Jenis Elektroforesis
advertisement
BAB I PENDAHULUAN A. Dasar Teori Isolasi DNA Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas DNA itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk. 2004: 221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dan sitosin. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah: Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup, Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri, tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya. Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Terdapat sejumlah tujuan dari isolasi DNA, antara lain: Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA, Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan kualitas DNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut: Kemurnian Panjang DNA Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung Oleh sebab itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai. Isolasi DNA pada Tanaman Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan enzim penghambat-polisakarida. Sebagai contoh dari isolasi DNA tanaman adalah isolasi DNA tanaman pisang. Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang adalah penggerusan atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur. Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak. Kemudian dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa supernatan berwarna hijau sedangkan pelet berwarna putih kehijauan. Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran, homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi homogenasi. Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hasil yang didapatkan adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform:Isoamyl Alkohol untuk presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi. Untuk memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14 M NaCl) steril, Fenol: Chloroform: IsoamylAlkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform: Isoamilalkohol (PCI) = 24 : 1, 7.5 M Ammonium acetate,Etanol Absolut, Etanol 70 %, TE Buffer pH 8. EDTA merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-positif seperti Ca2+ dan Mg2+ sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat. Pada prosedur ekstraksi yang telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut didalam pelarut organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol. Hal ini berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Sebab apabila fenol-kloroform masih berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Hasil yang didapatkan dari presipitasi CI akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf, kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi. CTAB memiliki fungsi yang sama seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari membran sel. SDS adalah sejenis deterjen yang mampu mengemulsi lipid. Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol absolut dan amonium nitrat dan diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali untuk mendapatkan pelet DNA. Setelah supernatan dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol 70% untuk presipitasi lanjutan. Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai didapatkan pelet DNA Pelet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan. Gambar di bawah merupakan cara isolasi DNA pada bibit gandum. Isolasi DNA pada Darah Isolasi DNA tak hanya bisa dilakukan untuk tanaman atau buah-buahan saja, tapi juga bisa dari darah, berikut cara kerjanya: Tahap-tahap utama dalam isolasi DNA darah adalah: Menghancurkan membran sel. Disosiasi protein sel. Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya. Darah merupakan jaringan ikat khusus yang mempunyai elemen-elemen berupa sel darah, trombosit, dan substansi interseluler cair, yaitu plasma darah. ELEKTROFORESIS Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Jenis Elektroforesis Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pitapita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekulmolekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan mengelektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Perangkat elektroforesis gel Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR menggunakan primer mikrosatelit. Berkas (band) mendatar merupakan sekumpulan DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan kecepatan berbeda. Semakin pendek DNA semakin cepat bergerak. B. Latar Belakang Isolasi DNA Pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging, dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis jumlah dan ukuran yang sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim retriksi dan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR. Pada praktikum ini, kami mencoba untuk melakukan isolasi DNA dari tanaman dengan menggunakan jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas, misalnya menggunakan daging buah atau tanaman jenis sayuran. Elektroforesis Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada Ph dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul – molekul berdasarkan muatannya. C. Prinsip Kerja Isolasi DNA Prinsip dasar dari isolasi DNA adalah pendenaturasian protein yang masih menempel pada kromosom oleh kloroform. Dan DNA yang dihasilkan akan dielektroforesis dan juga di amplifikasi di PCR. Elektroforesis Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik 11mmune11tive untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau 11mmune-blotting yang merupakan metodemetode karakterisasi lebih lanjut. D. Tujuan Isolasi DNA Melakukan isolasi DNA dari berbagai tanaman. Memahami prinsip kerja dalam Isolasi DNA tanaman Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA. Elektroforesis Untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA. BAB II METODE KERJA A. Alat dan Bahan Alat 1. Mikropipet berbagai ukuran 2. Pipet berukuran 3. Tabung 1,5 ml 4. Tips mikropipet berbagai ukuran 5. Saringan 6. Gelas kimia 7. Sendok 8. Penangas 9. Vorteks 10. Mini sentrifuga 11. Blender/Lumpang Bahan 1. Buffer ekstraksi ( 100 mM Tris-HCl, pH 8; 50 mM EDTA; 500mM NaCl,CTAB 2% 2. Potasium asetat 5 M 3. SDS 20% 4. Kloroform: Isoamil alkohol ( 24 : 1 ) 5. Alkohol 100% ( pa ) 6. TE ( 10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA pH8 ) 7. Buah Stroberi 8. CTAB 2% B. Langkah Kerja 1. Mengambil daging buah sebanyak 50 gram. 2. Menghancurkan daging buah dengan menggunakan blender. 3. Menampung daging buah yang telah halus. 4. Memasukan ke dalam tabung 1,5 ml daging buah yang telah dihaluskan sebanyak 0,1 ml atau 100 µl. 5. Menambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume total sampel. 6. Menambahkan SDS 20% sebanyak 20 µl. 7. Menghomogenkan dengan alat vortex selama 5 detik. 8. Inkubasikan dalam penangas air pada suhu 65°C selama 20 menit. 9. Menambahkan 100 µl 5 M Potasium asetat. 10.Menghomogenkan dengan cara membolak-balikan tabung sebanyak 50x. 11.Menyimpan dalam wadah berisi es selama 10 menit. 12.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. 13.Pindahkan fasa atas ke dalam tabung 1.5 ml yang baru, jangan sampai endapan terbawa. 14.Menambahkan kloroform: Isomil alcohol (24:1) sebanyak ½ x volume total sampel. 15.Menghomogenkan sampel dengan cara membolak-balik tabung sebnayak 50x. 16.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. 17.Memindahkan fasa atas kedalam tabung baru. 18.Menambahkan alcohol 00% (-20°C) sebanyak minimal 2 x volume total sampel. 19.Mensentrifuga sampel pada kecepatan 14.000 rpm selama 10 menit. 20.Membuang alcohol dengan hati-hati, agar endapan DNA tidak terbuang. 21.Cuci dengan alcohol 70% 1x, kemudian keringkan sampel pada oven dengan suhu 50°C selama 10 menit, atau hingga endapan mongering. 22.Melanutkan endapan DNA denan TE sebanyak 30 µl. 23.Menyimpan sampel pada suhu 4°C, biarkan minimal selama 24 jam agar DNA dapat terlarut dengan sempurna. 24.DNA yang diperoleh akan di elektroforesis dan juga di amplifikasi dengan alat PCR. BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan Marker DNA DNA DNA Hasil Isolasi DNA Buah Stroberry Elektroforesis Agarose B. Pembahasan Isolasi DNA bertujuan untuk mengenal dan mempraktekkan teknik dalam melakukan isolasi DNA dari tanaman dan DNA jaringan / sel hewan. Pada praktikum kali ini kami melakukan teknik isolasi DNA pada daging buah dari tumbuhan stroberry. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Sedangkan prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Pada praktikum yang kami lakukan setelah sebanyak 1,5 ml daging buah strobery yang telah dihaluskan dimasukan ke dalam tabung, kemudian ditambahkan buffer ekstraksi dan sodium dodesil sulfat (SDS), penambahan larutan tersebut berfungsi sebagai larutan pelisis yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selanjutnya tabun dihomogenkan dengan vorteks agar campuran larutan dapat menyatu dengan ekstrak daging buah. Lalu larutan diinkubasi untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Proses selanjutnya yaitu pemberian Potasium asetat (tahap presipitasi). Potasium asetat ini jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap, kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Penambahan kloform isoamil asetat berfungsi untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom. Kemudian tabung dihomogenkan hingga terlihat adanya benang-benang putih DNA yang membentuk gumpalan. Setelah itu disentrifuge, DNA akan tampak sebagai butiran putih kecil, dan supernatan dibuang. Selanjutnya butiran DNA genom dicuci dengan penambahan alkohol. kemudian disentrifuge dan supernatannya dibuang. Lalu alkohol dibuang denga hati-hati agar endapan (butiran DNA) tidak ikut terbuang. Dari hasil yang kami dapatkan mengenai isolasi DNA ini, sampai pada tahap akhir kami melihat DNA buah stroberry dapat diisolasi dengan terbentuknya benang-benang putih DNA yang membentuk gumpalan. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikelpartikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Pada prkatikum selanjutnya kami mengetahui proses elektroforesis DNA melalui demonstrasi yang disampaikan dan melihat hasil elektroforesis DNA tersebut dengan bantuan sinar UV. Pada praktikum ini digunakan gel agarose untuk memisahkan (separation), dan purifikasi DNA. Gel aagrose yang telah ditambahkan Etidium bromida (EtBr) dituangkan ke dalam cetakan gel dan dibiarkan mengeras. Sampel DNA bisa dimasukkan (loading) dalam sumur (well) gel yang kemudian bisa terpisah dengan menggunakan arus listrik. Sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Hasil elektroforesisi ini dapat diamati dengan bantuan sinar UV. Dari pengamatan yang dilakukan kami melihat terbentuknya pita-pita DNA yang terdiri atas beberapa line dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Dengan membandingkan masing-masing fragmen/ pita dengan posisi pada pada DNA marker dapat diketahui Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita tersebut. C. Jawab Pertanyaan Isolasi DNA 1. Amati warna larutan, warna endapan, jumlah lapisan pada setiap tahapan isolasi DNA. Tulis dan gambarkan tabung hasil pengamatan pada setiap tahapan! Jawab : Secara umum jenis larutan yang digunakan pada proses isolasi DNA berwarna bening. Berikut ini gambaran hasil pengamatan dari tiap tahapan : Sampel Buffer Ekstraksi SDS T.4 Potasium asetat Sampel Sampel T.6 T.7 T.9 Klorofom : isoamil alkohol T.12 Alkohol 100% Sampel Sampel T.14 Sampel T.16 T.17 T.13 Gumpalan DNA Sampel T.18 T.19 2. Hitunglah jumlah senyawa yang dimasukkan pada tahapan kerja nomor 5, 14, dan 18! Jawab : Tahap kerja nomor 5 : menambahkan buffer ekstraksi sebanyak 4 x volume sampel atau sebanyak 0,4 µl. Tahap kerja nomor 14 : menambahkan campuran klorofom dengan isoamil alkohol sebanyak ½ volume total sampel atau sebanyak 200 µl. Tahap kerja nomor 18 : menambahkan alkohol 100% sebanyak 2 x volume total sampel atau sebanyak 900 µl. 3. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam proses isolasi DNA! Jawab : Senyawa yang digunakan dalam proses isolasi DNA yaitu : a. Buffer ekstraksi yang mengandung : Tris-Hcl ( Thromethamine HCl) dan NaCl yang berfungsi sebagai buffer untuk menjaga pH 8. Selain itu NaCl berfungsi untuk menjaga struktur double helix DNA. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), yang dapat mengikat ion metal, sehingga menghambat kerja enzim nuklease. Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) untuk menghilangkan polisakarida. (Sumber : http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods) b. Sodium dodecyl sulfate (SDS) yang merupakan detergen untuk melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. c. Potasium assetat merupakan senyawa pengikat debris sel dan protein untuk membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. d. Kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk memdenaturasi protein pada kromosom. e. Alkohol 100% untuk menggumpalkan DNA yang telah lepas dari sel. Elektroforesis 1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis Anda! Jawab : DNA pada hasil elektroforesis yaitu bagian pita yang berwarna putih dari gambar. 2. Mengapa DNA anda hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV? Jelaskan! Jawab : Ultraviolet digunakan untuk mengecek keberadaan DNA hasil elektroforesis. DNA yang telah berikatan dengan etidium bromida akan berpendar pada saat disinari oleh UV. ( Sumber : http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html ) 3. Apakah etidium bromide? Bagaimana cara kerja etidium bromide dalam proses pewarnaan DNA? Jawab: Etidium bromida merupakan zat pewarna DNA yang akan menyebabkan fluoresensi DNA saat disinari oleh UV. Etidium bromida akan berikatan dengan bagian basa dari DNA dan menyebabkan transmisi sinar UV menjadi dapat dilihat. (Sumber : http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html ) BAB IV KESIMPULAN Isolasi DNA Isolasi DNA dapat dilakukan dengan tahapan yang telah disebutkan sebelumnya. Tahapantahapan pada isolasi DNA bertujuan untuk mengeluarkan DNA dari dalam inti sel tanpa adanya zat lain selain DNA, yang pada akhir proses isolasi dapat terlihat gumpalan DNA tersebut. Pada setiap tahapan digunakan berbagai jenis larutan, yaitu : a. Buffer ekstraksi yang mengandung : Tris-Hcl ( Thromethamine HCl) dan NaCl yang berfungsi sebagai buffer untuk menjaga pH 8. Selain itu NaCl berfungsi untuk menjaga struktur double helix DNA. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), yang dapat mengikat ion metal, sehingga menghambat kerja enzim nuklease. Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) untuk menghilangkan polisakarida. (Sumber : http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods) b. Sodium dodecyl sulfate (SDS) yang merupakan detergen untuk melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. c. Potasium assetat merupakan senyawa pengikat debris sel dan protein untuk membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potassium asetat-protein-debris sel. d. Kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk memdenaturasi protein pada kromosom. e. Alkohol 100% untuk menggumpalkan DNA yang telah lepas dari sel. Elektroforesis Elektroforesis merupakan metode yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan memisahkan DNA menurut berat jenisnya. Apabila pita hasil elektroforesis semakin luas menandakan DNA telah menjadi potongan-potongan kecil, dimana potongan kecil tersebut akan berjalan lebih cepat menuju elektroda positif dibandingkan potongan DNA yang lebih besar. DNA memiliki muatan negatif sehingga akan bergerak menuju elektroda positif saat di elektroforesis. Pita DNA hasil elektroforesis dapat dilihat melalui penyinaran dengan menggunakan sinar UV, karena adanya etidium bromida sebagai pewarna DNA yang menyebabkan flouresensi LAMPIRAN GAMBAR Vortex penyimpanan di dalam es http://clearlyexplained.com/culture/health www.siumed.edu /electrophoresisgel.jpg Polyacrylamide Gel Penyinaran hasil elektroforesis Electrophoresis (PAGE) DNA di bawah sinar UV Hasil isolasi DNA Ultraviolet transiluminator DAFTAR PUSTAKA http://biologi.blogsome.com/2009/11/02/isolasi-dna/ http://www.macnature.com/2010/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.html http://www.biotech.wisc.edu/Outreach/posterhandoutcollection/dnaextractionhandout.jpg http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif http://isolasidna.blogspot.com/ http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis_gel http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html
