Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides

Tugas Akhir SB 091351
Sitotoksisitas Ekstrak Spons Laut Aaptos suberitoides
Terhadap Siklus Sel Kanker HeLa
Ika Puspita Ningrum
1507100059
DOSEN PEMBIMBING:
Dra. Nurlita Abdulgani, M.Si
N. D. Kuswytasari, S.Si., M.Si
Latar belakang
Kanker serviks
Pengobatan medis
efek samping
relatif besar dan biaya mahal
Antikanker dari bahan
alam
sponge
Analisis siklus sel
Aaptos suberitoides berpotensi
sebagai antikanker untuk
kanker serviks
Praskrining dan uji
sitotoksisitas in vitro
terhadap sel HeLa
Permasalahan
Sitotoksisitas
in vitro
Aaptos suberitoides
berpotensi sebagai
antikanker pada sel
HeLa dengan nilai
LC50 133.968
µg/mL dan IC50
sebesar 153.007
µg/mL
Analisis siklus
sel
Fase apakah dalam
siklus sel HeLa yang
dihambat oleh ekstrak
spons laut A.
suberitoides
Batasan masalah
Analisis siklus sel menggunakan metode flow
cytometry dengan pewarnaan propidium iodide.
Parameter yang diukur adalah persentase jumlah
sel pada masing-masing fase siklus sel
Tujuan
untuk mengetahui toksisitas ekstrak spons laut
Aaptos suberitoides terhadap siklus sel kanker HeLa
Sebagai produk
farmasi untuk
pengembangan
obat antikanker
baru
Manfaat
Sebagai dasar
pengembangan
dalam upaya
pemanfaatan
sumber daya hayati
laut di Jawa Timur
Metodologi Penelitian
waktu
• Bulan Januari - Juni 2011
tempat
• LPPT dan Laboratorium Patologi
Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta
Skema Kerja
treatmen Flow
cytometry
Propagasi
sel Hela
Pembuatan
medium
kultur
(Penumbuh)
RPMI 1640
Pemanenan
sel Hela
Preparasi sampel
untuk flow cytometry
Pembuatan Medium Kultur RPMI 1640
Fetal Bovine Serum (FBS) 10%
 dimasukkan ke dalam botol steril sebanyak
20mL
 + 2 mL penisilin-streptomisin 1%
 + 1mL fungizon 0,5% disterilisasi
 + 200 mL medium RPMI 1640 murni
 semua perlakuan dibuat di dalam LAF
 disimpan di dalam lemari pendingin pada suhu
± 4°C
Hasil
Propagasi Sel HeLa
Ampul Kultur Sel HeLa
•diambil dari stok yang disimpan dalam tangki cair yang diletakkan
dalam locator pada suhu -196°C
•dicairkan dalam air sampai suhunya mencapai ± 37°C
•disemprot dengan alcohol 70%
• dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi
10ml medium RPMI 1640
Suspensi Sel HeLa
•disentrifuge suspensi sel dengan kecepatan 1500 rpm selama ± 5 menit
•Supernatan dibuang, pellet ditambah 1 ml medium penumbuh RPMI
1640 yang mengandung FBS 10%
•diresuspensikan perlahan sampai homogeny
•ditumbuhkan dalam beberapa (2-3) buah tissue culture flask kecil
•diinkubasi dalam incubator pada suhu 37°C dengan aliran 5% CO2 dan
95% O2 selama 24 jam
•media diganti
•ditumbuhkan sel sampai konfluen dan jumlahnya cukup untuk
penelitian
Hasil
Pemanenan Sel
Sel HeLa
•dilihat hingga jumlahnya cukup atau konfluen (± 70%)
• dicuci dengan PBS sebanyak dua kali
• + tripsin 0,25% sebanyak 300 µL
•Diinkubasi selama tiga menit di dalam inkubator
• + ± 5 mL medium kultur
•diresuspensi secara perlahan menggunakan pipet
•Sel telah siap digunakan untuk penelitian
Hasil
Analisis Siklus Sel
•Treatmen flow cytometry
Sel HeLa
disistribusikan
sebanyak 1000 µl
dengan kepadatan 5
x 105 sel/1000 µl
media ke dalam
sumuran- sumuran
pada 6-well plate
diinkubasi di
dalam incubator
selama semalam
Dibuang PBS
dicuci dengan
500 µl PBS
dibuang media
kultur
+ 500 µl seri konsentrasi
sampel (¼ IC50 ) dan 500
µl seri konsentrasi
cisplatin (¼ IC50)
+ 500 µl seri
konsentrasi sampel
(1/4 IC50)
+ 500 µl seri
konsentrasi sampel
(1/10 IC50)
+ 500 µl seri
konsentrasi Cisplatin
(1/4 IC50)
+ 500 µl seri
konsentrasi Cisplatin
(1/10 IC50)
+ 1000 µl media
kultur
Perlakuan
kombinasi
Diinkubasi
24 jam
Perlakuan
tunggal
sampel
Perlakuan
tunggal
Cisplatin
Kontrol
sel
•Preparasi sampel untuk flow cytometry
Perlakuan
kombinasi
Perlakuan
tunggal
sampel
Diambil media,
dipindahkan ke
eppendorf I
disentrifuge
Dibuang
MK/PBS
ependorf I dan
II disentrifuge
Dibuang media
Perlakuan
tunggal
Cisplatin
Kontrol
sel
Dicuci dengan
PBS sebanyak 3
kali
+ 150 µl
tripsin-EDTA
0,25%
ditransfer ke
ependorf II
+ 500 µl PBS
ke dalam
sumuran
ditransfer ke
ependorf II
Diinkubasi
3 menit
+ 1 ml MK
diresuspensi
+ dan resuspen
pellet sel dengan
500 µl PBS dingin
suspense sel
digabungkan dalam
ke dalam ependorf
I
ependorf
kosong dibilas
dengan PBS
ditransfer ke
ependorf I
eppendorf I
disentrifuge
dibaca dengan
flow cytometer
FACS Calibur
Ditransfer ke
dalam flowcytotube
diinkubasi di
waterbath
37°C selama
10 menit
Dibungkus
dengan alufoil
+ reagen flow
cytometry sebanyak
400 µl dan
diresuspensi
Dibuang PBS
Rancangan percobaan dan Analisa data

Rancangan percobaan : RAL satu faktorial

Analisis Data : one way ANOVA (α = 0,05)
signifikan
Uji LSD
Variabel dan hipotesis penelitian
 Variabel
:
Variabel bebas adalah konsentrasi ekstrak spons A.
suberitoides dan Cisplatin, yaitu ¼ IC50 dan 1/10 IC50
Variabel respon adalah tahapan pada siklus sel HeLa,
yaitu subG1, G1, S, dan G2/M

Hipotesis :
Ho
= Tidak ada pengaruh penambahan ekstrak
spons A.suberitoides pada tiap-tiap fase siklus sel
HeLa
H1
= Ada pengaruh penambahan ekstrak
spons A.suberitoides pada tiap-tiap fase siklus sel
HeLa
HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek perlakuan pada morfologi sel HeLa
M1
M2
M3
M4
M5
9287 66.09 46.43 200.39 8.04 199.00
1609 11.45 8.04 288.35 10.23 286.00
1715 12.20 8.58 383.45 7.68 379.00 R3
145 1.03 0.73 521.32 7.71 506.00
1094 7.79 5.47 63.19 64.59 48.00
R3
Profil Siklus Sel HeLa pada berbagai perlakuan
Histogram Statistics
File: KONTROL HeLA.0813.10.012
Log Data Units: Linear Values
Sample ID: KONTROL HeLA.0813.10
Pati ent ID: 0813.10.01
M3
Acquisition Date: 13-Aug-10
Gate: G3
M5
M2
M4 s: 20000
Gated Events: 14052
Total Event
M3
M2
M5
Histogram Statistics
M4
M1
File: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10.017
Sample ID: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10
Acquisition Date: 13-Aug-10
M5
M2
Gated Events: 15622
M1
R3
a.
Marker
All
M1
M2
M3
M4
M5
Events % Gated
14052 100.00
9855 70.13
1536 10.93
1617 11.51
12 0.09
1114 7.93
% Total
70.26
49.28
7.68
8.09
0.06
5.57
b.
Mean
217.21
197.68
292.49
374.85
472.00
61.18
CV
36.07
7.23
10.19
7.38
0.31
69.35
Median
199.00
196.00
291.00
369.00
472.00
45.00
R3
M2
M5
M4
M1
Histogram Statistics
FiM5le: CISPLATIN 1/4 HeLA.
Log Data Units: Linear Values
M2 0813.10.015
M4
Sample ID: CISPLATIN 1/4 HeLA.0813.10
Pati ent ID: 0813.10.01
M1
Acquisition Date: 13-Aug-10
Gate: G3
M3
Gated
Event
s
:
13794
Total Events: 20000
M5
M2
M4
Marker
All
M1
M2
M3
M4
M5
d.
e.
M3
M2
EventsM1 % Gated
13794 100.00
4755 34.47
4883 35.40
2250 16.31
171 1.24
1655 12.00
M4
Gate: G3
M4
Total Events: 20000
Mean CV
216.17 60.51
197.87 8.85
290.22 9.93
381.43 7.76
510.80 6.76
35.24 133.57
Median
199.00
196.00
289.00
375.00
502.00
11.00
R3
c.
Histogram Statistics
M3
M3
M1 % Total
Marker Events % Gated
All 15622 100.00 78.11
M1 9702 62.10 48.51
M2 1660 10.63 8.30
M3 1609 10.30 8.04
M4 156 1.00 0.78
M5 2291 14.67 11.46
Log Data Units: Linear Values
Patient ID: 0813.10.01
M3
% Total
68.97
23.77
24.41
11.25
0.85
8.28
Mean CV Median
259.56 48.01 251.00
209.54 9.88 211.00
284.91 9.65 282.00
380.26 8.10 374.00
507.63 7.10 494.00
64.26 71.80 47.00
File: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10.017
Log Data Units: Linear Values
Sample ID: EKSTRAK 1/4 HeLA.0813.10
Patient ID:Statistics
0813.10.01
Histogram
Acquisition Date: 13-Aug-10
Gate:
G3
M3
File: CISPLATIN 1/10 M2
HeLA.0813.10.014
Gated Events: 15622
Total Events: 20000 Log Data Units: Linear Values
Marker
All
M1
M2
M3
M4
M5
M5
Sample ID: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10 M4 Patient ID: 0813.10.01
M3
EventsAcquisition
% GatedM1
Mean CV Median Gate: G3
Date:% Total
13-Aug-10
M5
M2
15622
100.00 13969
78.11 201.84 46.85 197.00 M4Total Events: 20000
Gated Events:
10109 64.71 50.54 197.20 7.99 196.00
M1
1703
294.60% Total
10.07 Mean
295.00 CV Median
Marker 10.90
Events 8.52% Gated
1532 All 9.8113969 7.66100.00
375.41 69.847.67 250.12
369.00 43.68 246.00
62 M1 0.4048990.31 35.07
485.03 24.501.60 202.12
484.00 10.78 200.00
2280 M2 14.59443611.40 31.76
33.00 22.18
136.98 290.61
10.00 9.55 289.50
M3 2501 17.90 12.50 375.35 7.66 368.00
M4 127 0.91 0.64 503.40 5.26 499.00
M5 1986 14.22 9.93 82.61 61.83 89.00
f.
Histogram Statistics
Histogram Statistics
File: CISPLATIN 1/4 HeLA.0813.10.015M3
Log Data Units: Linear Values
File: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10.014
M3
Sample ID: CISPLATIN 1/10 HeLA.0813.10
M2
Log Data Units: Linear Values
Patient ID: 0813.10.01
Distribusi sel HeLa setelah perlakuan
Jenis Perlakuan
Konsentrasi
Jumlah Sel (%)
subG1
G1
S
G2/M
Kontrol
0
6,41
46,44
8,04
8,53
Ekstrak A. suberitoides
¼ IC50
10,00
48,50
8,25
7,98
1/10 IC50
7,45
50,22
8,03
8,22
¼ IC50
8,34
23,76
24,28
11,17
1/10 IC50
9,35
24,50
22,19
12,52
7,55
21,13
25,13
17,65
Cisplatin
Kombinasi Cisplatin – ¼ IC50 - ¼
Ekstrak A. suberitoides
IC50
Mekanisme ekstrak A. suberitoides dalam
menghambat siklus sel HeLa


A. suberitoides :
ircinin
- alkaloid
- terpenoid
induksi p21 dan p27
kadar siklin D menurun
CDK4 dan CDK6 tidak diaktivasi
Rb tidak terfosforilasi
G1 arrest
Mekanisme perlakuan kombinasi
S arrest dan peningkatan jumlah sel pada
fase G2/M
 penahanan fase S :
 cisplatin : menghambat sintesis DNA
 ekstrak : senyawa histatin
 peningkatan fase G2/M :
 senyawa hymenialdisine : menghambat
CHK1

KESIMPULAN
Ekstrak A. suberitoides 38,25 µg/mL
menyebabkan terjadinya apoptosis sebesar
10% dan akumulasi sel terbesar pada fase
G1 yaitu sebesar 50,22%,
 ekstrak A. suberitoides 15,3 µg/mL
menyebabkan terjadinya apoptosis sebesar
7,45% dan akumulasi sel terbesar juga pada
fase G1 sebesar 48,50%.

Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
menggunakan ekstrak Aaptos suberitoides
dengan konsentrasi yang lebih tinggi agar
pengaruh ekstrak terhadap siklus sel HeLa
dapat terlihat dengan lebih jelas.
 Ekstrak spons A. suberitoides yang digunakan
untuk penelitian perlu dimurnikan terlebih
dahulu menjadi bentuk senyawa murni
sehingga memiliki aktivitas biologi yang
lebih tinggi.
