Analisis pertumbuhan sel

Analisis pertumbuhan sel
Pada banyak kasus, ekspresi gen rekombinan dapat menurunkan pertumbuhan
organisme inang jika dibandingkan dengan yang tidak ditransformasi dengan vektor
dan gen asing. Informasi kecepatan pertumbuhan ini nantinya dapat digunakan untuk
merancang lebih jauh kondisi kultivasi yang cocok untuk produksi produk tertentu oleh
organisme tersebut. Untuk memperoleh preliminary data karakteristik pertumbuhan
sel E.coli hasil transformasi dengan plasmid pRT-Gen X Prof. Tobi melakukan
percobaan di bawah ini.
I. Pengaruh kehadiran gen X pada pertumbuhan sel E.coli strain Top1 (high level
of recombinant gen expression, unusual cell size)
Kultur starter E.coli transforman pRT-gen X dan non-transforman diinokulasikan pada
medium agar pertumbuhan dengan menggunakan metode spread. Pengamatan yang
dilakukan 8 jam setelah inokulasi awal menunjukkan adanya 91 colony forming unit
(CFU) pada cawan petri A yang mengandung E. coli non-transforman dan 17 CFU
pada cawan petri B yang mengandung E. coli transforman. CFU merupakan satuan
ukuran populasi bakteri pada media padat, setiap koloni bakteri yang jelas terpisah
dari koloni lainnya dihitung sebagai satu CFU. Koloni bakteri ini awalnya berasal dari
satu sel bakteri yang mengalami pembelahan terus-menerus menghasilkan
sekumpulan bakteri dalam satu koloni.
Di akhir inkubasi, diamati kultur sel E. coli memenuhi cawan petri A dan B berturutturut setelah 24 dan 36 jam. Metode penghitungan plate count yang menggunakan
metode pengenceran berseri dilakukan untuk mengetahui jumlah sel yang ada
didalam kedua cawan petri tersebut di akhir pengamatan.
Berikut adalah cara kerja praktikum yang diberikan oleh Prof. Tobi untuk metode
pengenceran berseri :
Alat dan Bahan :
1. 10 buah tabung reaksi
2. 4 buah cawan petri berisi agar LB (media padat pertumbuhan bakteri,
diameter 100 mm)
3. 50 ml larutan M9 (garam fisiologis, media cair pertumbuhan bakteri)
4. Pipet tetes
5. Pemanas spiritus
6. Pipet sedotan
7. Vortex
Metode :
1. Siapkan 6 tabung reaksi. Isi tube 1 dengan 5 ml larutan M9. Isi tube 2 – 6
dengan 4.5 ml larutan M9.
2. Ambil bakteri yang terdapat pada area seluas 1 mm x 1 mm pada permukaan
agar di cawan petri. Masukkan ke dalam tube 1. Homogenisasi hingga merata
menggunakan vortex.
3. Ambil 0.5 ml larutan pada tube 1 dan masukkan ke dalam tube 2. Homogenisasi
hingga rata.
4. Lakukan langkah 3 untuk tube 3 hingga 6.
5. Inokulasi cawan petri pertama dengan mengambil 1ml larutan di dalam tube 3.
Tuang larutan kedalam cawan petri dan sebarkan hingga merata.
6. Ulangi langkah 5 untuk cawan petri kedua, ketiga dan keempat, masing-masing
menggunakan larutan dari tube 3 – 6.
7. Diamkan kultur pada suhu ruangan. Hitung jumlah CFU yang terbentuk.
Setelah masa inkubasi 8 jam, didapatkan hasil sebagi berikut :
Secara statistik, jumlah CFU yang baik untuk digunakan dalam menghitung jumlah
sel adalah antara 30-300. Jika CFU terlalu banyak sehingga tidak dapat dibedakan
secara jelas dan dihitung jumlahnya secara pasti, maka jumlah CFU dianggap lebih
besar daripada 300.
Q 2.1 (4 poin @ 0.5 point) Berdasarkan hasil pengamatan diatas, lengkapi tabel
yang terdapat pada Lembar Jawaban.
*Pengenceran dihitung relatif terhadap sel pada kultur tabung reaksi 1, sehingga
𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑒 1
tingkat pengenceran dapat dihitung sebagai: 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑒𝑙 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑒 𝑥
Q 2. 2 (2 point) Berdasarkan hasil plate count, berapakah jumlah sel total yang
terdapat pada cawan petri? (asumsikan π = 3)
Q 2.3 (2 point) Hitung dalam menit waktu yang dibutuhkan oleh sel E.coli pada
cawan A dan B untuk membelah.
Q 2.4 (8 point @ 0.5) Lengkapi grafik pertumbuhan sel bakteri pada Lembar
Jawaban yang menujukkan konsentrasi sel setiap 3 jam.
Q 2.6 Tentukan pernyataan dibawah ini Benar (B) atau Salah (S) berdasarkan
pengaruh ekspresi Tobisilin terhadap pertumbuhan bakteri
No Pernyataan
Waktu generasi E. coli yang membawa plasmid pRT-Gen X lebih lama
1
dibanding E. coli non-transforman
Laju pertumbuhan spesifik E. coli yang membawa plasmid pRT-Gen X
2
lebih besar dibanding E. coli non-transforman
Jika bakteri E. coli non-transforman dan E.coli yang membawa plasmid
3
pRT-Gen X di tumbuhkan pada satu media kultur yang sama, maka
setelah 24 jam, anda tidak dapat lagi menemukan plasmid pRT-Gen X
di dalam kultur sel bakteri tersebut
II.Analisis Pengaruh Tobisilin pada Siklus Pembelahan Sel HeLa
Kemampuan Tobisilin untuk menginhibisi pertumbuhan organisme tangguh (resilient)
seperti jamur, membuat Prof. Tobi berpikir apakah Tobisilin dapat juga digunakan
untuk menginhibisi sel lain dengan kemampuan pertumbuhan dan daya tahan yang
tinggi seperti sel kanker. Prof. Tobi mencoba menyusun percobaan terkait
menggunakan flow cytometry dan menugaskan asistennya, Hanna, untuk melakukan
eksperimen tersebut.
Eksperimen menggunakan kultur sel HeLa (sel kanker manusia) yang selalu
membelah yang diberikan pewarna DAPI untuk berikatan dengan DNA sel tersebut.
Kultur sel diamati menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil pengamatan menemukan
adanya 26 sel dengan DNA terkondensasi pada kultur sel Hela tanpa Tobisilin dan
hanya 23 pada kultur sel HeLa dengan Tobisilin.
Setelah pengamatan dilakukan, kultur dilewatkan pada alat flow cytometer. Flow
cytometer adalah sebuah alat yang dapat menghitung jumlah sel yang telah diwarnai.
Flow cytometer bekerja dengan cara melewatkan sel satu-persatu melalui sebuah
pipa kapiler kecil yang hanya dapat dilewati oleh satu sel. Sel dihitung dengan cara
menyinari satu bagian pipa kapiler dengan laser yang menyebabkan fluoresensi pada
pewarna DAPI. Fluorensensi yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi
pewarna yang terdapat dalam sel. Tabel dibawah menunjukkan jumlah sel yang
didapatkan setelah hasil penghitungan dengan flow cytometer:
Unit Fluoresensi Relatif
0
40
80
120
140
160
200
240
280
320
360
400
440
480
Jumlah Sel
HeLa
HeLa + Tobisilin
0
0
0
0
0
0
10
17
16
20
174
163
36
32
35
37
32
34
33
33
32
36
36
32
86
90
10
6
Q 3.1. Buat grafik jumlah fraksi sel (dalam persentase dari sel total) terhadap unit
fluoresensi relatif. Gambar grafik fraksi sel Hela dan fraksi sel Hela + Tobisilin pada
satu grafik yang sama. Gunakan lingkaran (O) untuk menunjukkan fraksi sel Hela,
dan kotak (☐) untuk menunjukkan fraksi sel Hela + Tobisilin.
Q 3.2. Dengan menggunakan data dari grafik, tentukan pada unit fluoresensi berapa
sel dengan masing-masing fase dapat ditemukan.
Q 3.3 Tentukan lama fase sel jika diketahui lama siklus sel adalah 24 jam.
Q 3.4 Dari eksperimen ini, kesimpulan apa yang dapat ditarik tentang dampak
Tobisilin terhadap lama siklus sel HeLa? Beri tanda X pada jawaban yang tepat!
No Pernyataan
1
Tobisilin memperlambat siklus sel HeLa
2
Tobisilin mempercepat siklus sel HeLa
X
3
Tobisilin tidak mempengaruhi panjang siklus sel HeLa
IV. Kesimpulan
Q 4.1 Dari Q.1, Q.2 dan Q.3, organisme mana saja yang terpengaruhi siklus selnya
oleh Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban sesuai
No
1
2
3
Organisme
Jamur
Bakteri
Hewan
X
Q 4.2 Sintesis zat mana saja dibawah ini yang mungkin menjadi target aktifitas
Tobisilin? Beri tanda X pada jawaban yang sesuai
B
A
C
pengaruh
sesuai
No
1
2
D
Q 4.3 Menurut Anda, setelah melihat faktafakta diatas, alasan apa yang paling tepat
menggambarkan mengapa plasmid Tobisilin (pRT-gen X) memiliki
yang diamati pada bakteri? Beri tanda X pada jawaban yang
Pernyataan
Target Tobisilin adalah zat metabolit bersifat universal yang
terdapat pada sel jamur, bakteri dan hewan.
Tobisilin mendegradasi protein siklin pada sel eukariot dan
prokariot
X
3
4
Replikasi dan eksperesi Tobisilin pada sel E. coli
menyebabkan beban tambahan yang cukup besar pada
metabolism normal E. coli
Instabilitas struktural sitoskelet yang diakibatkan oleh
Tobisilin menyebabkan gangguan keseimbangan tekanan
osmotik pada E. coli