) can be used as a medicinal plant. People take
advantage of pegagan leaves as a cough medicine, appetite enhancer and wound
healing. The leaves pegagan contains useful as antibacterial compound is thought to
act as an antibacterial compound triterpenoids. Previous studies, pegagan leaf extract
shows activity against E. coli, the leaf extract of pegagan is still a multi-component
compound, so it needs to be done fractionation of extract using several solvents. The
process of this lab to determine the optimal solvent in inhibiting bacterial
Staphylococus aureus. The results of antibacterial activity test showed differences in
inhibition significant of each solvent. Optimal solvent in inhibiting the growth of
bacteria Staphylococus aureus that is the result of fractionation using a solvent ethyl
acetate with an average inhibition of 1,786 cm, solvent butanol have inhibitory
smaller than the result of fractionation of ethyl acetate in the amount of 1,636 cm,
while the results of fractionation with solvents n- hexane had an average of the most
minimal inhibition is equal to 0.202 cm.
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia yang telah diberikan,
sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah yang berjudul “Aktivitas
Antibakteri Fraksi Aktif Ekstrak Metanol Daun Pegagan (Centella asiatica (L)
terhadap Staphylococus Aureus ” tepat pada waktunya.
Adapun tujuan Karya Tulis Ilmiah ini adalah sebagai persyaratan untuk
menyelesaikan program D-III di Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra
Indonesia Malang.
Sehubungan dengan selesainya penulisan Karya Tulis Ilmiah ini, penulis
mengucapkan terima kasih kepada :
1.
Ibu Dr. Misgiati, A.Md., M.Pd. selaku Dosen Pembimbing.
2.
Ibu Dra. Wahyu Wuryandari, M.Pd. selaku Dosen Penguji.
3.
Ibu Ria Dewi Andriani S.Pt., MP, M.Sc. selaku Dosen Penguji.
4. Bapak dan Ibu Dosen beserta karyawan Akademi Analis Farmasi dan Makanan
Putra Indonesia Malang.
5.
Kedua orang tua yang memberikan doa dan motivasi.
6.
Teman-teman mahasiswa dan AKAFARMA yang telah memberikan bantuan
dan arahan secara langsung maupun secara tidak langsung.
iii
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa Karya Tulis Ilmiah ini masih memiliki
kekurangan. Oleh karena itu, kritik dan saran akan sangat diharapkan. Semoga Karya
Tulis Ilmiah ini dapat berguna dan bermanfaat.
Malang, Juli 2015
Penulis
iv
DAFTAR ISI
ABSTRAK……………………………………………………………………………i
KATA PENGANTAR………………………………………………………………iii
DAFTAR ISI..…………...……………………………………………………..…...iv
DAFTAR TABEL…………………………………………………………………...vi
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………….vii
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………………viii
BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ........................................................................................................ 1
1.2 Rumusan Masalah ................................................................................................... 4
1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................................... 4
1.4 Kegunaan Penelitian................................................................................................ 5
1.5 Asumsi Penelitian ................................................................................................... 5
1.6 Ruang Lingkup dan Keterbatan Penelitian ............................................................. 6
1.7 Definisi Istilah dan Singkatan ................................................................................. 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA................................................................................. 8
2.1 Tinjauan tentang Pegagan Centella asiatica (L) ..................................................... 8
2.2 Tinjauan tentang Antibakteri................................................................................. 13
2.3 Tinjauan tentang Staphylococus aureus ................................................................ 18
2.4 Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri ............................................................... 19
2.5 Kerangka Konsep .................................................................................................. 28
BAB III METODE PENELITIAN .......................................................................... 29
3.1 Rancangan Penelitian ............................................................................................ 29
3.2 Populasi dan Sampel Penelitian ............................................................................ 29
3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian ................................................................................ 29
v
3.4 Definisi Operasional Variabel ............................................................................... 30
3.5 Pengumpulan Data ................................................................................................ 31
3.6 Analisis Data ......................................................................................................... 35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………………...36
4.1 Persiapan Sampel………………………………..……………………………….36
4.2 Preparasi Daun Pegagan (Centella asiatica L)……………………………..........36
4.3 Persiapan Ekstrak...………………………………………………………………37
4.4 Hasil Proses Fraksinasi…………………………………………………………..38
4.5 Hasil Proses Identifikasi…………………………………………………………40
4.6 Identifikasi Staphylococus aureus..……………………………………………...42
4.7 Hasil Aktivitas Antibakteri Daun Pegagan terhadap Staphylococus aureus…….43
BAB V PENUTUP………………………………………………………………….45
5.1Kesimpulan………………………………………………………………….……45
5.2 Saran……………………………………………………………………………..45
DAFTAR RUJUKAN………………………………………………………………46
vi
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Kandungan senyawa Pegagan atau Centella asiatica (L)…………….....12
Tabel 3.1 Tabel Definisi Operasional…………………………………………..…..29
Tabel 4.1 Organoleptis Ekstrak……………………………….…………………….38
Tabel 4.2 Berat Rendemen………………………………………………………….38
Tabel 4.2 Proses Identifikasi………………………………………………………..41
Tabel 4.3 Hasil Pengamatan Zona Bening………………………………………….43
vii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Centella asiatica (L) ……....……….…………………………………..10
Gambar 2.2 Struktur Dasar Triterpenoid………...…………………………………..13
Gambar 2.3 Staphylococcus aureus………...……………………………………….18
Gambar 2.4 Struktur n-heksan……………………………………………………….24
Gambar 2.4 Struktur butanol..……………………………………………………….25
Gambar 2.4 Struktur etil asetat...…………………………………………………….26
Gambar 4.1 Bakteri Staphylococcus aureus dalam media MSA …………………...42
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Kunci Determinasi…………………………………………………….50
Lampiran 2. Perhitungan……………………………………………………………51
Lampiran 3. Diagram Alir………………………………………......………………52
Lampiran 4. Tabel Konstanta Dielektrikum Pelarut………………………………..54
Lampiran 5. Perhitungan Zona Bening……………………………………………..55
Lampiran 6. Hasil Perhitungan Menggunakan SPSS………….…………………...58
Lampiran 7. Proses Ekstraksi……………………………………………………….60
Lampiran 8. Proses Evaporasi……………………………………………………....61
Lampiran 9. Proses Fraksinasi………………………………………………………62
Lampiran 10. Hasil Uji Tabung……………..………………………………………63
Lampiran 11. Hasil Pengamatan Zona Bening………………..…………...………..64
ix
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pengobatan tradisional menggunakan tanaman berkhasiat obat sudah
diterapkan di Indonesia sejak dahulu. Tanaman berkhasiat obat ini telah banyak
digunakan sebelum pelayanan kesehatan formal dengan obat – obatan modern dikenal
masyarakat. Pemanfaatan tanaman berkhasiat obat semakin meningkat, hal ini
disebabkan adanya kecenderungan masyarakat untuk kembali ke alam. Obat yang
berasal dari tanaman dirasa mempunyai efek samping yang lebih rendah
dibandingkan obat – obatan modern, hal ini yang menyebabkan masyarakat kembali
menggunakan obat yang berasal dari bahan alam. Tanaman obat di Indonesia yang
beraneka ragam dapat dijadikan sumber metabolit sekunder yang dapat digunakan
sebagai bahan baku dalam pembuatan obat (Reniza, 2004).
Pegagan (Centella asiatica L) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat
yang telah lama digunakan sebagai obat tradisonal. Penggunaan Pegagan (Centella
asiatica L) di masyarakat daunnya dapat digunakan sebagai penambah nafsu makan,
peluruh air seni, pembersih darah, pengobatan pada disentri, lepra, sipilis, sakit perut,
radang usus, batuk, sariawan, dan dapat pula digunakan sebagai penyembuh luka
dengan cara membubuhkan daun segar atau daun yang dikeringkan setelah digiling
halus
padaluka
bakar
atau
luka
1
berdarah.
Sedangkan
getahnya
2
digunakan pada upaya pengobatan borok, nyeri dan cacingan. Ekstraknya digunakan
untuk pengobatan luka infeksi dan gangguan pembuluh darah vena, disamping itu
semua bagian tumbuhan dapat digunakan sebagai obat batuk, masuk angin, mimisan,
radang pada cabang paru-paru maupun disentri. Komponen senyawa yang terkandung
dalam Pegagan (Centella asiatica L) adalah senyawa glikosida triterpenoid
(asiatikosida, asam asiatat, asam madekasat), termasuk golongan asam triterpenik
pentasiklik dan glikosida (Martono, dkk 2010). Pegagan (Centella asiatica L) juga
mengandung beberapa senyawa asam lemak, seperti: asam palmitat, asam stearat,
asam linolenat, asam linoleat, dan asam askorbik serta mengandung senyawa flavon
seperti: quercitin, kaempferol, astragalin, alkaloid hydrocotylin, serta phytosterols,
stigmasterol dan sitosterol. Beberapa senyawa lainnya adalah tanin, asam amino,
vitamin B dan resin (Ismaini, 2011).
Menurut penelitian (Handayani, dkk 2010) ekstrak daun Pegagan (Centella
asiatica L) dapat menyembuhkan luka infeksi karena ekstrak Pegagan (Centella
asiatica L) mengandung suatu senyawa yang bermanfaat sebagai antibakteri, namun
belum diketahui senyawa apa yang bersifat sebagai antibakteri karena dalam ekstrak
mengandung
multi
komponen.
Menurut
penelitian
yang
dilakuakan
oleh
(Sulistyowati dan Widyastuti, 2008) diketahui senyawa yang diduga bersifat sebagai
antibakteri yaitu senyawa golongan triterpenoid. Sifat antibakteri telah diteliti oleh
(Reniza, 2004) dapat menghambat pertumbuhan bakteri E. coli. Oleh karena itu
adanya kandungan triterpenoid pada Pegagan (Centella asiatica L) perlu dilakukan
pengujian terhadap pertumbuhan bakteri yang dapat menginfeksi luka. Ekstraksi
daunPegagan (Centella asiatica L) dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
3
ekstrak kental daun
Pegagan (Centella asiatica L). Pelarut yang efektif untuk
mengoptimalkan ekstraksi daun Pegagan (Centella asiatica L) yaitu metanol.
Penggunaan pelarut metanol karena bersifat universal dimana dapat menarik senyawa
yang bersifat non polar, polar, semi polar dan memiliki titik didih yang rendah (65oC)
sehingga mudah di uapkan (Mora dan Fernando, 2012). Hasil ekstraksi kemudian
difraksinasi untuk memisahkan komponen golongan utama kandungan yang satu dan
kandungan yang lain berdasarkan perbedaan kepolaran, karena dari hasil ekstraksi
masih mengandung multi komponen, untuk itu perlu dilakukan proses fraksinasi
untuk memisahkan senyawa yang terkandung dalam daun Pegagan (Centella asiatica
L) yang memiliki sifat sebagai antibakteri. Pelarut yang digunakan adalah n-heksan,
etil asetat dan butanol karena berdasarkan nilai kepolarannya sesuai konstanta
dielektrikum. Pelarut n-heksan, etil asetat dan butanol memiliki konstanta
dielektrikum berturut – turut 1.89, 6.2 dan 17.8. semakin tinggi konstanta
dielektrikum maka semakin polar. Hasil fraksinasi dari masing – masing pelarut
selanjutnya diuji aktivitasnya terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus,
karena bakteri ini merupakan bakteri flora normal yang biasa menginfeksi pada
bagian luka terbuka.Untuk itu perlu dilakukan pengujian aktivitas antibakteri fraksi
aktif ekstrak metanol daun Pegagan (Centella asiatica L) terhadap pertumbuhan
bakteri Staphylococcus aureus.
4
1.2 Rumusan Masalah
Adapun perumusan masalah dalam penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Bagaimana aktivitas antibakteri hasil fraksinasi n-heksan daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
2. Bagaimana aktivitas antibakteri hasil fraksinasi etil asetat daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
3. Bagaimana aktivitas antibakteri hasil fraksinasi butanol daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
4. Apakah ada perbedaan aktivitas antibakteri hasil fraksinasi dari ketiga pelarut
terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan metode difusi
sumuran.
1.3 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Mengetahui aktivitas antibakteri hasil fraksinasi n-heksan daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
5
2. Mengetahui aktivitas antibakteri hasil fraksinasi etil asetat daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
3. Mengetahui aktivitas antibakteri hasil fraksinasi butanol daun Pegagan (Centella
asiatica L) terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan
metode difusi sumuran.
4. Mengetahui adakah perbedaan aktivitas antibakteri hasil fraksinasi dari ketiga
pelarut terhadap aktivitas bakteri Staphylococcus aureus dianalisis dengan metode
difusi sumuran.
1.4 Kegunaan Penelitian
Adapun manfaat dari penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Bagi mahasiswa
Penelitian ini dapat memberikan informasi dan pengembangan untuk
mengisolasi senyawa baru yang dapat bersifat sebagai antibakteri.
2. Bagi masyarakat
Sebagai pengetahuan terbaru tentang manfaat atau khasiat dari tumbuhan
Pegagan (Centella asiatica L)
6
1.5 Asumsi Penelitian
Adapun asumsi dari penelitian ini sebagai berikut.
1. Ekstrak daun Pegagan (Centella asiatica L) dapat menghambat pertumbuhan
bakteri E. coli.
2. Metode difusi sumuran dapat digunakan untuk mengetahui aktivitas
antibakteri ekstrak daun Pegagan (Centella asiatica L).
1.6 Ruang Lingkup dan Keterbatan Penelitian
Adapun ruang lingkup yang akan dilakukan dalam penelitian ini sebagai
berikut.
1. Melakukan ekstraksi daun Pegagan (Centella asiatica L), proses ekstraksi
tidak dilakukan replikasi
2. Melakukan fraksinasi ekstrak daun Pegagan (Centella asiatica L) dengan
pelarut n-heksan, etil asetat dan butanol
3. Melakukan pengujian aktivitas antibakteri dari hasil fraksinasi pelarut
terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus.
Adapun keterbatasan dalam penelitian ini sebagai berikut.
1. Menggunakan daun Pegagan (Centella asiatica L) yang masih segar
2. Pengujian dengan metode difusi sumuran hanya menggunakan bakteri
Staphylococcus aureus
7
1.7 Definisi Istilah dan Singkatan
Adapun definisi istilah dan singkatan dalam penelitain ini sebagai berikut.
1. Pegagan (Centella asiatica L) biasa disebut kaki kuda merupakan tanaman
liar yang berkhasiat obat, berbentuk seperti rumput, tersebar luas pada daerah
tropik seperti Indonesia.
2. Ekstrak merupakan sediaan sari pekat tumbuh – tumbuhan atau hewan yang
diperolehdengan cara melepaskan zat aktif dari masing – masing bahan obat
menggunakan pelarut yang sesuai.
3. Ekstraksi adalah proses penyarian konstituen dalam simplisia dengan
menggunakan cairan penyari yang sesuai dan metode yang tepat.
4. Fraksinasi adalah proses untuk memisahkan komponen yang satu dengan
komponen lain menggunakan corong pisah.
5. Fraksi aktif adalah sari atau cairan kental hasil fraksinasi ekstrak metanol
yang mengandung senyawa metabolit sekunder dan diperoleh dengan cara
menfraksinasi menggunakan beberapa pelarut menurut kepolarannya.
6. Metode difusi sumuran merupakan metode difusi agar yang digunakan untuk
mengetahui aktivitas antibakteri yang ditandai dengan adanya zona bening.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tinjauan tentang Pegagan (Centella asiatica L)
2.1.1 Klasifikasi Pegagan (Centella asiatica L)
Pegagan atau Centella asiatica L termasuk salah satu tumbuhan yang paling
banyak dipakai sebagai bahan ramuan obat tradisional. Sesuai dengan klasifikasi
pegagan termasuk dalam :
Kingdom
: Plantae
Sub kingdom : Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh)
Divisi
: Spermatophyta
Sub divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotiledonae
0rdo
: Apiales
Famili
: Apiaceae
Bangsa
: Umbilales
Marga
: Centella
Jenis
: Centella asiatica L
Nama lain Pegagan atau Centella asiatica L juga mempunyai nama lain
Pesequines Rumph. Sedangkan di Indonesia, penduduk lokal banyak yang
menyebutnya kaki kuda, terdapat variasi nama yang beragam di daerah Indonesia,
antara lain :
8
9
Makasar
: Pegaga
Jawa
:Pegagan, Gagan-gagan, Rendeng, Kerok batok (Hamidi, 2009)
Sedangkan di luar negeri, Pegagan (Centella asiatica L) juga dikenal dengan
beragam nama, diantaranya :
Inggris
: India penny wort
Tamil
: Vllari, Yoshanavalli, Chandaki, Pindeeri
India
: Mandookaparni
Bengali
: Tholkari
Arab
: Artniya-e-hindi
Malaya
: Kudakam
Cina
: Ji xue co
2.1.2
Morfologi Pegagan (Centella asiatica L)
Pegagan atau Centella asiatica L berbentuk herba tahunan, aromatik.
Batangnya sangat pendek, dari batang tumbuh geragih atau stolon yang melata
dipermukaan tanah dengan panjang 10-50 cm. Daun tunggal, tersusun dalam bentuk
roset yang terdiri dari 2-10 lembaran daun, kadang-kadang agak berambut. Tangkai
daun panjangnya sampai 40 cm. Selain daun berbentuk ginjal, lebar dan bundar
dengan garis tengah sampai 10 cm, pinggir daun beringgit dan bergerigi. Pangkal dari
tangkai daun melekuk ke dalam dan melebar seperti pelepah. Tulang daun
menjari.Akar bercabang. Bunga berbentuk payung tunggal, biasanya tersusun dari 3
bunga. Tangkai bunga panjangnya 5-50 mm, lebih pendek dari tangkai daun. Daun
pelindung berjumlah 2 dan panjangnya 3-4 mm berbentuk telur (Reniza, 2004).
10
Gambar 2.1 Centella asiatica L
2.1.3
Habitat dan Tempat Tumbuh Pegagan (Centella asiatica L)
Pegagan (Centella asiatica L) yang juga di sebut Hydrocotyle asiatica ini
tumbuh liar diketinggian1-2500 m dpl (diatas permukaan laut), bentuk tumbuhan
seperti rumput,tersebar luas pada daerah tropik dan subtropik pada penyinaran
matahariyang cukup atau pada naungan rendah yang subur, lokasi berkabut,
disepanjang sungai, di sela batu-batuan, padang rumput, halaman, dan ditepi jalan.
Centella asiatica L (Gambar 2.1) merupakan tumbuhan kosmopolit atau
memiliki daerah penyebaran yang sangat luas, terutama daerah tropis dan subtropis,
seperti Indonesia, Malaysia, Srilanka, Madagaskar dan Afrika.
Di Indonesia
tumbuhan ini terkenal dengan bermacam – macam nama sesuai daerah tempat
tumbuhnya. Pegagan merupakan tumbuhan iklim tropik yang tumbuh menjalar
mencapai 10 m. tumbuhan ini tumbuh subur pada ketinggian 100–2500 m di atas
permukaan laut, di daerah terbuka dan di tempat yang lembab atau terlindung, seperti
pematang sawah, tegalan, dan di bawah pohon (Mora dan Fernando, 2012).
11
2.1.4
Manfaat Pegagan (Centella asiatica L)
Penggunaan Pegagan (Centella asiatica L) di masyarakat daunnya dapat
digunakan sebagai penambah nafsu makan, peluruh air seni, pembersih darah,
pengobatan pada disentri, lepra, sipilis, sakit perut, radang usus, batuk, sariawan, dan
dapat pula digunakan sebagai penyembuh luka dengan cara membubuhkan daun
segar atau daun yang dikeringkan setelah digiling halus padaluka bakar atau luka
berdarah. Sedangkan getahnya digunakan pada upaya pengobatan borok, nyeri dan
cacingan. Ekstraknya digunakan untuk pengobatan luka infeksi dan gangguan
pembuluh darah vena, disamping itu semua bagian tumbuhan dapat digunakan
sebagai obat batuk, masuk angin, mimisan, radang pada cabang paru-paru maupun
disentri.
2.1.5
Komponen Senyawa Pegagan (Centella asiatica L)
Komponen senyawa yang terkandung dalam Pegagan (Centella asiatica L)
adalah senyawa glikosida triterpenoid (asiatikosida, asam asiatat, asam madekasat),
termasuk golongan asam triterpenik pentasiklik dan glikosida (Martono, dkk 2010).
Pegagan (Centella asiatica L) juga mengandung beberapa senyawa asam lemak,
seperti: asam palmitat, asam stearat, asam linolenat, asam linoleat, dan asam askorbik
serta mengandung senyawa flavon seperti: quercitin, kaempferol, astragalin, alkaloid
hydrocotylin, serta phytosterols, stigmasterol dan sitosterol. Beberapa senyawa
lainnya adalah tanin, asam amino, vitamin B dan resin (Ismaini, 2011). Salah satu
senyawa yang bersifat sebagai antibakteri adalah Triterpenoid.
12
Komposisi
Air
Protein
Lemak
Karbohidrat
Serat
Abu
Kalsium
Fosfor
Besi
Kalsium
Kandungan (g)
89.3
1.6
0.6
6.9
2.0
1.6
0.17
0.03
0.003
0.414
Tabel 2.1 Kandungan senyawa Pegagan atau Centella asiatica L
2.1.5.1 Triterpenoid Pegagan atau Centella asiatica L)
Triterpenoid merupakan golongan senyawa terbesar dalam kelas terpenoid
yang dibentuk oleh kerangka karbon, terdiri dari 6 unit isopren dan didalam
biositesanya diturunkan dari hidrokarbon C30 asiklik, yaitu skualen.Senyawa ini
berstruktur siklik yang rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehid, atau asam
karboksilat bersifat sedikit polar. Triterpenoid banyak berupa senyawa tak berwarna
dan titik lelehnya tinggi. Sebagian besar triterpenoid mempunyai 4 atau 5 cincin yang
bergabung dengan pola yang sama. Sedangkan gugus fungsinya tertentu, seperti
adanya ikatan rangkap, gugus keton, gugus asetoksi, cincin oksida atau lakton.
Triterpenoid tersebar luas di alam, pada tumbuhan maupun hewan baik dalam
bentuk bebas, ester maupun glikosidanya. Triterpenoid yang berasal dari tumbuhan,
umumnya mempunyai kerangka struktur pentasiklik sedangkan triterpenoid yang
berasal dari hewan mempunyai kerangka struktur tetrasiklik.
13
Gambar 2.2 Struktur dasar Triterpenoid
2.2 Tinjauan tentang Antibakteri
2.2.1
Pengertian Antibakteri
Antibakteri adalah zat yang dapat menghambat pertumbuhan. Dalam
penggolongannya antibakteri dikenal dengan antiseptik dan antibiotik. Berbeda
dengan antibiotik yang tidak merugikan sel-sel jaringan manusia, daya kerja
antiseptik tidak membedakan antara mikroorganisme dan jaringan tubuh. Namun
pada dosis normal praktis tidak bersifat merangsang kulit. Antibiotik adalah zat-zat
kimia yang dihasilkan oleh bakteri dan fungi, yang memiliki khasiat mematikan atau
menghambat pertumbuhan kuman.
Obat yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri penyebab
infeksi pada manusia dan harus memiliki toksisitas selektif yang tinggi. Sifat
antibiotik sebaiknya menghambat atau membunuh mikroorganisme patogen tanpa
merusak inang, bersifat bakterisid, tidak menyebabkan resistensi pada kuman, tidak
bersifat alergenik atau menimbulkan efek samping bila dipergunakan dalam jangka
waktu yang lama, larut di dalam air serta stabil.
14
2.2.2
Mekanisme Kerja Obat Antibakteri
2.2.2.1 Jenis antibakteri dibagi menjadi dua :
1.
Bakteri ostatik
Bahan antibakteri memiliki kemampuan untuk membunuh bakteri.Jika bahan
antibakteri dihilangkan, perkembangbiakan tidak berjalan kembali.
2.
Bakteri sidal
Bahan antibakteri memiliki kemampuan menghambat perkembangbiakan dari
bakteri. Jika bahan antibakteri dihilangkan, perkembangbiakan bakteri tidak berjalan
kembali.
2.2.2.2 Mekanisme kerja antibakteri adalah :
1. Menghambat sintesis dinding sel
Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan yaitu suatu kompleks polimer
mukopeptida (glikopeptida). Oleh karena tekanan osmotik dalam bakteri lebih tinggi
daripada di luar sel maka kerusakan dinding sel bakteri akan menyebabkan terjadinya
lisis.
2. Menghambat metabolisme sel
Bakteri membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya. Kuman patogen
harus mensintesis sendiri asam folat dari paraamino benzoat acid (PABA) untuk
kebutuhan hidupnya. Efek antibakteri bekerja menghambat sintesis asam folat atau
bersaing dengan PABA.
3. Mengganggu keutuhan membran sel
Membran sitoplasma mempertahankan bahan – bahan tertentu di dalam sel serta
mengatur aliran keluar masuknya bahan – bahan tertentu di dalam sel lain. Membran
15
memelihara integritas komponen – komponen seluler. Kerusakan pada membran ini
akan menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting dari dalam sel yaitu
protein, asam nukleat dan nukleotida. Efek antibakteri dalam merusak membran sel
dengan cara bereaksi dengan fosfat pada fosfolipid membran sel bakteri dan bereaksi
dengan struktur sterol sehingga mempengaruhi permeabilitas selektif membrane.
4. Menghambat sintesis protein sel
Untuk kehidupannya, sel bakteri perlu mensintesis berbagai protein.Sintesis
protein berlangsung di ribosom, dengan bantuan mRNA dan tRNA.Pada bakteri,
ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada sintesis protein, kedua komponen ini
akan bersatu pada pangkal rantai mRNA menjadi ribosom 70S.
5. Menghambat sintesis asam nukleat
DNA, RNA dan protein memegang peranan amat penting di dalam proses
kehidupan normal sel. Hal itu berarti bahwa gangguan apapun yang terjadi pada
pembentukan atau fungsi zat – zat tersebut dapat mengakibatkan kerusakan total pada
sel.
2.2.3
Tinjauan tentang Luka Infeksi
2.2.3.1 Pengertian Luka
Luka adalah suatu gangguan dari kondisi normal pada kulit dan luka juga
diartikan sebagian kerusakan kontinyuitas kulit, mukosa membran dan tulang atau
organ tubuh lain.
16
2.2.3.2 Komplikasi Penyembuhan luka
Komplikasi penyembuhan luka meliputi infeksi dan perdarahan yaitu:
a. Infeksi
Infeksi bakteri pada luka dapat terjadi pada saat trauma, selam pembedahan atau
setelah pembedahan.Gejala dari infeksi sring muncul dalam 2-7 hari setelah
pembedahan.Gejala akibat infeksi bisa berupa rasa nyeri, kemerahan dan bengkak di
sekeliling luka.
b. Pendarahan
Pendarahan dapat menunjukkan suatu pelepasan jahitan, sulit membeku pada
garis hajitan, dan infeksi. Hal tersebut bisa dengan menjaga balutan (luka di bawah
balutan) atau jika mungkin harus sering dilihat selama 48 jam pertama setelah
pembedahan dan tiap 8 jam setelah itu. Jika pendarahan berlebihan terjadi,
penambahan tekanan balutan luka steril mungkin diperlukan. Pemberian cairan dan
intervensi pembedahan mungkin diperlukan.
2.2.3.4 Pengertian Infeksi
Infeksi adalah adanya suatu organisme pada jaringan atau cairan tubuh yang
disertai
suatu
gejala
klinis
baik
lokal
maupun
sistemik.Infeksi
adalah
perkembangbiakan kuman yang merupakan bagian flora normal pada saluran cerna,
kulit dan lainnya. Penyakit infeksi dimulai saat mikroorganisme memasuki tubuh
inang dan selanjutnya bereproduksi atau bereplikasi.
17
2.2.3.5 Jenis-jenis infeksi bakteri
Jenis-jenis infeksi bakteri dibedakan menjadi dua yaitu :
a. Infeksi bakteri primer
Infeksi bakteri primer adalah infeksi yang terjadi pada kulit yang sehat dengan
manifestasi klinis yang khas dan biasanya disebabkan oleh satu jenis bakteri.Infeksi
bakteri primer pada kulit sering kali disebabkan oleh Staphylococcus dan
Streptococcus. Staphylococcus adalah suatu bakteri gram positif yang merupakan
kokus pathogen paling utama pada kulit. Kokus ini adalah gram positif yang
berbentuk bola dan bergerombol dalam bundel-bundel kecil, mudah tumbuh dalam
media biakan, dalam media padat, dalam 24 jam akan tumbuh koloni-koloni berkilat,
dan berwarna kekuningan dan besar.
b. Infeksi bakteri sekunder
Infeksi bakteri sekunder adalah infeksi yang terkelainan jadi pada bermacammacam kelainan kulit yang telah ada sebelumnya (seperti erosi, luka bakar, luka
sayat, dermatosin lain, infeksi virus dan infeksi jamur).
Infeksi dapat disebabkan oleh bermaca-macam bakteri. Manifestasi klinis yang
ditimbulkan tergantung pada kelainan kulit semula. Pada umumnya, infeksi bakteri
kulit sekunder ditandai oleh timbulkan reaksi peradangan tambahan dan oleh
keluarnya cairan dari luka.
18
2.3 Tinjauan tentang Staphylococus aureus
Staphylococcus aureus merupakan penyebab terjadinya infeksi yang bersifat
piogenik. Infeksi yang disebabkan oleh bakteri ini biasanya timbul dengan tandatanda khas yaitu
peradangan, nekrosis, dan pembentukan abses. Staphylococcus
aureus menghasilkan koagulase yaitu suatu protein mirip enzim yang dapat
menggumpalkan plasma yang mengandung oksalat atau sianat. Koagulase berikatan
dengan protombin dan mampu menyimpan fibrin pada permukaan Staphylococcus.
Klasifikasi Staphylococcus aureus
Kingdom
:Eubacteria
Filum
:Firmicutes
Kelas
:Schizomycetes
Ordo
:Eubacteriales
Famili
:Micrococaceae
Genus
:Staphylococcus
Spesies
:Staphylococcusaureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri golongan gram positif yang selnya
berbentuk bulat, terdapat tunggal, berpasangan dan dalam gerombol, tidak berkapsul,
tidak membentuk spora, aerobik atau fakultatif anaerobik (Ambarwati, 2007).
Gambar 2.3 Staphylococcus aureus
19
2.4 Metode Pengujian Aktivitas Antibakteri
Metode penentuan aktivitas antibakteri secara in vitro dapat dikelompokkan
dalamdua metode, yaitu :
1. Metode turbidimetri ( metode tabung )
Pada cara turbidimetri, digunakan medium agar cair dalam tabung reaksi.
Pengamatan dengan melihat kekeruhan yang terjadi akibat pertumbuhan bakteri.
Kadar antibakteri ditentukan dengan menggunakan spektrofotometer. Kelebihan cara
ini adalah lebih cepat dari cara difusi agar karena hasil dapat dibaca setelah 3 atau 4
jam setelah inkubasi.
2. Metode difusi ( metode lempeng )
Pada cara difusi agar digunakan media agar padat dan reservoir yang dapat
berupa cakram kertas, silinder atau cekungan yang dibuat pada media padat. Larutan
uji akan berdifusi dari pencadang ke permukaan media agar padat yang telah
diinokulasi bakteri. Bakteri akan terhambat pertumbuhannya dengan pengamatan
berupa
lingkaran
atau
zona
disekeliling
pencadang.
Faktor-faktor
yang
mempengaruhi metode difusi agar, yaitu :
a) Pradifusi, perbedaan waktu pradifusi mempengaruhi jarak difusi dari zat uji yaitu
difusi antar pencadang.
b) Ketebalan medium agar adalah penting untuk memperoleh sensitivitas yang
optimal. Perbedaan ketebalan media agar mempengaruhi difusi dari zat uji ke dalam
agar, sehingga akan mempengaruhi diameter hambat. Makin tebal media yang
digunakan akan makin kecil diameter hambat yang terjadi.
20
c) Kerapatan inokulum, ukuran inokulum merupakan faktor terpenting yang
mempengaruhi lebar daerah hambat, jumlah inokulum yang lebih sedikit
menyebabkan obat dapat berdifusi lebih jauh, sehingga daerah yang dihasilkan lebih
besar, sedangkan jika jumlah inokulum lebih besar maka akan dihasilkan daerah
hambat yang kecil.
d) Komposisi media agar, perubahan komposisi media dapat merubah sifat media
sehingga jarak difusi berubah. Media agar berpengaruh terhadap ukuran daerah
hambat dalam hal mempengaruhi aktivitas beberapa bakteri, mempengaruhi
kecepatan difusi antibakteri dan mempengaruhi kecepatan pertumbuhan antibakteri.
e) Suhu inkubasi, kebanyakan bakteri tumbuh baik pada suhu 370 C.
f) Waktu inkubasi disesuaikan dengan pertumbuhan bakteri, karena luas daerah
hambat ditentukan beberapa jam pertama, setelah diinokulasikan pada media agar,
maka daerah hambat dapat diamati segera setelah adanya pertumbuhan bakteri.
g) Pengaruh pH, adanya perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan
perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan jumlah molekul zat uji
yang mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri (Tina
Rostinawati, 2009).
2.4.1
Metode Ekstraksi
Ekstraksi atau penyarian adalah proses penarikan zat pokok yang diinginkan
dari bahan mentah dengan menggunakan pelarut yang dipilih agar zat yang
diinginkan larut (Ansel, 1989). Sedangkan menurut Departemen Kesehatan Republik
Indonesia (1986), ekstraksi merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif yang
semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut oleh
21
cairan penyari. Ekstraksi juga diartikan sebagai proses pemisahan zat yang terdapat
dalam sel yang ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan
penyari. Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif
dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan masa atau serbuk yang
tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan
(Depkes, 1995). Ekstrak kering harus mudah digerus menjadi serbuk (Depkes, 1979).
Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat bahan mentah
obat dan daya penyesuaian dengan metode ekstraksi dan kepentingan dalam
memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna dari obat. Sifat bahan
mentah merupakan faktor utama yang harus dipertimbangkan dalam memilih metode
ekstraksi. Pada kenyataannya sering digunakan kombinasi proses maserasi dan
perkolasi dalam mengekstraksi bahan mentah obat (Ansel, 1989). Pada fase ekstraksi,
komponen sel diambil dengan melarutkan pada cairan ekstraksi. Sebagian bahan aktif
secara tiba-tiba berpindah ke dalam bahan pelarut melalui suatu mekanisme
perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan cairan ekstraksi yang mulamula masih tanpa bahan aktif yang mengelilingi. Pada penelitian ini dilakukan proses
ekstraksi cara maserasi.
Terdapat beberapa metode ekstraksi antara lain cara dingin seperti maserasi dan
perkolasi serta cara panas seperti refluks, digesti dan infundasi.
22
2.4.1.1 Cara Dingin
1. Maserasi
Maserasi (macerace = mengairi, melunakkan) adalah cara ekstraksi yang
paling sederhana (Ansel, 1989). Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk
simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan
masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut karena adanya
perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif didalam sel dengan dengan yang diluar
sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar.
2. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna
(exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan.
2.4.1.2 Cara Panas
1. Refluks
Ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu
dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5.
2. Digesti
Digesti adalah maserasi kinetik (dengan permukaan kontinu) pada temperatur
yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada
temperatur 40-50º C.
23
3. Infundasi
Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya dilakukan untuk menyari
zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan nabati. Proses ini
dilakukan pada suhu 90º C selama 15 menit.
2.4.2
Metode Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan secara bertingkat berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu
dari nonpolar, semi polar, dan polar. Senyawa yang memiliki sifat non polar akan
larut dalam pelarut non polar, yang semi polar akan larut dalam pelarut semi polar,
dan yang bersifat polar akan larut kedalam pelarut polar. Fraksinasi ini umumnya
dilakukandengan menggunakan metode corong pisah. Corong pisah merupakan
peralatan laboratorium yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran antara dua fase pelarut yang memiliki massa jenis berbeda yang
tidak tercampur.
Ekstrak yang akan di fraksinasi dimasukkan ke dalam corong pisah dan
dicampur dengan pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya. Setelah itu corong pisah
dikocok.Setelah dikocok, akan terbentuk dua lapisan. Pelarut yang memiliki massa
jenis lebih tinggi akan berada di lapisan bawah, dan yang memiliki massa jenis lebih
kecil akan berada di lapisan atas. Senyawa yang terkandung dalam ekstrak nantinya
akan terpisah sesuai dengan tingkat kepolaran pelarut yang digunakan. Senyawa
akantertarik oleh pelarut yang tingkat kepolarannya sama dengan dengan senyawa
tersebut. Pelarut yang digunakan dalam proses fraksinasi adalah sebagai berikut :
24
1.
n-Heksan
Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia
C6H14 (isomer utama n-heksana memiliki rumus CH3(CH2)4CH3. Awalan heksmerujuk pada enam karbon atom yang terdapat pada heksana dan akhiran -ana
berasal dari alkana, yang merujuk pada ikatan tunggal yang menghubungkan atomatom karbon tersebut.n-heksan merupakan jenis pelarut non polar.
Gambar 2.4 Struktur n-heksan
Karakteristik n – heksana :
a. Nama lain
: caproyl hydride, hexyl hydride
b. Rumus molekul
: CH3(CH2)4CH3
c. Berat molekul
: 86,17 kg/mol
d. Warna
: berwarna
e. Titik lebur
: - 94ºC
f. Titik didih
: 69 (P = 1 atm)
g. Spesific gravity
: 0,659
h. Kelarutan
: dalam 100 bagian air : 0,014 (15ºC)
2. n-butanol
n-butanol adalah cairan dengan bau yang khas. Larut dengan semua pelarut
umum seperti alkohol, keton, aldehid, eter, glikol dan hidrokarbon aromatik dan
25
alifatik, denga titik didih sekitar117.6ºC dan titik leleh sekitar -89.9ºC. Hal ini kurang
padat dari pada air dengan berat jenis 0,8098 g/cm3 di 20ºC. Batas kelarutan dalam
air adalah sekitar 77g/L pada 20ºC. Nilai ini menunjukkan sangat larut dalam air.
Gambar 2.5 Struktur butanol
Karakteristik n-butanol
a. Nama lain
:butyl alcohol, butyl hydroxide
b. Rumus molekul
: CH-CH2-CH2-CH2OH
c. Berat molekul
: 74.12 g/mol
d. Titik lebur
: - 89.90C
e. Titik didih
: 117.60
f. Kelarutan
: sangat larut dalam air
3. Etil asetat
Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap),
tidak beracun, dan tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen
yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang
bersifat asam yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif seperti flor,
oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 3%, dan larut dalam air
hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih
tinggi. Namun, senyawa ini tidak stabil dalam air yang mengandung basa atau asam.
26
Gambar 2.6 Struktur etil asetat
Karakteristik etil asetat
a. Nama lain
:etil ester, ester asetat, ester etanol
b. Rumus molekul
: CH3CH2OC(O)CH3
c. Berat molekul
: 88.12 g/mol
d. Titik lebur
: - 83.60C
e. Titik didih
: 77.10
f. Kelarutan
: tidak stabil dalam air
2.4.3 Metode Difusi Sumuran
Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan metode
pengenceran. Disc diffusion test atau uji difusi disk dilakukan dengan mengukur
diameter zona bening (clear zone) yang merupakan petunjuk adanya respon
penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu senyawa antibakteri dalam ekstrak.
Syarat jumlah bakteri untuk uji kepekaan atau sensitivitas yaitu 105-108 CFU/ml.
Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan. Metode
difusi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu metode silinder, metode lubang atau
sumuran dan metode cakram kertas. Metode lubang atau sumuran yaitu membuat
lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri. Jumlah dan letak
lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian, kemudian lubang diinjeksikan dengan
27
ekstrak yang akan diuji. Setelah dilakukan inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati
untuk melihat ada tidaknya daerah hambatan di sekeliling lubang.
28
2.5
Kerangka Konsep
Daun Pegagan (Centella asiatica L)
Flavonid,
triterpenoid,asam
lemak, tanin, resin,
vitamin B
Kandungan Kimia
Antibakteri
Triterpenoid
Fraksinasi
n-heksan
Etil asetat
Aktivitas antibakteri
Pelarut optimal
Butanol
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan. Penelitian ini termasuk
penelitian eksperimen. Tahapan dari penelitian ini yaitu persiapan alat dan bahan,
selanjutnya proses ekstraksi, fraksinasi dan tahap akhir yaitu pengujian, pengamatan
dan analisi data.
3.2 Populasi dan Sampel Penelitian
3.2.1
Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah hasil fraksinasi ekstrak
metanol daun Pegagan (Centella asiatica L)
3.2.2
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 0.05 ml ekstrak
kental hasil fraksinasi dari masing – masing pelarut yang digunakan untuk pengujian
antibakteri.
3.3 Lokasi dan Waktu Penelitian
Adapun lokasi penelitian yaitu Laboratorium Farmakognosi dan Mikrobiologi
Putra Indonesia Malang dan waktu penelitian Februari 2015 sampai dengan selesai.
29
30
3.4 Definisi Operasional Variabel
Adapun definisi operasional dalam penelitian ini yaitu :
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah hasil fraksi aktif ekstrak metanol
daun Pegagan (Centella asiatica L)
2. Variabel terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah aktivitas bakteri Staphylococcus
aureus
Tabel 3.1 Tabel definisi operasional
Variabel
Variabel bebas :
Fraksi aktif
ekstrak metanol
daun Pegagan
(Centella
asiatica L)
Sub
Variabel
1. pelarut
n-heksan
2. pelarut
etil asetat
3. pelarut
butanol
4. residu
Variabel terikat
:
aktivitas bakteri
Staphylococcus
aureus
-
DOV
1.Hasil
fraksinasi
ekstrak
metanol
2.Hasil
fraksinasi dari
fraksi nheksan
3.Hasil
fraksinasi dari
fraksi etil
asetat
4. Residu hasil
fraksinasi
butanol
Kemampuan
masing
masing fraksi
ekstrak dalam
membunuh
bakteri
Alat
ukur
-
Hasil
ukur
-
Skala
ukur
Ordinal
indikator
1. Fraksi
kental nheksan
2.Fraksi kental
etil asetat
3.Fraksi kental
butanol
4. Residu hasil
fraksinasi
jangka
sorong
diameter
zona
bening
(cm)
Ordinal
adanya zona
bening
31
3.5 Pengumpulan Data
Adapun tahap pengumpulan data adalah sebagai berikut :
3.5.1
Tahap persiapan instrumen penelitian meliputi :
1. Alat
Alat-alat yang diperlukan yaitu seperangkat alat maserasi, rotary evaporator,
laminar air flow, spektrofotometri, corong pisah, autoclaf, incubator, blue tip,
mikro pipet, cawan petri, kawat ose, erlenmeyer, beacker glass, tabung reaksi,
rak tabung reaksi, kaki tiga, bunsen, kassa asbes, kertas coklat, botol coklat,
gelang karet, timbangan analitik, botol timbang, pisau, gunting, jangka
sorong, botol semprot.
2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Pegagan (Centella
asiatica L) segar yang diperoleh dari Materia Medika Batu, metanol, nheksan, butanol, etil asetat, alkohol, media agar NA (Nutrient Agar), media
MSA (Mannitol Salt Agar), NaCl 0,9%, CMC, H2SO4(p), FeCl, asam asetat,
logam Mg, HCl 2 N, aquades, bakteri Staphylococcus aureus.
3.5.2
Tahap determinasi tanaman Pegagan (Centella asiatica L)
1. Diamati morfologi tanaman kemudian mencocokkan ciri-ciri tanaman pada
literatur “FLORA”
3.5.3
Tahap penyiapan daun Pegagan (Centella asiatica L)
1. Tanaman Pegagan (Centella asiatica L) yang diperoleh diambil bagian
daunnya.
32
2. Daun yang telah dipisahkan dengan bagian tanaman yang lain dicuci sampai
bersih.
3.5.4
Tahap ekstraksi
1. Dirajang kecil-kecil daun pegagan yang telah dicuci agar penyerapan pelarut
lebih maksimal.
2. Ditimbang sebanyak 250 g kemudian direndam dengan menggunakan pelarut
metanol 96% sebanyak 1000 ml selama 5 hari.
3.Disaring ekstrak dan dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 60oC
dengan kecepatan 133 rpm.
4. Ditimbang ekstrak yang diperoleh dan ditentukan rendemennya.
3.5.5
Tahap fraksinasi ekstraksi
1. Ditimbang ekstrak kental daun pegagan (Centella asiatica L)
2. Dimasukkan ekstrak kental kedalam corong pisah.
3. Dilakukan proses fraksinasi dengan pelarut n-heksan 99,9% sebanyak 3 x 15
ml kedalam corong pisah.
4. Dikocok perlahan sampai terpisah sempurna, kemudian dipisahkan ekstrak
dan larutan.
5. Dilakukan proses fraksinasi hasil fraksi kental n-heksan 99,9% dengan pelarut
etil asetat 99,9% sebanyak 3 x 15 ml kedalam corong pisah.
6. Dikocok perlahan sampai terpisah sempurna, kemudian dipisahkan ekstrak
dan larutan.
7. Dilakukan proses fraksinasi hasil fraksi kental etil asetat 99,9% dengan
pelarut butanol 99,5% sebanyak 3 x 15 ml kedalam corong pisah.
33
8. Dikocok perlahan sampai terpisah sempurna dan didapatkan residu kental dari
hasil fraksinasi.
3.5.6
Tahap identifikasi dari masing – masing hasil fraksinasi
3.5.6.1 Identifikasi senyawa triterpenoid
1. Dipipet hasil fraksi dari masing – masing pelarut sebanyak 1 ml
2. Ditambahkan reagen lieberman burchard (dibuat dari asam sulfat pekat dan
asam asetat masing – masing 10 ml)
3. Diamati perubahan warna yang terjadi pada masing – masing fraksi. Reaksi
positif jika terjadi perubahan warna menjadi merah jingga atau ungu.
3.5.6.2 Identifikasi senyawa flavonoid
1. Diambil masing-masing hasil fraksinasi sebanyak 1 ml dan memasukkannya
ke dalam tabung reaksi.
2. Ditambahkan 2 – 3 butiran logam Mg dan 2 – 4 tetes laruta HCl 2 N. Reaksi
positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau jingga
3.5.6.3 Identifikasi senyawa fenol
1. Diambil masing-masing hasil fraksinasi sebanyak 1 ml dan memasukkannya
ke dalam tabung reaksi.
2. Ditambahkan masing-masing tabungdengan pereaksi FeCl. Reaksi positif
ditandai dengan adanya warna hijau, merah ungu, biru dan hitam.
3.5.7
Prosedur Pengujian Antibakteri
3.5.7.1 Pembuatan Media Agar Miring untuk Inokulum Bakteri
1. Ditimbang media agar (NA) sebanyak 0,46 g dilarutkan dalam 20 ml aquades
menggunakan erlenmeyer.
34
2. Dihomogenkan di atas penangas air sampai larut sempurna.
3. Dituangkan 5 ml ke dalam masing-masing 3 tabung reaksi dan ditutup dengan
aluminium foil.
4. Disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121ºC selama 15 menit, kemudian
dibiarkan pada suhu ruangan selama ± 30 menit sampai media memadat pada
kemiringan 30º.
3.5.7.2 Pembuatan Media Dasar Sumuran
Media dasar sumuran dibuat dengan cara :
1. Ditimbang media agar (NA) sebanyak 9.2 gram.
2. Dilarutkan dalam 400 ml aquades.
3. Dihomogenkan dan dipanaskan diatas penangas air sampai larut sempurna.
4. Disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit, kemudian
didinginkan sampai suhu ± 45-500C.
3.5.7.3 Pembuatan Suspensi Bakteri
1. Diambil biakan bakteri Staphylococus aureus dengan kawat ose sebanyak 1-2
lup.
2. Dimasukkan kedalam tabung reaksi berisi 10 ml NaCl 0.9% steril
3. Disesuaikan tingkat kekeruhan suspense yang terbentuk sesuai dengan
standart Mc.Farland 0.5 (1 x 108 CFU/ml). Selanjutnya mengukur tingkat
kekeruhannya dengan spektrofotometri UV – Vis pada panjang gelombang
580 nm hingga diperoleh transmitan 25%. Jika % transmitan kurang dari 25 %
maka ditambah NaCl steril sampai diperoleh hasil transmitan 25 %.
35
3.5.7.4 Pengenceran ekstrak
1. Ditimbang 0,2 g CMC dilarutkan dengan 20 ml aquades steril
2. Diambil ekstrak kental hasil masing-masing fraksinasi
3. Ditimbang ekstrak kental hasil fraksinasi n-heksan sebanyak 0,2 g dilarutkan
dalam 2 ml larutan CMC
4. Ditimbang ekstrak kental hasil fraksinasi etil asetat sebanyak 0,5 g dilarutkan
dalam 5 ml larutan CMC
5. Ditimbang ekstrak kental hasil fraksinasi n-butanol sebanyak 0,5 g dilarutkan
dalam 5 ml larutan CMC
3.5.7.5 Pembuatan Sumuran Lapisan Dasar dan Pengujian Antibakteri
1. Dituangkan 1 ml suspensi bakteri Staphylococus aureus ke dalam 15 cawan
petri.
2. Dicampurkan suspensi bakteri Staphylococus aureus dengan 15 ml media
agar NA dan didiamkan hingga memadat.
3. Dilubangi media yang telah padat dengan diameter 0,5 cm menggunakan pipa
sumuran untuk melubangi media secara aseptik sehingga terbentuk sumursumur.
4. Diberimasing-masing ekstrak kental hasil fraksinasi yang telah diencerkan
dengan larutan CMC sebanyak 50 μL (0,05 ml) pada lubang sumuran.
a. Diinkubasi pada suhu 370 C selama 20 – 24 jam.
b. Diamati zona bening disekitar lubang.
c. Dihitung diameter zona bening disetiap lubang dengan menggunakan jangka
sorong.
36
3.6 Analisis Data
Dalam penelitian ini analisa data yang dilakukan adalah dengan mengukur
zona bening yang terdapat pada sekitar lubang sumuran. Data hasil pengamatan
dianalisis menggunakan One Way Anova. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui
adanya perbedaan aktivitas antibakteri dari beberapa hasil fraksinasi ekstrak metanol
pegagan.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persiapan Sampel
4.1.1 Determinasi Pegagan ( Centella asiatica L )
Pegagan merupakan tanaman herba tahunan tanpa batang yang tumbuh
merayap dengan panjang 10-80 cm, helai daun tunggal, bertangkai panjang sekitar 515 cm berbentuk ginjal tepinya bergerigit, dengan penampang 1-7 cm tersusun dalam
roset yang terdiri atas 2-10 helai daun, kadang agak berambut. Bunga berwarna putih
atau merah muda. Tangkai bunga 5-50 mm. Buah kecil bergantung berbentuk lonjong
bau wangi dan rasa pahit (Reniza, 2004). Berdasarkan pengamatan determinasi
tanaman yang dilakukan dihasilkan kunci determinasi pada Lampiran 1 sehingga
diketahui bahwa pegagan tergolong family Apiaceae.
4.2 Persiapan Daun Pegagan (Centella asiatica L)
Pemilihan daun pegagan yang digunakan sebagai sampel yaitu dipilih daun
pegagan yang berkualitas baik. Daun yang digunakan yaitu daun segar yang tidak
terlalu muda dan tidak terlalu tua untuk mengoptimalkan senyawa yang terkandung
dalam daun pegagan, hal ini dikarena kandungan senyawa yang terdapat pada daun
tersebut lebih optimal.
37
38
4.3 Persiapan Ekstrak
Pegagan yang digunakan diperoleh dari Materia Medika Batu (MMB). Daun
segar yang digunakan ± 250 g kemudian dicuci bersih dan diiris secara melintang.
Proses ekstraksi dengan metode maserasi selama 5 hari, menggunakan pelarut
metanol sebanyak ± 1000 ml. Proses maserasi dipilih karena jika mengunakan cara
ekstraksi panas dikhawatirkan akan merusak senyawa yang terkandung dalam daun
pegagan. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus memilki potensi yang rendah
dalam mempengaruhi perubahan bentuk partikel senyawa, ekonomis serta mudah
diperoleh kembali dengan cara evaporasi. Pelarut metanol digunakan karena pelarut
tersebut merupakan pelarut universal yang bersifat mampu melarutkan hampir semua
senyawa metabolit sekunder baik yang bersifat nonpolar, semipolar, polar dan
metanol mampu mengisolasi lebih banyak senyawa fenolik dan tanin, selain itu
metanol memiliki titik didih yang rendah sehingga mudah diuapkan (Nurdin M, dkk
2010) Pada proses maserasi, sampel mengalami pemecahan dinding sel dan
membrane sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam di luar sel sehingga metabolit
sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut atau terjadi proses
difusi dan melarutkan senyawa – senyawa yang memilki kepolaran yang sama. Hasil
maserasi tersebut diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan suhu 600C dan
kecepatan 133 rpm hal ini bertujuan untuk menguapkan pelarut. Proses pengentalan
dilanjutkan menggunakan water bath karena ekstrak yang diperoleh belum pekat.
Hasil ekstrak kental dan perhitungan rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada
Lampiran 2. Hasil ekstrak yang diperoleh kemudian diuji secara organoleptis dapat
dilihat pada tabel 4.1 sedangkan berat rendemen dapat dilihat pada tabel 4.2
39
Hasil ekstrak metanol masih terdapat berbagai kelompok senyawa metabolit
sekunder sehingga perlu dilakukan pemisahan senyawa melalui proses fraksinasi.
Pelarut yang digunakan mempengaruhi jenis senyawa yang terekstrak.
Tabel 4.1 Organoleptis Ekstrak
Bentuk
Kental
Bau
Khas daun
Warna
Hijau
Hasil uji organoleptis ekstrak daun pegagan menghasilkan bentuk ekstrak
yang kental, berwarna hijau dan berbau khas daun.
Tabel 4.2 Berat Rendemen
Berat awal
Berat ekstrak
Berat rendemen
250 gram
21,3435 gram
8,5374%
4.4 Hasil Proses Fraksinasi
Proses fraksinasi digunakan 3 jenis pelarut yaitu n-heksan, etil asetat, dan
butanol dengan konstanta dielektrikum berturut – turut 1.89, 6.2 dan 17.8. Tujuan
digunakannya pelarut n-heksan untuk mengikat senyawa nonpolar dari ekstrak daun
pegagan, mudah diperoleh dan n-heksan juga volatil karena memilki titik didih yang
rendah yaitu 690C sehingga mudah diuapkan dan merupakan pelarut dengan
penggunaan paling luas dalam mengekstraksi minyak dan lemak yang berasal dari
tumbuhan. Pemilihan pelarut etil asetat digunakan untuk menarik senyawa yang
bersifat semipolar. Pelarut semipolar dipilih etil asetat karena lebih mudah diperoleh
40
dan lebih murah dibandingkan pelarut semipolar yang lain, mudah menguap tidak
toksik dan tidak higroskopis, dalam industri farmasi pelarut ini memilki peran yang
penting sebagai pelarut untuk membuat konsentrasi serta pemurnian antibiotik
(Prathima, dkk 2013). Pelarut butanol digunakan untuk menarik senyawa bioaktif
yang terdapat dalam daun pegagan yang bersifat polar dan dapat dijenuhkan dengan
air.
Proses fraksinasi pada pengerjaan awal dilakukan dengan menggunakan
pelarut non polar (n-heksan), hal ini dikarenakan jika pada pengerjaan awal
digunakan pelarut polar, maka dikhawatirkan adanya senyawa non polar yang ikut
terlarut, sebagaimana kita ketahui bahwa pelarut polar, selain mampu melarutkan
senyawa polar juga mampu melarutkan senyawa non polar. Dalam proses fraksinasi
menggunakan ± 15 gram ekstrak kental dan pelarut masing – masing sebanyak 15 ml
dan fraksinasi dilakukan secara 3x sehingga diperlukan masing – masing pelarut
sebanyak 45 ml. Proses fraksinasi menggunakan corong pisah, tahap ini dilakukan
sesuai tingkat kepolaran dari masing – masing pelarut. Pertama ekstrak kental
difraksinasi menggunakan pelarut nonpolar yaitu n-heksan dan dikocok searah hingga
homogen, sesekali membuka tutup corong pisah untuk mengeluarkan udara dari hasil
pengocokan. Dipisahkan sehingga terlihat 2 lapisan dan diambil lapisan yang atas
yang merupakan hasil dari fraksinasi n-heksan, sedangkan lapisan yang kedua adalah
fraksi metanol karena metanol memiliki massa jenis yang lebih besar. Hasil rendemen
fraksi n-heksan diperoleh sebanyak 0,2084 g setelah dikentalkan menggunakan water
bath. Hasil fraksi metanol kemudian difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat
dikocok perlahan sampai terbentuk 2 lapisan, diambil lapisan bawah sebagai hasil
41
dari fraksinasi etil asetat karena massa jenis etil asetat lebih besar daripada massa
jenis metanol dan diperoleh rendemen fraksi etil asetat sebanyak 5,9984 g setelah
dikentalkan menggunakan water bath. Pelarut terakhir yang digunakan untuk
fraksinasi yaitu n-butanol kemudian dikocok perlahan, namun tidak terbentuk 2
lapisan karena semua larut dalam pelarut n-butanol hal ini dikarenakan senyawa polar
lebih terkonsentrasi pada fraksi ini diduga karena sifat kepolaran butanoldan metanol
hamper sama sehingga tidak diperoleh residu dari hasil fraksinasi dan diperoleh
rendemen sebanyak 2,492 g setelah dikentalkan menggunakan water bath. Hasil
fraksi dari ketiga pelarut diketahui bahwa pelarut etil asetat menghasilkan rendemen
paling banyak hal ini diduga adanya golongan polifenol yang memiliki berat molekul
yang sama dengan pelarut etil asetat (Nur dan Astawan, 2011). Pelarut etil asetat
cocok untuk mengekstraksi senyawa golongan fenol (Rohman, dkk 2006). Dari
proses fraksinasi didapatkan 3 ekstrak dari masing – masing pelarut yang kemudian
digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri.
4.5 Hasil Proses Identifikasi Fraksi Aktif
Proses identifikasi fraksi aktif yang dilakukan adalah hasil fraksi etil asetat
dan butanol, sedangkan fraksi n-heksan tidak dilakuakn uji identifikasi karena
diperoleh
fraksi
yang
sedikit.
Identifikasi
dilakukan
menggunakan
uji
tabung.Identifikasi ini dilakukan untuk menguji senyawa yang terkandung dalam
hasil fraksinasi.
Tabel 4.2 Proses Identifikasi
42
Pereaksi
Literatur
Uji Fenol
Sampel + FeCl
Hijau, merah
ungu, atau biru
sampai hitam
Merah jingga
atau ungu
Uji Triterpenoid
Sampel + Liberman
burchard (asam
sulfat P + asam
asetat)
Uji Flavonoid
Sampel + 2-3 butir
logam Mg dan 2-4
tetes HCl
Merah atau
jingga
Pengamatan fraksi
etil asetat
Hitam
Pengamatan fraksi
butanol
Biru kehitaman
Jingga
Ungu
Tidak terjadi
perubahan warna
Tidak terjadi
perubahan warna
Pertama dilakukan uji fenol yaitu dengan cara memasukkan masing-masing
hasil fraksinasi butanol dan etil asetat sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi dan
menambahkan pereaksi FeCl. Hasil dari kedua fraksi menunjukkan reaksi yang
positif, fraksi etil asetat ditandai dengan perubahan warna menjadi hitam hal ini
karena adanya golongan polifenol yang memiliki berat molekul yang sama dengan
pelarut etil asetat sedangkan fraksi butanol menunjukkan hasil positif yaitu terjadi
perubahan warna menjadi biru kehitaman. Kedua fraksi mengandung senyawa
fenolik. Selanjutnya dilakukan uji untuk mengidentifikasi adanya senyawa
triterpenoid dengan menggunakan reagen Lieberman Burchard yaitu dengan
menambahkan 3 tetes larutan asam sulfat pekat dan 3 tetes larutan asam asetat, hasil
dari fraksi butanol menunjukkan reaksi yang positif yaitu dengan adanya perubahan
warna menjadi ungu kehitaman hal ini menunjukkan bahwa hasil fraksi butanol
mengandung senyawa triterpenoid sedangkan hasil fraksi etil asetat menunjukkan
43
hasil positif dengan adanya perubahan warna menjadi merah jingga hal ini
menunjukkan bahwa hasil fraksi etil asetat mengandung senyawa triterpenoid.
Identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan menambahkan logam Mg
dan 2 – 4 tetes laruta HCl 2 N pada hasil fraksi butanol dan etil asetat, keduanya
menunjukkan reaksi yang negatif karena tidak terjadi perubahan warna menjadi
merah. Hal ini menunjukkan bahwa hasil fraksi butanol dan etil asetat tidak
mengandung senyawa flavonoid.
4.6 Identifikasi Bakteri Staphylococus aureus
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengancara pewarnaan. Bakteri
Staphylococus aureusmerupakan bakteri gram positif yang selektif pada media MSA.
Dalam praktikum ini dilakukan identifikasi bakteri dengan cara menumbuhkan
bakteri Staphylococus aureus pada media MSA dapat dilihat pada Gambar 4.1 Dari
gambar dibawah dapat dilihat bakteri Staphylocucus aureus tumbuh baik pada media
MSA ditandai dengan tumbuhnya bakteri yang berwarna kuning keemasan, hal ini
dkarenakan kemampuan bakteri Staphylococus aureus dalam memfermentasi
mannitol yang terdapat pada media Mannitol Salt Agar.
Gambar 4.1 Bakteri Staphylococus aureuspada media MSA
44
4.7 Hasil Aktivitas Antibakteri Fraksi Aktif Ekstrak Daun Pegagan terhadap
Staphylococus aureus
Hasil pengamatan daya hambat dari masing – masing hasil fraksinasi ekstrak
daun pegagan terhadap aktivitas bakteri Staphylococus aureus.Uji aktivitas
antibakteri dilakukan dengan melihat data yang diperoleh dari pengamatan luas zona
hambat menggunakan metode sumuran.
4.3 Tabel Hasil Pengamatan Zona Bening
Fraksi
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3
Rata-rata (cm)
SD
(cm)
(cm)
(cm)
n-heksan
0,240
0,168
0,200
0,202
0,360
Etil asetat
1,730
1,830
1,800
1,786
0,513
Butanol
1,670
1,640
1,600
1,636
0,351
Berdasarkan data zona hambat diatas diperoleh zona hambat tekecil yaitu dari
fraksi n-heksan dengan rata-rata zona hambat 0,202 cm dan zona hambat terbesar
yaitu fraksi etil asetat dengan rata-rata sebesar 1,786 cm. Dari data hasil perhitungan
rata-rata zona hambat kemudian data dianalisis menggunakan analisis spss One Way
Anova versi 16 diperoleh nilai p = 0,000 (p < 0,05), artinya terdapat perbedaan yang
signifikan antar perlakuan tersebut yaitu perlakuan fraksi n-heksan, etil asetat dan
butanol. Fraksi yang paling optimal dalam menghambat bakteri Staphylococus aureus
yaitu dengan menggunakan pelarut etil asetat, hal ini dikarenakan senyawa yang
dapat menghambat bakteri bersifat semi polar dengan konstanta dielektrikum 6,2
senyawa yang bersifat antibakteri yaitu triterpenoid dengan mekanisme merusak
45
dinding sel bakteri, sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococus
aures paling maksimal.
Hasil fraksi dari pelarut butanol memiliki daya hambat lebih kecil yaitu
sebesar 1,636 cm dibandingkan fraksi etil asetat sebesar 1,786 cm, hal ini
dikarenakan senyawa yang larut dalam pelarut butanol merupakan senyawa polar
dengan konstanta dielektrikum 17,8 dan dapat menghambat bakteri cukup baik
namun tidak maksimal. Hasil fraksi dengan pelarut n-heksan memilki zona hambat
rata-rata paling minimal hal ini disebabkan karena senyawa yang bersifat antibakteri
cenderung bersifat semi polar dan polar sehingga hasil fraksi menggunakan pelarut
nonpolar seperti n-heksan dengan konstanta dielektrikum 1,89 mempunyai daya
hambat paling minimal dalam menghambat pertumbuhan bakteri.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pengolahan data diatas dapat disimpulkan
1. Hasil fraksinasi yang paling optimal yaitu fraksi etil asetat dengan rata-rata
zona hambat sebesar 1,786 cm.
2. Hasil fraksinasi menggunakan pelarut butanol memiliki rata-rata 1,636 cm
lebih kecil dibandingkan hasil fraksinasi pelarut etil asetat.
3. Hasil fraksinasi dengan pelarut n-heksan memiliki rata-rata daya hambat
paling minimal yaitu sebesar 0,202 cm.
4. Daya hambat dari ketiga pelarut memilki perbedaan yang signifikan dalam
menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococus aureus.
5.2 Saran
Berdasarkan hasil pengamatan yang didapatkan, sebaiknya dilakukan
penelitian lebih lanjut yaitu menggunakan pelarut semi polar dalam proses ekstraksi
karena pelarut tersebut memilki daya hambat maksimal dalam menghambat
pertumbuhan Staphyolococus aureus dan dapat dilanjutkan untuk mengisolasi
senyawa yang bersifat sebagai antibakteri menggunakan pelarut semi polar.
46
DAFTAR RUJUKAN
Ambarwati. (2007). Efektivitas Zat Antibakteri Biji Mimba ( Azadirachta Indica )
Untuk Menghambat Pertumbuhan Salmonella Thyposa Dan Staphylococcus
Aureus. Biodiversitas, Journal Of Biological Diversity, 8(4), 320–325.
Doi:10.13057/Biodiv/D080415
Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi Keempat. Jakarta:
Universitas Indonesia (UI-Press).
Departemen Kesehatan. 1979. Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Departemen
Kesehatan Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan. 1986. Sediaan Galenik. Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen
Kesehatan Republik Indonesia.
Departemen Kesehatan. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat.
Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1, 9-11.
Fajariah, Ika Nur. (2009). Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol
Kayu Secang ( Caesalpinia Sappan L .) Terhadap Staphylcoccus Aureus Dan
Shigella Dysenteriae Serta Bioautografinya. Surakarta.
Hamidi, B. L. (2009). Efek Pemberian Ekstrak Ethanol Pegagan (Centella Asiatica)
Terhadap Kinerja Tikus (Rattus Novergicus) Dalam Maze Radial Delapan
Lengan Pasca Restraint Stres.
47
48
Handayani, W., Rakhman, Y., Maulidawati, N. H., Purbaningsih, S., &Rahayu, L.
(2010). Induksi Kalus Dan Optimalisasi Kalus Dari Tangkai Daun Centella
Asiatica L Urban, (September).
Ismaini, L. (2011). Aktivitas Antifungi Ekstrak ( Centella Asiatica (L. ) Urban
Terhadap Fungi Patogen Pada Daun Anggrek ( Bulbophyllum Flavidiflorum
Carr. ), 14(D), 47–50.
Martono, B., Ghulamahdi, M., dan Darusman, L. K. (2010). Kriteria Penanda Seleksi
Produktivitas Terna Dan Asiatikosida Pada Pegagan ( Centella Asiatica ( L .)
Urban ), 16(1), 12–19.
Mora, E., dan Fernando, A. (2012). Optimasi Ekstraksi Triterpenoid Total Pegagan (
Centella Asiatica ( Linn .) Urban ) Yang Tumbuh Di Riau, 1(September), 11–16.
Nur, A.M., Astawan, M. 2011. Kapasitas Antioksidan Bawang Dayak (Eleutherine
palmifolia) Dalam Bentuk Segar, Simplisia dan Keripik, Pada Pelarut Nonpolar,
Semipolar dan Polar. Skripsi. Bogor: Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Institut Pertanian Bogor.
Nurdin M., F.M Titin Supriyanti. 2010. Penentuan Pelarut Terbaik dalam Mengekstraksi
Senyawa Bioaktif dari Kulit Batang Artocarpus heteroppylus. Jurnal Sains dan
Teknologi Kimia. universitas Pendidikan Indonesia.
49
Prathima, A., et al. (2013). Studies On Struktural Properties Of The Binary Mixtures Of
Pharmaceutical Intermediates Trough Dielectric Investigation. Internasional Jurnal
of Pharmaceutical Sciences and ReserchVol.4(7): 2753-2760.
Rahman, M., Habib, R., Hasan, R., Islam, A.M.T., Khan, I.N. 2012. Comparative
Antioxidant Potential Of Different Extracts Of Flacourtia Jangomas Lour Fruits.
Asian Journal of pharmaceutical and Clinical Research. 5(1):73-75.
Reniza, A. W. (2004). Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Asiatikosida Dari Pegagan
(Centella Asiatica L. Urban) Sebagai Senyawa Antibakteri.
Rohman, A., Riyanto, S., Utari, D. 2006. Aktivitas Antioksidan, Kandungan Fenolik
Total dan Kandungan Flavonoid Total Ekstrak Etil Asetat Buah Mengkudu Serta
Fraksi-fraksinya. Jurnal MFI. 17(3), 136-142.
Sulistyowati, dan Widyastuti, A. (2008). Pemanfaatan Centella Asiatica Sebagai
Bahan Antibakteri Salmonella Typhi.
Tina Rostinawati. (2009). Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella
(Hibiscus Sabdariffa L.) Terhadap Escherichia Coli, Salmonella Typhi Dan
Staphylococcus Aureus Dengan Metode Difusi Agar.
Van Steenis, CGGJ.2008.FLORA. Pradnya Paramita, Jakarta.
50
Lampiran 1. Kunci Determinasi
Kunci Determinasi Pegagan ( Centella asiatica L )
1b-2b-3b-4b-6b-7b-9b-10b-11b-12b-13b-14b-16a-239b-243b-244b-248b-249b-250b266b-267a-268a-269a-2b-3.
51
Lampiran 2. Perhitungan
1.
96
100
Perhitungan metanol 96%
x 1000 ml = 960 ml
Dibuat dengan cara mencampur 960 ml metanol dan 40 ml aquades
2.
Pembuatan media NA 400 ml
0,46 g dalam 20 ml aquades
0,46 𝑔
20 𝑚𝑙
3.
x 400 ml = 9,2 g
Perhitungan rendemen
21,3435 gram
250 𝑔
4.
x 100% = 8,5374%
Gambar ekstrak kental
52
Lampiran 3. Diagram Alir
1.
Persiapan sampel
Daun pegagan segar
Ditimbang 250 g
Dicuci bersih
Diiris secara melintang
2.
Tahap maserasi dan evaporasi
Dimasukkan sampel dalam botol coklat
Ditambahkan 1 L pelarut metanol
Didiamkan selama 5 hari
Disaring
Diuapkan larutan dengan alat evaporator
Diperoleh ekstrak kental
53
3.
Tahap fraksinasi
Dimasukkan ekstrak kental dalam corong pisah
Difraksinasi dengan pelarut bertutut – turut
n-heksan
etil asetat
butanol
Diperoleh ekstrak hasil masing-masing fraksi
4.
Tahap Perlakuan Uji Antibakteri
Dikentalkan ekstrak masing-masing fraksi dengan CMC
Dimasukkan 0,05 ml ekstrak masing-masing fraksi ke dalam cawan berisi media
dan bakteri Staphylococus aureus dengan metode sumuran
Didiamkan 24 jam
Diamati zona bening
54
Lampiran 4. Tabel Konstanta Dielektrikum Pelarut
Pelarut
n-heksan
Petroleum eter
n-oktan
n-dekan
n-dodekan
Sikloheksan
1,4 dioksan
Benzene
Toluene
Furan
Asam propanoat
Dietileter
Kloroform
Butilasetat
Etil asetat
Asam asetat
Metil asetat
Tetrahidrofuran
Metilenklorida
t-butanol
Piridin
2-butanol
n-butanol
2-propanol
1-propanol
Aseton
Etanol
Metanol
Asam formiat
Air
Konstanta
Dielektrikum
1,89
1,90
1,95
1,99
2,01
2,02
2,21
2,28
2,38
2,95
3,30
3,34
4,81
5,01
6,02
6,15
6,68
7,58
9,08
10,09
12,30
15,80
17,80
18,30
20,10
20,70
24,30
33,60
38,50
80,40
Tingkat kelarutan dalam air
Tidak larut
Sedikit
Misible
TL
TL
TL
TL
TL
M
S
TL
TL
M
S
S
S
S
S
S
S
S
S
M
M
S
S
M
S
M
M
M
M
*misible artinya dapat bercampur dengan air dalam berbagai proporsi.
Non polar
Polar
55
Lampiran 5. Perhitungan Zona Bening
Rumus
(AD − ad) + (BE − be) + (CF − cf)
3
Keterangan :
1. Lingkaran (abcdef) : lubang yang berisi ekstrak dari masing-masing fraksi
(0,5 cm)
2. Lingkaran (ABCDEF) : zona hambat pertumbuhan
1. Pelarut n-Heksan
Replikasi 1 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(0,8−0,5) + (0,7−0,5) + (0,7−0,5)
3
= 0,24 cm
Replikasi 2 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(0,7−0,5) + (0,8−0,5) + (0,5−0,5)
= 0,168 cm
3
56
Replikasi 3 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(0,9−0,5) + (0,5−0,5) + (0,7−0,5)
3
= 0,2 cm
2. Pelarut etil asetat
Replikasi 1 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2,2−0,5) + (1,5−0,5) + (3−0,5)
3
= 1,73 cm
Replikasi 2 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2,5−0,5) + (1,5−0,5) + (3−0,5)
3
= 1,83 cm
Replikasi 3 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2,5−0,5) + (1,5−0,5) + (2,9−0,5)
= 1,80 cm
3
57
3. Pelarut butanol
Replikasi 1 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2−0,5) + (1,3−0,5) + (3,2−0,5)
3
= 1,67 cm
Replikasi 2 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2−0,5) + (1,5−0,5) + (2,9−0,5)
3
= 1,64 cm
Replikasi 3 =
=
(AD−ad) + (BE−be) + (CF−cf)
3
(2−0,5) + (1,3−0,5) + (3−0,5)
= 1,60 cm
3
58
Lampiran 6. Perhitungan Menggunakan SPSS
Descriptives
zona.bening(cm)
95% Confidence Interval for
Mean
N
Mean
Std. Deviation Std. Error Lower Bound
Upper Bound
Minimum Maximum
n-heksan
3
.20267
.036074
.020827
.11305
.29228
.168
.240
Etil.asetat
3
1.78667
.051316
.029627
1.65919
1.91414
1.730
1.830
butanol
3
1.63667
.035119
.020276
1.54943
1.72391
1.600
1.670
Total
9
1.20867
.758143
.252714
.62591
1.79143
.168
1.830
Test of Homogeneity of Variances
zona.bening(cm)
Levene Statistic
.429
df1
df2
2
Sig.
6
.669
ANOVA
zona.bening(cm)
Sum of Squares
Between Groups
Within Groups
Total
df
Mean Square
4.588
2
2.294
.010
6
.002
4.598
8
F
1.332E3
Sig.
.000
59
Multiple Comparisons
zona.bening(cm)
LSD
95% Confidence Interval
Mean Difference
(I) pelarut
(J) pelarut
(I-J)
n-heksan
Etil.asetat
-1.584000*
.033889
.000
-1.66692
-1.50108
butanol
-1.434000*
.033889
.000
-1.51692
-1.35108
1.584000*
.033889
.000
1.50108
1.66692
.150000*
.033889
.004
.06708
.23292
n-heksan
1.434000*
.033889
.000
1.35108
1.51692
Etil.asetat
-.150000*
.033889
.004
-.23292
-.06708
Etil.asetat
n-heksan
butanol
butanol
Std. Error
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Sig.
Lower Bound
Upper Bound
60
Lampiran 7. Proses Ekstraksi
Daun pegagan segar
Dimasukkan dalam botol coklat
ditambah metanol dan simpan 5 hari
Ditimbang
Dicuci kemudian diiris melintang
61
Lampiran 8. Proses Evaporasi
Menyaring hasil dari
proses maserasi
Memasukkan larutan yang telah
disaring dalam labu alat evaporator
Dilakukan proses evaporasi dengan
suhu 700C
Didapatkan ekstrak
62
Lampiran 9. Proses Fraksinasi
Ditimbang ekstrak kental
hasil evaporasi
Ditimbang 15,0684 g ekstrak
kental hasil evaporasi
Dilakukan proses fraksinasi
dengan pelarut berturut-turut
n-heksan, etil asetat, butanol
Diperoleh ekstrak dari
masing – masing fraksi
63
Lampiran 10. Hasil Uji Tabung
Identifikasi Fenol
Identifikasi Triterpenoid
Identifikasi Flavonoid
64
Lampiran 11. Hasil Pengamatan Zona Bening
Pembuatan
media NA
Penuangan media
pada cawan petri
Pengamatan zona
bening pada
masing-masing hasil
fraksinasi
Alat untuk membuat
lubang sumuran
Pengukuran zona bening
menggunakan jangka sorong