aktivitas antifungi kitosan terhadap kapang kontaminan

Prosiding Symbion (Symposium on Biology Education),
Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Ahmad Dahlan,
27 Agustus 2016
p-ISSN: 2540-752x
e-ISSN: 2528-5726
AKTIVITAS ANTIFUNGI KITOSAN TERHADAP
KAPANG KONTAMINAN PADA IKAN KAYU
Resmila Dewi1, Endang S. Soetarto2
Mahasiswa Universitas Gadjah Mada1
Jln. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta 5228, Indonesia
Email1: [email protected]
Abstrak
Kitosan merupakan polimer hasil ekstraksi kulit udang yang dapat digunakan sebagai
pengawet makanan. Penelitian ini bertujuan untuk meneliti kehadiran jenis-jenis kapang
kontaminan pada ikan kayu yang diperoleh dari Pasar Banda Aceh dan menganalisis
aktivitas antifungi kitosan terhadap kapang. Penelitian ini diawali dengan menyiapkan
kitosan dari kulit udang. Isolasi kapang dari ikan kayu dilakukan dengan metode serial
dilution dan spread plate. Uji aktivitas antifungi kitosan dilakukan dengan metode difusi
sumur pada media PDA dengan berbagai konsentrasi (0, 0,5, 1, 1,5, dan 2%). Hasil isolasi
diperoleh tiga isolat kapang kontaminan pada ikan kayu yaitu Aspergillus flavus, A.
ochraceus, dan A. niger. Uji antifungi kitosan terhadap kapang menunjukkan bahwa kitosan
mampu membentuk zona hambat terbesar pada A. ochraceus dibandingkan kedua jenis
lainnya. Pemberian kitosan 0,5 dan 1% pada A. niger tidak terbentuk zona hambat,
sedangkan kedua jenis kapang lainnya menunjukkan adanya zona hambat dengan
pemberian kitosan 0,5%. Konsentrasi penghambatan minimum kitosan adalah pada
konsentrasi 1,5% karena dapat membentuk zona hambat terhadap A. flavus, A. ochraceus,
dan A. niger.
Kata kunci: kitosan, antifungi, kapang, ikan kayu
Pendahuluan
Ikan kayu merupakan salah satu makanan tradisional khas Aceh yang dibuat dari
ikan tongkol (Euthynnus affinis). Ikan tongkol diolah melalui serangkaian proses yaitu
pencucian, perebusan, pelapisan ikan dengan tepung terigu, dan pengeringan di bawah
sinar matahari. Pada saat dijual di pasar umumnya ikan tersebut dijual tanpa kemasan
sehingga memungkinkan ikan tersebut terkontaminasi oleh mikroba, khususnya kapang.
Hasil penelitian terdahulu (Safika, 2008) menunjukkan bahwa hampir semua ikan kayu
yang diperoleh dari pasar Banda Aceh terkontaminasi oleh Aspergillus, terutama
Aspergillus flavus dengan populasi yang bervariasi.
Hasil penelitian Putri (2015) menunjukkan bahwa ikan kayu yang dijual di 5
pasar tradisional Kota Banda Aceh positif mengandung formalin. Resiko kesehatan
yang ditimbulkan jika konsumen mengonsumsi produk yang telah terkontaminasi oleh
435
Resmila Dewi, Endang S. Soetarto – Aktivitas Fungi Kitosan....
kapang patogen maupun produk yang mengandung formalin sangat berbahaya karena
bersifat karsinogen.
Oleh karena itu perlu dilakukan suatu pencegahan kontaminasi kapang
menggunakan bahan alami yang diharapkan lebih efektif dan aman dalam upaya
menghambat pertumbuhan kapang kontaminan. Penggunaan biomaterial kitosan
merupakan salah satu cara alternatif yang dapat mengatasi permasalahan kapang
kontaminan pada bahan pangan. Kitosan merupakan biopolimer yang berlimpah di alam
pada limbah perikanan seperti kulit udang (No et al., 2002). Kitosan memiliki aktivitas
antimikroba dan tidak toksik bagi manusia (Wang, 1992; Muzzarelli, 1996; Paul et al.,
2013).
Penelitian ini bertujuan untuk meneliti kehadiran jenis-jenis kapang kontaminan
pada ikan kayu yang diperoleh dari Pasar Banda Aceh, menganalisis aktivitas antifungi
kitosan terhadap kapang, dan menentukan konsentrasi penghambatan minimum (MIC)
kitosan terhadap kapang kontaminan.
Metode
Penyiapan Kitosan dari Kulit Udang
Pembuatan kitosan menggunakan metode Hong et al. (1989) sebagaimana telah
diterapkan oleh Silvia et al. (2014). Kulit udang yang telah dihaluskan ditempatkan
dalam wadah dan ditambahkan NaOH 3,5% (1:10 b/v). Kemudian dipanaskan pada
suhu 65ºC selama 2 jam sambil diaduk. Setelah campuran dingin, disaring dan dicuci
dengan aquadest sampai pH netral dan dikeringkan (deproteinasi). Hasilnya ditimbang
dan ditambahkan HCl 1 M (1:10 b/v). Dibiarkan selama 30 menit pada suhu kamar
sambil diaduk. Setelah selesai, dicuci dengan aquadest sampai pH netral dan
dikeringkan pada suhu 65ºC hingga kering (demineralisasi). Hasil dari proses ini disebut
kitin. Hasil ditimbang dan ditambahkan NaOH 50% (1:10 b/v) dalam wadah dan diaduk
sambil dipanaskan pada suhu 100ºC selama 30 menit (deasetilasi). Setelah dingin
disaring dan dicuci sampai pH netral dan dikeringkan pada suhu 65ºC. Hasil yang
diperoleh berupa kitosan.
Isolasi Kapang dari Ikan Kayu
Isolasi kapang dilakukan dengan metode serial dilution dan spread plate.
Sebanyak 10 g sampel ikan kayu yang telah dihaluskan dilarutkan dalam 90 ml aquadest
436
Prosiding Symbion (Symposium on Biology Education),
Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Ahmad Dahlan,
27 Agustus 2016
p-ISSN: 2540-752x
e-ISSN: 2528-5726
steril dengan cara divorteks (diperoleh pengenceran 10-1). Dari larutan tersebut diambil
1 ml dan dilarutkan dalam 9 ml aquadest steril sehingga diperoleh pengenceran 10-2 dan
divorteks hingga homogen. Masing-masing suspensi hasil pengenceran diambil 0,1 ml
diinokulasikan ke dalam petridisc yang berisi media PDA. Dari masing-masing
pengenceran dibuat 2 ulangan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari.
Pengamatan dilakukan dengan mengamati pertumbuhan koloni pada permukaan media.
Koloni yang tumbuh kemudian diambil untuk dipurifikasi hingga diperoleh kultur
murni. Selanjutnya dilakukan pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis
mengacu pada Barnet dan Hunter (1998), Gandjar et al. (1999), Samson et al. (1999),
dan Watanabe (2002).
Uji Aktivitas Antifungi Kitosan terhadap Kapang
Pengujian aktivitas antifungi kitosan terhadap kapang kontaminan dilakukan
dengan metode difusi sumur (Rios et al., 1988) pada media PDA. Kapang ditumbuhkan
secara spread dipermukan media. Selanjutnya dibuat lubang sumuran menggunakan
cork borrer dengan diameter 6 mm. Setiap petridisc dibuat 6 sumuran. Sumuran diisi
dengan larutan kitosan sebanyak 25 µL sesuai dengan kelompok perlakuan. Adapun
konsentrasi kitosan yang digunakan adalah 0,5, 1, 1,5, dan 2%. Pada perlakuan kontrol
negatif digunakan 0% kitosan dan kontrol positif digunakan ketokonazole 2%. Masingmasing perlakuan terdiri dari 2 ulangan. Biakan diinkubasi selama 7 hari dan dilakukan
pengukuran diameter zona hambat dengan menggunakan penggaris dengan satuan
millimeter (mm).
Hasil dan Pembahasan
Identifikasi
mikroskopis.
kapang
Pengamatan
dilakukan
secara
dengan
makroskopis
pengamatan
dilakukan
makroskopis
dengan
dan
mengamati
karakteristik koloni yang tampak pada permukaan media PDA dan pengamatan secara
mikroskopis dilakukan dengan mengamati bentuk vesikel, metula, fialid, konidia, dan
konidiofor dengan mikroskop. Hasil penelitian diperoleh 3 jenis kapang kontaminan
pada ikan kayu yaitu Aspergillus flavus, A. ochraceus dan A. niger (Gambar 1).
437
Resmila Dewi, Endang S. Soetarto – Aktivitas Fungi Kitosan....
Gambar 1. Pengamatan kapang hasil isolasi dari ikan kayu secara makroskopis (a) dan
mikroskopis (b) ; A: Aspergillus flavus,B: A. ochraceus, dan C: A. niger.
Uji aktifitas antifungi kitosan terhadap kapang dilakukan dengan metode difusi
sumur. Pengamatan dilakukan pada hari ke-7 dengan mengukur diameter zona bening di
sekitar sumuran. Pengujian kitosan dengan menggunakan 4 seri konsentrasi (0,5; 1; 1,5;
dan 2%) terhadap 3 spesies kapang (A. flavus, A. ochraceus,dan A. niger). Hasil
pengukuran diameter zona hambat
kitosan terhadap
pertumbuhan A. flavus, A.
ochraceus dan A. niger setelah diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dapat dilihat
dalam Tabel 1.
Tabel 1. Hasil pengukuran diameter zona hambat
Spesies Kapang
Perlakuan
KK+
Kitosan 0,5 %
A. flavus
Kitosan 1%
Kitosan 1,5 %
Kitosan 2%
KK+
Kitosan 0,5 %
A. ochraceus
Kitosan 1%
Kitosan 1,5 %
Kitosan 2%
KK+
Kitosan 0,5 %
A. niger
Kitosan 1%
Kitosan 1,5 %
Kitosan 2%
Keterangan: N=2; ± SD
Diameter zona hambat (mm)
0,00±0,00
12,25±2,47
1,75±0,35
3,00±0,00
3,75±0,35
7,50±2,83
0,00±0,00
25,25±5,30
4,50±0,71
5,25±1,06
7,25±2,47
11,75±4,60
0,00±0,00
6,75±0,35
0,00±0,00
0,00±0,00
1,50±0,00
3,50±0,00
Tabel 1 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi kitosan yang diberikan
maka semakin besar zona hambat yang terbentuk. Menurut Jawetz et al. (2007) semakin
besar zona hambat yang terbentuk maka semakin baik antifunginya. Perbandingan
diameter zona hambat kitosan terhadap kapang dapat dilihat dalam Gambar 2.
438
Prosiding Symbion (Symposium on Biology Education),
Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Ahmad Dahlan,
27 Agustus 2016
p-ISSN: 2540-752x
e-ISSN: 2528-5726
.
Gambar 2. Perbandingan diameter zona hambat kitosan terhadap kapang
Gambar 2 menunjukkan bahwa kitosan mampu membentuk zona hambat
terbesar pada A.ochraceus dibandingkan kedua jenis lainnya. Pemberian kitosan 0,5 dan
1% pada A. niger tidak terbentuk zona hambat, sedangkan kedua jenis kapang lainnya
menunjukkan adanya zona hambat dengan pemberian kitosan 0,5%. Melihat variasi
diameter zona hambat yang terbentuk, menurut metode David Stout (Hutasoid et al.,
2013) bahwa bila diameter zona hambatan 20 mm atau lebih maka aktivitas
penghambatannya dikategorikan sangat kuat, 11-20 mm dikategorikan kuat, 6-10 mm
dikategorikan sedang, dan 5 mm atau kurang dikategorikan lemah.
Zona hambat kitosan terhadap A. flavus
Hasil pengukuran diameter zona hambat kitosan terhadap A. flavus
menunjukkan bahwa zona hambat tertinggi pada konsentrasi kitosan 2% dengan ratarata diameter zona hambat 7,5 mm dan daya hambat terendah pada konsentrasi 0,5%
(1,75 mm). Zona hambat pada kontrol negatif (kitosan 0%) tidak terbentuk. Zona
hambat yang terbentuk dapat dilihat dalam Gambar 3. Menurut Cappucino dan Sherman
(1999), kemampuan difusi bahan antimikroba kedalam media dan interaksinya dengan
mikroba yang diuji merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi zona hambat.
Rhoades dan Roller (2000) menyatakan bahwa pemberian kitosan akan menghambat
pertumbuhan hifa cendawan patogen dengan adanya aktivitas dari enzim-enzim
kitinase, glukanase dan senyawa antifungal lain yang terdapat dalam kitosan.
Berdasarkan penelitian Restuati (2008), kitosan dapat menghambat pertumbuhan A.
flavus dengan konsentrasi minimum 0,2%. Berdasarkan kategori David Stout (Hutasoid
439
Resmila Dewi, Endang S. Soetarto – Aktivitas Fungi Kitosan....
et al., 2013), zona hambat yang terbentuk dikategorikan lemah (kitosan 0,5, 1 dan 1,5%)
dan sedang (2%).
Gambar 3. Hasil uji penghambatan kitosan terhadap A. flavus. a) kontrol positif (ketokonazole
2%); b) kontrol negatif (kitosan 0%); c) kitosan 2%; d) kitosan 1,5%; e) kitosan 1%;
f) kitosan 0,5%.
Zona hambat kitosan terhada A. ochraceus
Hasil pengukuran diameter zona hambat kitosan terhadap A. ochraceus
menunjukkan bahwa pemberian kitosan dengan konsentrasi 2% memiliki zona hambat
terbesar (11,75 mm). Akan tetapi, diameter
zona hambat tersebut masih kecil
dibandingkan zona hambat dengan pemberian ketokonazole 2% (25,25 mm). Diameter
zona hambat pada kontrol negatif tidak terbentuk. Zona hambat yang terbentuk tersebut,
berdasarkan kategori David Stout (Hutasoid et al., 2013), dikategorikan lemah (0,5%),
sedang (1% dan 1,5%) dan kuat (2%). Pembentukan zona hambat kitosan terhadap A.
ochraceus dapat dilihat dalam Gambar 4.
Gambar 4. Hasil uji zona hambat kitosan terhadap A. ochraceus. a) kontrol positif
(ketokonazole 2%); b) kontrol negatif (kitosan 0%); c) kitosan 2%;
d) kitosan 1,5%; e) kitosan 1%; f) kitosan 0,5%.
Zona hambat kitosan terhadap A. niger
Berdasarkan uji antifungi dengan metode difusi sumur menunjukkan bahwa
pemberian kitosan dengan kosentrasi 0; 0,5; dan 1% tidak menunjukkan adanya
aktivitas antifungi terhadap A. niger yang ditandai dengan tidak terbentuknya zona
hambat. Obistioiu et al. (2014) melaporkan bahwa konsentrasi komponen senyawa aktif
440
Prosiding Symbion (Symposium on Biology Education),
Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Ahmad Dahlan,
27 Agustus 2016
p-ISSN: 2540-752x
e-ISSN: 2528-5726
antifungi yang rendah akan mengurangi aktifitas antifunginya. Zona hambat pada
biakan A. niger mulai terbentuk pada konsentrasi kitosan 1,5% (diameter zona hambat
1,5 mm) dan 2% (diameter zona hambat 3,5 mm). Berdasarkan kategori David Stout
(Hutasoid et al., 2013), zona hambat yang terbentuk pada kitosan 1,5 dan 2%
dikategorikan lemah. Pembentukan zona hambat kitosan terhadap A. niger dapat dilihat
dalam Gambar 5.
Gambar 5. Hasil uji zona hambat kitosan terhadap A. niger. a) kontrol positif
(ketokonazole 2%); b) kontrol negatif (kitosan 0%); c) kitosan 2%;
d) kitosan 1,5%; e) kitosan 1%; f) kitosan 0,5%.
Diameter zona hambat pada kontrol negatif (kitosan 0%) untuk semua spesies
kapang yang diuji tidak terbentuk. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antifungi tidak
dipengaruhi oleh pelarut (asam asetat) sehingga aktivitas antifungi yang dianalisis
merupakan potensi yang dimiliki oleh kitosan. Pada kontrol positif (ketokonazole 2%)
memiliki zona hambat yang tinggi dibandingkan dengan perlakuan konsentrasi kitosan.
Ketokonazole merupakan antifungi berspektrum luas yang berefek fungistatik dan
fungisidal. Antifungi golongan azol berinteraksi dengan C-14 α-demetilase (enzim P450 sitokrom) untuk menghambat demetilase lanosterol menjadi ergosterol.
Penghambat ini mengganggu fungsi membran sel dan meningkatkan permeabilitas sel
kapang (Katzung, 2001; Mycek et al.,2001).
Griffin (1981) menyatakan bahwa suatu antifungi mampu menghambat
pertumbuhan fungi uji dengan bekerja mempengaruhi dinding sel, membran sitoplasma,
maupun nukleus. Menurut Rogis et al. (2007) aktivitas antifungi dari kitosan terjadi
karena adanya aktivitas enzim kitinase (β-1,3-glukanase) yang dihasilkan oleh kapang
dan adanya senyawa-senyawa kimia yang terurai dari kitosan seperti polimer Dglukosamin yang bersifat toksin bagi kapang. Enzim β-1,3-glukanase mengakibatkan
kitosan terurai menjadi senyawa D-glukosamin yang akan mengurai kitin pada dinding
hifa dan sporangium kapang sehingga pertumbuhan koloni terhambat.
441
Resmila Dewi, Endang S. Soetarto – Aktivitas Fungi Kitosan....
Hernandez-Lauzardo et al. (2011) juga menyatakan bahwa, sebagai antifungi,
kitosan berinteraksi langsung dengan membran sel kapang sehingga mengganggu
permeabilitas membran dan dapat menyebabkan kematian sel. Rhoades dan Roller
(2000) mengemukakan bahwa kitosan ketika diaplikasikan ke kapang patogen akan
menghalangi germinasi dan pertumbuhan. Hal ini disebabkan karena kitosan berfungsi
sebagai agen pengkelat yang akan mengikat trace elemen dan nutrisi esensial sehingga
menyebabkan pertumbuhan kapang terganggu.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa jenis kapang yang
ditemukan mengkontaminasi ikan kayu adalah Aspergillus flavus, A. ochraceus, dan A.
niger. Kitosan memiliki aktivitas antifungi yang dapat menghambat pertumbuhan
Aspergillus. Konsentrasi penghambatan minimum kitosan adalah pada konsentrasi 1,5%
karena dapat membentuk zona hambat terhadap A. flavus, A. ochraceus, dan A. niger.
Aplikasi kitosan dapat digunakan sebagai antifungi dalam upaya menghambat
pertumbuhan Aspergillus, yaitu sebagai pengawet bahan pangan, sehingga diharapkan
intensitas serangan Aspergillus lebih rendah.
442
Prosiding Symbion (Symposium on Biology Education),
Prodi Pendidikan Biologi, FKIP, Universitas Ahmad Dahlan,
27 Agustus 2016
p-ISSN: 2540-752x
e-ISSN: 2528-5726
Daftar Pustaka
Barnett, H. L. dan Hunter. 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Burgess
Publishing Company.
Cappucino, J. G dan Sherman, N. 1999. Microbioloy A Laboratory Manual. AddisonWesley Publishing Company, New York.
Gandjar, I., Samson, R. A, Tweel-Vermeulen, K., Oetari, A. dan Santoso, I. 1999.
Pengenalan Kapang Tropik Umum. Yayasan Obor Indonesia, Jakarta.
Griffin, D. H. 1981. Fungal Physiology. John Wiley & Sons. New York.
Hernandez-Lauzardo, A. N., Miguel, G. V. V., dan Maria, G. G. 2011. Current status of
action mode and effect of chitosan against phytopathogens fungi. African
Journal of Microbiology Research. 5 (25): 4243-4247.
Hutasoit, S., I Ketut, S., I Gede. K. T. 2013 Uji Aktivitas antijamur ekstrak beberapa
jenis biota laut terhadap Aspergillus flavus LINK dan Penicillium sp. LINK. EJurnal Agroekoteknologi Tropika. 2 (1): 27-38.
Jawetz., Melnick, dan Adelberg, 2007. Mikrobiologi Kedokteran. Penerbit Buku
Kedokteran. EGC, Jakarta.
Katzung, B. G. 2001. Farmakologi Dasar dan Klinik: Obat Antijamur. Edisi 5. EGC,
Jakarta.
Muzzarelli, R. A. A. 1996. Chitosan-based dietary foods. Carbohydr Polym. 29: 309316.
Mycek, M.J., Harvey, R. A., Champe, P. C, dan Fisher, B. D. 2001. Farmakologi
Ulasan Bergambar: Obat-obat Antijamur. Edisi 2. Widya Medika, Jakarta.
No, H. K., Na, Y. P., Lee, S. H., dan Meyers S. P. 2002. Antibacterial activity of
chitosans and chitosan oligomers wit different molecular weights.
International Journal Food Microbiol. 74: 65-72.
Obistioiu, D., Cristina, R. T., Schmerold, I., Chizzola, R., Stolze, K., Nichita, I., dan
Chiurciu, V. 2014. Chemical characterization by GC-MS and in vitro activity
Candida albicans of volatile fractions prepared from Artemisia drcunculus,
Artemisia abrotanum, Artemisia absinthium, and Artemisia vulgaris. Chemistry
Central Journal. 8 (6).
Paul, J., Sharmila, J. J. W, dan Mohan, K. 2013. Development of chitosan based activity
film to extend the shelf life of minimally processed fish. International Journal
of Research in Engineering & Technology. 1 (5): 15-22.
Putri, C. N. 2015. Deteksi kandungan formalin pada ikan kayu (keumamah) di pasar
tradisional kota Banda Aceh. Electronic Thesis and Dissertation Unsyiah.
Banda Aceh.
Restuati, M. 2008. Perbandingan chitosan kulit udang dan kulit kepiting dalam
menghambat pertumbuhan kapang Aspergillus flavus. Prosiding Seminar
Nasional Sains dan Teknologi, Lampung. 582-590.
443
Resmila Dewi, Endang S. Soetarto – Aktivitas Fungi Kitosan....
Rios, J. L., Recio, M., dan Villar, A. 1988. Screening methods for natural products with
antimicrobial activity. Journal Ethnopharmacol. 23: 127-149.
Rhoades dan Roller. 2000. Antimicrobial actions actions of degraded and native
chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods. Appl
Environ Microbiol. 66 (1): 80-86.
Rogis, A., Pamekas, T., dan Mucharromah. 2007. Karakteristik dan uji efikasi bahan
senyawa alami chitosan terhadap patogen pascapanen antraknosa. JIPI. 9 (1):
58-63.
Safika. 2008. Korelasi Aspergillus flavus dengan konsentrasi aflatoksin B1 pada ikan
kayu. Jurnal Kedokteran Hewan. 2 (2): 170-175.
Samson, R. A., Hoekstra, E. S., Frisvad, J. C., dan Filtenborg, O. 1999. Introduction to
Food Borne Fungi, Ed ke-4. Ponsen & Looyen, Netherlands.
Silvia, R., Sari, W. W., dan Farida, H. 2014. Pemanfaatan kitosan dari cangkang
rajungan (Portonus sanginolentus L.) sebagai pengawet ikan kembung
(Rastrelliger sp.) dan ikan lele (Clarias batrachus). Jurnal Teknik Kimia USU.
3 (4): 18-24.
Wang, G. H. 1992. Inhibition and activation of five species of foodborne pathogens by
chitosan. Journal Food Protect. 55: 916-919.
Watanabe, T. 2002. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi: Morphologies of Cultured
Fungi and Key to species, Second Edition. CRC Press, New York.
444