UJI EFEKTIVITAS LARVASIDA EKSTRAK DAUN LEGUNDI ( Vitex

ISSN 2337-3776
UJI EFEKTIVITAS LARVASIDA EKSTRAK DAUN LEGUNDI (Vitex trifolia)
TERHADAP LARVA Aedes aegypti
Eka Cania B1), Endah Setyanimgrum2)
Email : [email protected]
1)
Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Lampung, 2)Staf Pengajar Fakultas Kedokteran
Universitas Lampung
ABSTRAK
Latar belakang : Upaya pengendalian demam berdarah dengue (DBD) yang populer dilakukan secara kimiawi
(insektisida sintetik) dapat mengakibatkan keracunan pada manusia sehingga perlu insektisida botanis yang lebih
aman seperti senyawa yang berasal dari tumbuhan legundi. Kandungan fitokimia ekstrak daun legundi meliputi
saponin, flavonoid, dan alkaloid, dapat berperan sebagai racun perut serta racun pernapasan sehingga
mengakibatkan kematian larva. Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efektivitas larvasida ekstrak daun
legundi (Vitex trifolia L.) terhadap larva Aedes aegypti instar III. Penelitian dilakukan di Laboratorium Zoologi,
Jurusan Biologi dan Laboratorium Kimia, Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung pada bulan November
sampai dengan Desember 2012. Metode : Penelitian menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL)
dengan 6 kelompok perlakuan yang tiap kelompok berisi 25 larva Aedes aegypti instar III dan 4 kali pengulangan
yaitu konsentrasi ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) sebesar 0%, 0,25%, 0,5%, 0,75% dan 1% dengan abate 1%
sebagai kontrol positif. Data yang didapatkan lalu diuji menggunakan uji Kruskall-Wallis dan uji post hoc MannWhitney untuk mengetahui adanya perbedaan pada tiap konsentrasi. Hasil :Pada konsentrasi 1% kematian larva
uji mencapai 95% di menit ke 4320. Didapatkan pada uji Mann-Whitney efektifitas ekstrak daun legundi 1%
dengan abate tidak memiliki perbedaan (p>0,05). Nilai LC50 menunjukkan penurunan nilai konsentrasi seiring
peningkatan waktu (menit 480-2880) yaitu 0,837% sampai dengan 0,346%. Sedangkan nilai LT50 menunjukkan
penurunan waktu yang dibutuhkan seiring peningkatan konsentrasi (0,5%-1%) yaitu dari 2233,197 menit sampai
321,181 menit. Hasil tersebut menunjukkan bahwa ekstrak daun legundi mempunyai efektivitas larvasida
terhadap larva Aedes aegypti.
Kata kunci : Vitex trifolia, ekstrak daun legundi, Aedes aegypti, larvasida
Larvacide Effectiveness Test of the Legundi’s Leaf (Vitex trifolia) Extract for Larvae of
Aedes aegypti
Eka Cania B 1), Endah Setyanimgrum 2)
1)
Medical Faculty Student of Lampung University, 2) Medical Faculty Lecturer of Lampung
University
ABSTRACT
Backgroud : Popular control efforts of Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) that is conducted with chemical
control (synthetic insecticides) can cause poisoning in humans so we need safer botanical insecticides such as
compounds derived from plants legundi(Vitex trifolia). Phytochemical content of legundi’s leaf extract include
saponins, flavonoids, and alkaloids that can act as stomach poisons also fumigans that resulting in the death of
the larvae. This study aims to investigate the larvacidal effectiveness of legundi’s leaf extract (Vitex trifolia L.)
against third instar larvae of Aedes aegypti. The research was conducted at the Laboratory of Zoology,
Department of Biology and Chemistry Laboratory, Department of Chemistry, FMIPA Lampung University in
52 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
November to December 2012. Methods :This research uses Completely Randomized Design (CRD) with 6
treatment groups, each group containing 25- third instar larvae of Aedes aegypti and 4 times repetitions and then
the concentrations of legundi’s leaf extract (Vitex trifolia) are 0%, 0.25%, 0 , 5%, 0.75% and 1% also abate 1%
as a positive control. Data were obtained and tested using Kruskall-Wallis test and post hoc test of MannWhitney to find out the differences at each concentration. Result : At concentrations of 1%, the test larvae
mortality reached 95% in 4320 minutes. Found in Mann-Whitney test, effectiveness of legundi leaf extract 1% to
abate no differences (p> 0.05). LC50 values shows a decreasing in concentration with increasing time value
(480-2880 minutes) is 0.837% to 0.346%. While the LT50 values shows increasing in the time required
concentration (0.5% -1%), from 2233.197 to 321.181 minutes. The results showed that the legundi’s leaf extract
has larvacidal effectiveness for larvae of Aedes aegypti.
Keywords: Vitex trifolia, legundi’s leaf extract, Aedes aegypti, larvacide
I.
PENDAHULUAN
Demam Berdarah Dengue (DBD) merupakan penyakit infeksi yang umum di daerah
tropis termasuk Bandar Lampung. Menurut Dinas Kesehatan Provinsi Lampung, angka
kejadian DBD di Bandar Lampung selalu tinggi dalam tiga tahun terakhir (763 kasus pada
2010 ; 413 kasus pada 2011 dan 1111 kasus pada 2012) menjadikannya sebagai daerah
endemis DBD. Pada DBD terjadi demam tinggi dan bisa disertai dengan perdarahan dan syok
dan dapat berakibat kematian sehingga perlu dilakukan pencegahan. Program pencegahan dan
pemberantasan DBD belum berhasil menurunkan angka kesakitan DBD cenderung meningkat
dengan penyebaran penyakit semakin luas.
Pengendalian kimiawi menggunakan
insektisida/larvasida sintetik terbukti dapat mengakibatkan keracunan pada manusia, polusi
lingkungan bahkan resistensi serangga target sehingga perlu insektisida/larvasida yang lebih
aman dengan insektisida/larvasida botanis yang dihasilkan oleh tanaman.
Tanaman legundi dapat menjadi alternatif larvasida. Legundi memiliki senyawa bioaktif
seperti saponin, flavonoid, alkaloid dan miyak atsiri yang dapat membasmi jentik nyamuk
dengan cara kerja mirip bubuk Abate (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1991). Pada beberapa
penelitian yang telah dilakukan, saponin dan alkaloid memiliki cara kerja sebagai racun perut
dan menghambat kerja enzim kolinesterase pada larva sedangkan flavonoid dan minyak atsiri
berperan sebagai racun pernapasan sehingga menyebabkan kematian larva.
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka rumusan masalah dalam penelitian ini yaitu:
Apakah ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) memiliki efektivitas larvasida terhadap larva
Aedes aegypti instar III?
53 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
II. METODE PENELITIAN
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental dengan
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan yang terdiri dari 6
konsentrasi (0% ; 0,25% ; 0,5% ; 0,75% ; 1% ; dan abate 1%) dengan 4 kali pengulangan.
Penelitian dilaksanakan di dua tempat berbeda, yaitu di Laboratorium Kimia Organik Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung untuk pembuatan ekstrak dan
Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Lampung untuk uji efektivitas, pada bulan Desember 2012.
Populasi yang digunakan adalah larva instar III Aedes aegypti yang diperoleh dari
rearing telur Aedes aegypti dari Loka Litbang P2B2 Ciamis. Berdasarkan acuan WHO tahun
2005, sampel yang digunakan adalah 25 ekor larva per ulangan, dengan banyaknya
pengulangan 4 kali, dengan 5 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol positif (Abate
1%), maka pada penelitian ini membutuhkan total larva sebanyak 600 larva.
Pembuatan larutan uji yang berupa ekstrak ini menggunakan daun legundi (Vitex
trifolia) serta pelarut dalam pembuatan larutan uji ini berupa etanol 96% lalu ekstraksi dengan
cara maserasi sampai mendapatkan konsentrasi 100%. Kemudian ekstrak daun legundi ini
diencerkan dengan mengguanakan aquades sehingga mendapatkan konsentrasi ekstrak
sebesar 0%, 0,25%, 0,5%, 0,75% dan 1% dalam volume 200 ml..
Telur Aedes aegypti diletakkan di dalam nampan plastik yang berisi air untuk
pemeliharaan larva. Telur akan menetas menjadi larva dalam waktu 1-2 hari. Larva akan
berkembang dari stadium I sampai stadium III selama 3-5 hari. Dalam masa
perkembangannya larva diberi makan berupa pelet ikan. Pada saat larva sudah mencapai
instar III, larva tersebut dipindahkan ke dalam gelas plastik yang berisi ekstrak daun legundi
dengan berbagai konsentrasi dan abate 1% dengan menggunakan pipet larva. Kemudian
dilakukan uji efektivitas untuk menentukan dosis efektif, LC50 dan LT50.
Untuk menghitung data yang diperoleh dari penelitian ini menggunakan analisis One
Way Anova atau Kruskal-Wallis. Bila pada uji One Way Anova atau uji Kruskal-Wallis
diperoleh hasil yang bermakna, maka setelah itu dilakukan analisis post-hoc untuk
mengetahui kelompok mana yang bermakna. Analisis post-hoc untuk mengetahui One Way
Anova adalah Bonferroni sedangkan untuk uji Kruskal-Wallis adalah Mann-Whitney. Untuk
LC50 dan LT50 menggunakan uji probit.
54 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan didapatkan persentase rerata kematian
nyamuk Aedes aegypti instar III seperti yang terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Persentase rata-rata kematian larva Aedes aegypti pada berbagai konsentrasi ekstrak
daun legundi (Vitex trifolia) dalam 4320 Menit (72 Jam).
Konsentrasi (%)
5
Persentase Rata-rata Kematian Larva (%) pada menit ke10
20
40
60
120 240 480 1440 2880 4320
0 (kontrol -)
0,25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
1
0
1
0
12
0
59
0,5
0,75
1
Abate 1% (kontrol +)
0
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
0
1
0
0
2
1
0
6
7
4
6
42
93
18
19
52
97
28
30
58
100
33
49
83
100
55
86
94
100
65
90
95
100
Data yang telah diperoleh dari hasil penelitian dihitung menggunakan analisis statistik
untuk mengetahui adanya perbedaan pengaruh dari masing-masing konsentrasi. Analisis
pertama yang dilakukan ialah menghitung distribusi data dari jumlah larva uji yang mati.
Hasil yang diperoleh berupa nilai p = 0,036 (p < 0,05) yang berarti bahwa distribusi data tidak
normal. Hasil tersebut menyebabkan tidak dapat dilakukannya uji One way Anova karena
tidak terpenuhinya syarat uji parametrik yaitu distribusi data yang normal dan varian yang
sama. Selanjutnya sebagai alternatif digunakan uji Kruskal-Wallis, dari uji hipotesis ini
diketahui nilai p = 0,001 , oleh karena nilai p < 0,05 maka itu berarti terdapat perbedaan
bermakna jumlah larva yang mati antar dua konsentrasi. Lalu dilanjutkan uji post-hoc MannWhitney untuk mengetahui konsentrasi mana yang paling bermakna dalam menyebabkan
kematian larva (p < 0,05). Data dari hasil uji post-hoc Man-Whitney disajikan dalam Tabel 2
berikut ini:
Tabel 2. Uji Statistik Perbandingan Antar Kelompok (Analisis Post-hoc Mann-Whitney).
(% )
0
0,25
0
0,25
0,013*
0,013*
0,237
0,5
0,75
0,013* 0,019*
0,013* 0,019*
1
Abate
0,008* 0,013*
(*) beda nyata pada taraf 5% (0.05).
0,5
0,75
1
Abate 1%
0,019*
0,019*
0,013*
0,225
0,046*
0,131
-
55 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
Lethal concentration 50 merupakan konsentrasi yang mampu membunuh 50% dari
total jumlah larva uji. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, didapatkan nilai LC50 yang
didapatkan dari analisis Probit:
Tabel 3. Nilai LC50 larva Aedes aegypti pada berbagai waktu pengamatan
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Waktu (menit)
5
10
20
40
60
120
240
480
1440
2880
4320
Nilai LC50 (%)
3,325
1,226
1,025
0,837
0,600
0,346
0,000
Pada tabel 3 didapatkan nilai LC50 dari menit awal hingga menit akhir mengalami penurunan
nilai. Hal ini juga dapat dilihat pada grafik berikut:
Konsentrasi (%)
3 ,5
3
LC50
(% )
2 ,5
2
K o n se n
tr asi
1%
1 ,5
1
0 ,5
0
5
10
20
40
60
120
240
480 1440 2880 4320
Waktu (menit)
Grafik 1. Nilai LC50 dari menit ke-60 sampai menit ke-4320.
Lethal Time 50 merupakan waktu yang dibutuhkan untuk membunuh 50% larva uji pada
konsentrasi tertentu. LT50 dihitung dengan menggunakan analisis probit dengan hasil:
56 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
Tabel 4. Nilai LT50 larva Aedes aegypti pada berbagai konsentrasi
No.
1
2
3
4
Konsentrasi (%)
0,25
0,5
0,75
1
Nilai LT50 (menit)
5745,63
2233,197
965,781
321,181
Nilai LT50 yang didapatkan semakin menurun pada setiap konsentrasi yang diberikan semakin
tinggi, seperti yang terlihat pada Grafik berikut:
5000
Waktu (menit)
4500
4000
3500
3000
L T 5 0 ( m e n it)
2500
2000
M e n it k e - 4 3 2 0
1500
1000
500
0
0 ,2 5 %
0 ,5 0 %
0 ,7 5 %
1%
Konsentrasi (%)
Grafik 2. Nilai LT50 pada tiap konsentrasi.
Dalam penelitian ini digunakan berbagai konsentrasi dari ekstrak daun legundi (Vitex
trifolia) yang telah diuji pada masing-masing kelompok larva. Kematian larva uji bertambah
seiring dengan bertambahnya konsentrasi dan waktu. Hal ini membuktikan bahwa semakin
tinggi konsentrasi dan semakin lama pajanan waktu maka semakin tinggi juga kematian larva
sesuai dengan teori menurut Hoedojo dan Zulhasril (2004) bahwa khasiat insektisida untuk
membunuh serangga sangat bergantung pada bentuk, cara masuk ke dalam tubuh serangga,
macam bahan kimia, konsentrasi dan jumlah (dosis) insektisida.
Pada konsentrasi 1% dari ekstrak daun legundi didapatkan 95% kematian pada larva uji
di menit ke-4320, jumlah yang paling mendekati kematian larva pada kelompok abate 1%
dengan besar kematian 100%. Menurut Komisi Pestisida (1995) penggunaan larvasida
dikatakan efektif apabila dapat mematikan 90-100% larva uji. Selain itu menurut WHO
57 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
(2005) konsentrasi larvasida dianggap efektif apabila dapat menyebabkan kematian larva uji
antara 10-95% yang nantinya digunakan untuk mencari nilai lethal concentration.
Pada uji Post hoc menggunakan Mann- Whitney antara kontrol positif (abate) dengan
konsentrasi tertinggi ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) yaitu 1%, menunjukkan nilai p =
0,131 (p>0,05) yang berarti konsentrasi 1% dibandingkan dengan abate (kontrol positif)
secara statistik tidak memiliki perbedaan yang bermakna, sehingga dapat dikatakan bahwa
perlakuan dengan konsentrasi tertinggi yaitu 1%, tidak berbeda efeknya dalam membunuh
larva jika dibandingkan dengan kontrol positif yaitu abate 1%. Hal tersebut menunjukkan
bahwa ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) dapat membunuh larva uji nyamuk Aedes aegypty
dan memiliki efektivitas larvasida pada larva Aedes aegypti.
Penelitian ini menggunakan ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) yang merupakan bahan
insektisida alami dan diduga bahwa pada daun legundi mengandung senyawa saponin,
flavonoid, dan alkaloid yang merupakan zat toksik bagi larva sehingga menyebabkan
kematian larva uji. Hal ini sesuai dengan yang diungkapkan Sprag,dkk (2004) bahwa saponin
memiliki aksi sebagai insektisida dan larvasida, serta menurut Aminah,dkk (2001) bahwa
saponin dapat menurunkan tegangan permukaan selaput mukosa traktus digestivus larva
sehingga dinding traktus digestivus larva menjadi korosif, dan menurut Dinata (2009) bahwa
senyawa flavonoid bersifat menghambat makan serangga dan juga bersifat toksis.
Pembuatan ekstrak dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol yang bersifat
non polar diduga dapat mengikat senyawa-senyawa metabolit sekunder terutama flavonoid
pada daun legundi sehingga dapat membunuh larva uji. Flavonoid bekerja sebagai inhibitor
kuat pernapasan atau sebagai racun pernapasan. Flavonoid mempunyai cara kerja yaitu
dengan masuk ke dalam tubuh larva melalui sistem pernapasan yang kemudian akan
menimbulkan kelayuan pada syaraf serta kerusakan pada sistem pernapasan dan
mengakibatkan larva tidak bisa bernapas dan akhirnya mati. Posisi tubuh larva yang berubah
dari normal bisa juga disebabkan oleh senyawa flavonoid akibat cara masuknya yang melalui
siphon sehingga mengakibatkan kerusakan sehingga larva harus mensejajarkan posisinya
dengan permukaan air untuk mempermudah dalam mengambil oksigen.
Selain itu terdapat pula kandungan saponin dan alkaloid yang bertindak sebagai racun
perut. Alkaloid berupa garam sehingga dapat mendegradasi membran sel untuk masuk ke
dalam dan merusak sel dan juga dapat mengganggu sistem kerja syaraf larva dengan
menghambat kerja enzim asetilkolinesterase. Terjadinya perubahan warna pada tubuh larva
menjadi lebih transparan dan gerakan tubuh larva yang melambat bila dirangsang sentuhan
serta selalu membengkokkan badan disebabkan oleh senyawa alkaloid.
58 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, didapatkan kesimpulan sebagai berikut:
1. Ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) memiliki efektivitas larvasida terhadap larva
Aedes aegypti instar III .
2. Konsentrasi ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) yang paling efektif dalam membunuh
larva Aedes aegypti instar III adalah konsentrasi 1%.
3. Nilai LC50 dari ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) sebagai larvasida terhadap larva
Aedes aegypti instar III sesuai standar konsentrasi tertinggi menurut WHO yaitu 1%
adalah 0,837% di menit ke-480; 0,600% di menit ke-1440; dan 0,346% di menit ke2880.
4. Nilai LT50 dari ekstrak daun legundi (Vitex trifolia) sebagai larvasida terhadap larva
Aedes aegypti instar III adalah 2233,197 menit pada konsentrasi 0,5% ; 965,781 menit
pada konsentrasi 0,75% dan 321,181 menit pada konsentrasi 1%.
B. Saran
Dari hasil penelitian peneliti menyarankan agar:
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek senyawa yang terkandung
bagian tumbuhan lainnya seperti bunga, batang dan akar yang nantinya diharapkan
dapat berfungsi sebagai larvasida.
2. Penelitian lebih lanjut dapat dilakukan mengenai senyawa-senyawa yang terkandung
dalam daun legundi selain dari flavovoid, saponin dan alkaloid yang berfungsi sebagai
larvasida.
DAFTAR PUSTAKA
Aminah N.S., Sigit S., Partosoedjono S. dan Chairul. 2001. S. lerak, D. metel dan E. prostata
Sebagai Larvasida Aedes aegypti. Cermin Dunia Kedokteran No. 131. Grup PT Kalbe
Farma. Jakarta.
Depkes RI. 2012. Laporan Kasus Demam Berdarah Dengue. Subdit Arbovirosis, Ditjen
Pemberantasan Penyakit Menular dan Penyehatan Lingkungan. Jakarta.
Depkes RI. 2011. Survei Entomologi DBD. Ditjen P3M dan PLP Depkes RI.
59 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013
ISSN 2337-3776
Depkes RI. 2011. Informasi Umum DBD 2011. Subdirektorat Pengendalian Arbovirus, Ditjen
Pemberantasan Penyakit Menular dan Penyehatan Lingkungan. Jakarta.
Dinata, A. 2009. Mengatasi DBD dengan Kulit Jengkol. www.miqraindonesia.blo gspot.com.
Diakses tanggal 1 November 2012
Direktorat Jenderal Perkebunan. 2006. Daftar Komoditi Binaan Direktorat Jenderal
Perkebunan
Berdasarkan
keputusan
Menteri
Pertanian
Nomor
511/Kpts/Pd.310/9/2006. Jakarta
Fitriani, F. 2004. Pengaruh Ekstrak Daun Legundi (Vitex trifolia L.) dalam Kosentrasi yang
Sangat Rendah Terhadap Stadium Pradewasa Nyamuk (Culex quinquefasciatus).
Skripsi. Fakultas Kedokteran Hewan. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hoedojo, R. dan S. Sungkar. 2008. Morfologi, Daur Hidup dan Perilaku Nyamuk :
Parasitologi Kedokteran Edisi Ke-4. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Jakarta. 383 hlm.
Kemenkes RI. 2010. Demam Berdarah Dengue. Pusat Data dan Surveilan Epidemiologi.
Jakarta.
Komisi Pestisida. Metode Standar Pengujian Efikasi Pestisida. Bandung: Komisi
Pestisida Bandung. 1995
Ramadhaniah, V. 2004. Pengaruh Ekstrak Daun Legundi (Vitex trifolia) terhadap
Perkembangan Pradewasa Nyamuk Aedes albopictus. Skripsi. Fakultas Kedokteran
Hewan IPB. Bogor.
Syamsuhidayat S.S. dan Hutapea J.R. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Edisi I.
Badan Penelitian Dan Pengembangan Kesehatan Depkes RI. Jakarta.
Syuifri. 2010. Uji Ekstrak Metanol Bagian Tumbuhan Legundi (Vitex trifolia) terhadap larva
Crocidolomia pavonana. Skripsi. Fakultas Pertanian Universitas Andalas. Padang.
Wardani, R.S., Mifbakhuddin, K. Yokorinanti. 2010. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Daun
Tembelekan (Lantana camara) terhadap Kematian Larva Aedes aegypti. Jurnal
Kesehatan Masyarakat Indonesia. 6(2): 30-38.
Warta. 2010. Pemanfaatan Legundi sebagai Tanaman Obat. Bogor.
World Health Organization. 2005. Guidelines for Laboratory and Field Testing of Mosquito
Larvicides. Geneva.
World Health Organization. 2011. Comperhensive Guidelines for Prevention and Control of
Dengue and Dengue Haemorrhagiz Fever. World Health Organization, Regional
Office for South-East Asia. 67 hlm.
60 | Medical Journal of Lampung University Volume 2 No 4 Februari 2013