bab 2 tinjauan pustaka - USU-IR

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Galingging (Albizzia lebbek BENTH)
Tumbuhan yang merupakan asli Asia Tenggara dan Australia, tumbuh baik didaerah
dengan curah hujan 600 – 2500 mm/tahun, tapi masih hidup dengan curah hujan 300 mm
kisaran ketinggian 0 – 1800 m diatas permukaan laut dan rata-rata suhu tahunan 20o35oC. Tumbuh baik pada tanah subur, dapat hidup pada tanah asam, basa, dan tergerus
air. Galingging merupakan jenis pohon dengan ketinggian 15-20 m kadang mencapai 30
m. Kulit batang abu-abu, retak dan berlapis. Daun majemuk, sirip berganda dengan 2 – 4
pasang sirip yang masing-masing terdiri dari 2 – 11 anak daun. Buah berbentuk polong
kuning pucat sampai coklat ketika masak, panjang 15 – 25 cm, lebar 3 – 5 cm
(Joker,2002).
Sistematika tumbuhan Galingging adalah sebagai berikut :
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Kelas
: Dicotyledoneae
Ordo
: Fabales
Famili
: Mimosaceae
Genus
: Albizzia
Spesies
: Albizzia lebbek BENTH
Universitas sumatera utara
Nama umum tumbuhan adalah Galingging. Nama sinonim spesies ini yaitu Acacia
lebbek Wildd, Mimosa lebbek, Mimosa sirissa Roxb. Tumbuhan ini dikenal dengan nama
Kitoke, Sunda Tarisi (Joker, 2002).
Kegunaannya yaitu antara lain, daun untuk pakan ternak dan dapat meningkatkan
unsur N dalam tanah; pohon dengan nektar bunga menghasilkan madu yang sangat baik,
kayu tergolong keras dan berkualitas tinggi, yang mana kayu A. lebbek memiliki kelas
kuat II dan kelas awet II. Di Amerika ditanam untuk menyuburkan tanah dan sebagai
peneduh (Wardani,2008).
Tanaman Galingging sudah sejak lama digunakan sebagai pengobatan tradisional.
Tanaman ini diketahui memiliki banyak khasiat terutama dalam pengobatan antiinflamatori dan analgesik. Batangnya kebanyakkan digunakan pada infeksi gigi, juga
digunakan untuk bronkhitis, lepra, paralisis, dan infeksi helmintes dan diketahui memiliki
aktivitas antidiarhoe. Bijinya digunakan sebagai astringen, aktivitas antidiabetes dan
kanker (Uma et all, 2009).
2.2 Senyawa Flavonoida
Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15
atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai
linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa
1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah senyawa 1,2 diaril propana, sedangkan
senyawa-senyawa neoflavonoida adalah 1,1 diaril propana. Istilah flavonoida diberikan
pada suatu golongan besar senyawa yang berasal dari kelompok senyawa yang paling
umum, yaitu senyawa flavon, suatu jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam
kedudukan orto, dan atom karbon benzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa
heterosoklik ini, pada tingkat oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan
tumbuhan. Flavon adalah bentuk yang mempunyai cincin C dan dianggap sebagai struktur
induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini (Manitto, 1981).
Universitas sumatera utara
Senyawa flavonoida merupakan kandungan khas tumbuhan hijau kecuali alga.
Flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit,
tepung sari, bunga buah dan biji. Ada juga flavonoida yang terdapat pada hewan misalnya
dalam kelenjar bau berang-berang, dalam sekresi lebah, dan di dalam sayap kupu-kupu,
dengan anggapan bahwa flavanoida tersebut berasal dari tumbuhan yang menjadi
makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka. (Markham,
1988).
Flavonoida merupakan senyawa 15-karbon yang umumnya tersebar di seluruh
dunia tumbuhan. Lebih dari 2000 flavonoida yang berasal dari tumbuhan telah
diidentifikasi. Kerangka dasar flavonoida biasanya diubah sedemikian rupa sehingga
terdapat lebih banyak ikatan rangkap, menyebabkan senyawa itu menyerap cahaya
tampak, dan ini membuatnya berwarna.
Ada tiga kelompok flavonoida yang amat menarik perhatian dalam fisiologi
tumbuhan, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin adalah pigmen berwarna
yang umunya terdapat di bunga berwarna merah, ungu, dan biru. Pigmen ini juga terdapat
di berbagai bagian tumbuhan lain, misalnya buah tertentu, batang, daun, dan bahkan akar.
Sering flavonoida terikat di sel epidermis. Warna sebagian besar buah dan banyak bunga
adalah akibat dari antosianin, walaupun beberapa warna tumbuhan lainnya, seperti buah
tomat dan beberapa bunga kuning, karena karotenoid. Warna cerah daun musim gugur
disebabkan terutama oleh timbunan antosianin pada hari cerah dan dingin, walaupun
karotenoid kuning atau jingga merupakan pigmen terbesar di daun musim gugur pada
beberapa spesies.
Antosianin umumnya tidak terdapat di lumut hati, ganggang, dan tumbuhan
tingkat rendah lainnya, walaupun beberapa antosianin dan flavonoida ada di lumut
tertentu. Antosianin jarang ditemui di gimnospermae, walaupun gimnospermae
mengandung jenis lain dari flavonoida. Beberapa macam antosianin terdapat di tumbuhan
tingkat tinggi, dan sering lebih dari satu macam terdapat di bunga tertentu atau organ lain.
Universitas sumatera utara
Mereka dijumpai dalam bentuk glikosida, biasanya mengandung satu atau dua unit
glukosa atau galaktosa yang tertempel pada gugus hidroksil di cincin tengah, atau pada
gugus hidroksil di posisi 5 cincin A. Bila gula dihilangkan, maka bagian sisa molekul,
yang masih berwarna, dinamakan antosianidin (Salisbury, 1995).
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti fenolat
yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat
digambarkan sebagai berikut :
A
C
C
C
B
Gambar 2.1 Kerangka dasar senyawa flavonoida
(Sastrohamidjojo, 1996)
Dimana terdapat dua cincin aromatik yang dihubungkan tiga satuan atom karbon yang
dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga.
Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil, atau suatu gula, flavonoida
merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoida cukup larut dalam pelarut polar
seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air dan
lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida (bentuk yang umum ditemukan)
cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air (Markham, 1988).
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita
serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
Universitas sumatera utara
umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida. (Harborne,
1996). Dalam tumbuhan, flavonoida terdapat dalam berbagai struktur. Keragaman ini
disebabkan oleh perbedaan tahap modifikasi lanjutan dari struktur dasar flavonoida
tersebut, antara lain :
1. Flavonoida O-glikosida, satu gugus hidroksil flavonoida (atau lebih) terikat pada
satu gula (lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh
glikosilasi menyebabkan flavonoida menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut
dalam air. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang
sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa. Gula lain
yang kadang-kadang ditemukan adalah alosa, manosa, fruktosa, apiosa, dan asam
glukoronat serta galakturonat.
2. Flavonoida C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal
ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbonkarbon yang tahan asam. Glikosida yang demikian disebut C-glikosida. Jenis gula
yang terlibat ternyata jauh lebih sedikit ketimbang jenis gula pada O-glukosa,
biasanya dari jenis glukosa yang paling umum, dan juga galaktosa, ramnosa,
xilosa, dan arabinosa.
3. Flavonoida sulfat, senyawa ini mengandung satu ion sulfat, atau lebih, yang
terikata pada hidroksil fenol atau gula. Senyawa ini sebenarnya bisulfat karena
terdapat sebagai garam, yaitu flavon-O-SO3K. Banyak yang berupa glikosida
bisulfat, bagian bisulfat terikat pada hidroksil fenol yang mana saja yang masih
bebas atau pada gula.
4. Biflavonoida, yaitu flavonoida dimer. Flavonoida yang biasanya terlibat adalah
flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang
sederhana 5,7,4’ dan ikatan antar flavonoida berupa ikatan-ikatan karbon atau
kadang-kadang
eter.
Monomer
flavonoida
yang
digabungkan
menjadi
biflavonoida dapat berjenis sama atau berbeda, dan letak ikatannya berbeda-beda.
Universitas sumatera utara
Biflavonoida jarang ditemukan sebagai glikosida, dan penyebarannya terbatas,
terdapat terutama pada gimnospermae.
5. Aglikon flavonoida yang aktif-optik, sejumlah aglikon flavonoida mempunyai
atom karbon asimetrik dan dengan demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu
memutar cahaya terpolarisasi-datar). Yang termasuk dalam golongan flavonoida
ini adalah flavanon, dihidroflavonol, katekin, rotenoid, dan lain-lain (Markham,
1988).
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan
keragaman pada rantai C3 yaitu :
1. Flavonol
Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon
flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai
antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan
merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa
dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada
pengerjaannya masih dapat dilakukan.
O
OH
O
Flavonol
2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-hidroksi.
Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya. Flavon
terdapat juga sebagai glikosidanya, lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol.
Flavon yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Luteolin merupakan zat
Universitas sumatera utara
warna yang pertama kali dipakai di Eropa. Jenis yang paling umum adalah 7-glukosida
dan terdapat juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya
luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok
senyawa flavonoida.
O
O
Flavon
3. Isoflavon
Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai
fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan
terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan
pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna
biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain
tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.
O
O
Isoflavon
4. Flavanon
Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga.
Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah
Jeruk, dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam
buah anggur dan jeruk.
Universitas sumatera utara
O
O
Flavanon
5. Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika
dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O
OH
O
Flavanonol
6. Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.
Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir
dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat
sebagai antioksidan.
OH
OH
HO
O
OH
OH
Katekin
Universitas sumatera utara
7. Leukoantosianidin
Leukoantosianidin merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan
berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.
O
OH
HO
OH
Leukoantosianidin
8. Antosianin
Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam
tumbuhan. Pigmen yng berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir
semua warna merah jambu, merah marak , ungu, dan biru dalam daun, bunga, dan buah
pada tumbuhan tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur
aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan
penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.
O
OH
Antosianin
9.Khalkon
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar UV bila
dikromatografi kertas. Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya
pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam
pengembang air (Harborne, 1996).
Universitas sumatera utara
O
Khalkon
10. Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita.
Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas
berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah
jingga bila diberi uap ammonia (Robinson, 1995).
O
HC
O
Auron
Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua
flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan
semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni:
Tabel 2.2 Golongan-golongan flavonoida menurut Harborne
Golongan
Penyebaran
Ciri khas
flavonoida
Antosianin
Pigmen bunga
merah Larut dalam air, λmaks 515-545
marak dan biru, juga nm, bergerak dengan BAA pada
dalam daun dan jaringan kertas
lain
Proantosianidin
Terutama
dalam daun
berkayu
Flavonol
Terutama
tan
warna, Menghasilkan antosianidin bila
tumbuhan jaringan dipanaskan dalam HCl
2M selama setengah jam
ko-pigmen Setelah hidrolisis, berupa bercak
tanwarna dalam bunga kuning murup pada kromatogram
Universitas sumatera utara
sianik
dan
asianik, Forestal bila disinari sinar UV
tersebar luas dalam daun
Flavon
Seperti flavonol
Maksimal spektrum pada 330 –
350 setelah hidrolisis, berupa
bercak
coklat
redup
pada
kromatogram Forestal
Glikoflavon
Seperti flavonol
Maksimal spektrum pada 330-350
nm mengandung gula yang terikat
melalui
ikatan
C-C,
bergerak
dengan pengembang air, tidak
seperti
flavon
biasa,
pada
kromatogram BAA berupa bercak
redup dengan RF tinggi, dengan
amonia
berwarna
merah,
maksimal spektrum 370-410 nm
Biflavonil
Tanwarna,
hampir Pada kromatogram BAA beupa
seluruhnya terbatas pada bercak redup dengan RF tinggi,
gimnospermae
Khalkon dan auron
dengan amonia berwarna merah
Pigmen bunga kuning, Maksimal spektrum 370-410 nm
kadang-kadang terdapat berwarna
juga dalam jaringan lain
merah
kuat
dengan
Mg/HCl, kadang – kadang sangat
pahit
Flavanon
Tanwarna, dalam daun Bergerak
dan
buah
pada
kertas
dengan
(terutama pengembang air
dalam Citrus )
Isoflavon
Tanwarna,
sering
kali Tak ada uji warna yang khas
dalam akar
Universitas sumatera utara
2.2.3 Sifat Kelarutan Flavonoida
Aglikon flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa
fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat, bila
dibiarkan dalam larutan basa, dan disamping itu terdapat oksigen, banyak yang akan
terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil, atau suatu gula, flavonoida
merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoida cukup larut dalam pelarut polar
seperti etanol (EtOH), metanol (MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida
(DMSO), dimetilformamida (DMF), air dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada
flavonoida (bentuk yang umum ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoida lebih
mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut yang disebut diatas dengan
air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang
polar seperti isoflavon, flavanon dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung
lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform.
(Markham, 1988)
2.3 Teknik Pemisahan Ekstraksi
Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan
berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen lainnya. Ada
2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya
perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan
dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaanperbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk
dalam suatu golongan (Muldja, 1995).
Universitas sumatera utara
Ekstraksi merupakan suatu proses selektif yang dilakukan untuk mengambil zatzat yang terkandung dalam suatu campuran dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
Metode pemisahan ini bekerja berdasarkan prinsip like dissolve like, yaitu pelarut polar
akan melarutkan zat polar dan sebaliknya (Khopkar,1990).
Metode maserasi digunakan untuk mengekstrak komponen, baik yang tidak tahan
panas maupun yang tahan panas. Metode ini dilakukan hanya dengan merendam sampel
pada suatu pelarut dengan lama waktu tertentu tanpa menggunakan pemanasan
(Meloan,1999).
Ekstraksi dapat juga dilakukan dengan sokletasi, dan perkolasi. Sebelum ekstraksi
dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat
kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan
metode sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan
kepolarannya, misalnya n-heksana, eter, benzena, kloroform, etilasetat, etanol, metanol,
dan air. Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif
terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat
biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotarievaporator (Harborne,
1996).
2.4 Kromatografi
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan
dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk lapisan
stasioner denagn luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang
merembes lewat. Fasa stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fasa yang
bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas (Underwood, 1981).
Universitas sumatera utara
Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-molekul
campuran terserap didalam pori-pori partikel atau terbagi dalam sejumlah cairan yang
terikat pada permukaan atau dalam pori (Khopkar,1990).
Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat – sifat dari fasa
diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa diam berupa zat padat disebut
kromatografi serapan, jika berupa zat cair disebut kromatografi partisi. Karena fasa gerak
dapat berupa zat cair atau gas maka ada empat macam sistem kromatografi yaitu:
1) Fasa gerak cair–fasa diam padat (kromatografi serapan):
a.kromatografi lapis tipis
b.kromatografi penukar ion
2) Fasa gerak gas–fasa diam padat, yakni kromatografi gas padat.
3) Fasa gerak cair–fasa diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi kertas.
4) Fasa gerak gas–fasa diam zat cair, yakni :
a. kromatografi gas–cair
b. kromatografi kolom kapiler
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa
senyawa – senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fasa gerak dan fasa diam dalam
perbandingan yang sangat berbeda – beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain
(Sastrohamidjojo, 1985).
2.4.1 Kromatografi Lapis Tipis
Teknik kromatografi lapis tipis (TLC) menggunakan suatu adsorben yang tersalutkan
pada suatu lempeng sebagai fasa stasionernya dan pengembangan kromatogram terjadi
ketika fase mobil melewati adsorben tersebut (Bassett,1994).
Universitas sumatera utara
Penjerap yang sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme yang utama adalah partisi dan adsorbsi. Lempeng yang digunakan
juga biasanya sudah dimodifikasi. Fase gerak pada KLT dapat dipilih berdasarkan
percobaan. Sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan campuran dua
pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur
sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal (Rohman,2009).
Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik
alam dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat
yang harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5
g dapat ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah
cuplikan yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode
pemisahan yang cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi
silika gel dengan menggunakan pelarut tertentu (Gritter,1991).
Nilai utama Kromatografi Lapis Tipis pada penelitian senyawa flavonoida ialah
sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham,
Kromatografi Lapis Tipis terutama berguna untuk tujuan berikut:
1. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
2. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom
3. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi.
4. Isolasi flavonoida murni skala kecil
5. Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap
dan pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas (Markham,
1988).
Universitas sumatera utara
2.4.2 Kromatografi Kolom
Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode kromatografi
terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Pada kromatografi kolom,
campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap
yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak
dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau
didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang
berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Gritter,
1991).
Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir
ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida
(berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika atau
poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang
cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu
ujung (Markham, 1988).
Data kromatografi dari suatu noda ditentukan dari harga Rf. Fasa diam
menghambat laju perpindahan noda karena adanya adsorpsi. Pergerakan noda berbeda
tergantung kekuatan adsorpsinya. Perbandingan antara jarak yang ditempuh noda dengan
jarak yang ditempuh pelarut disebut harga Rf. Harga Rf noda dapat dihitung dengan
mengukur panjang jarak antara pelarut dan noda dari jarak pada titik penotolan.
Jarak pergerakan noda dari titik penotolan
Rf =
Jarak pergerakan pelarut dari titik penotolan
(David,2001)
Universitas sumatera utara
2.5 Teknik Spektroskopi
Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia–fisika yang mengamati
tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam
instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen
yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai
spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat
fotoelektrik maka disebut spektrofotometer (Muldja, 1995).
Radiasi elekromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam
bentuk gelombang-gelombang. Tiap tipe radiasi elektromagnetik dicirikan oleh panjang
gelombangnya yaitu jarak antara puncak panjang gelombang yang satu
ke puncak
panjang gelombang berikutnya. Panjang gelombang cahaya tampak berkisar antara 400
nm sampai 750 nm, panjang gelombang yang sedikit lebih pendek daripada panjang
gelombang cahaya tampak jatuh pada daerah ultraviolet, sedangkan yang sedikit lebih
panjang termasuk dalam daerah inframerah (Fessenden, 1982).
2.5.1 Spektrofotometri Ultra Violet
Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung pada
struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan
percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi
di dalam keadaan tereksitasi (Silverstein, 1986).
Dengan bertambahnya kepolaran pelarut, pada transisi elektron terjadi pergeseran
panjang gelombang. Bentuk puncak bergeser ke panjang gelombang lebih pendek
(pergeseran biru atau hipsokromik) disebabkan bertambahnya solvasi pasangan elektron
sehingga berakibat energinya turun. Sedangkan pergeseran ke panjang gelombang lebih
panjang (pergeseran merah atau batokromik) disebabkan gaya polarisasi antara pelarut
Universitas sumatera utara
dan spesies, berakibat menurunnya selisih tingkat energi eksitasi dan tingkat tidak
tereksitasi (Khopkar, 1990).
Spektrum flavonoida biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol
(MeOH) atau etanol (EtOH). Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi
maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoida dan
pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum tersebut ialah kekuatan nisbi yang rendah pada
pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada
spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang
tinggi. Ciri spektrum golongan flavonoida utama dapat ditunjukkan sebagai berikut :
Tabel 2.5 Rentangan Serapan spektrum UV-Visible golongan flavonoida
Pita II (nm)
Pita I (nm)
Jenis flavonoida
250-280
310-350
Flavon
250-280
330-360
Flavonol (3-OH tersubstitusi)
250-280
350-385
Flavonol (3-OH bebas)
310-330 bahu
Isoflavon
Kira-kira 320 puncak
Isoflavon (5-deoksi-6,7-dioksigenasi
300-330 bahu
Flavanon dan dihidroflavonol
340-390
Khalkon
380-430
Auron
465-560
Antosianidin dan antosianin
245-275
275-295
230-270
(kekuatan rendah)
230-270
(kekuatan rendah)
270-280
(Markham, 1988)
Universitas sumatera utara
2.5.2 Spektrofotometri Inframerah (FT-IR)
Kebanyakan komponen memiliki ikatan kovalen baik senyawa organik maupun senyawa
anorganik, yang ditemukan menyerap frekuensi radiasi elektromagnetik pada daerah
spektrum inframerah. Spektrum elektromagnetik daerah inframerah terletak pada panjang
gelombang lebih panjang dibanding dengan daerah sinar tampak (400-800 nm) tetapi
panjang gelombangnya lebih pendek dibanding dengan panjang gelombang radio (1 cm).
Pancaran inframerah yang kerapatannya kurang dari 100 cm
-1
(panjang
gelombang lebih daripada 100 µm) diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah
menjadi energi putaran molekul. Pancaran inframerah antara 10000 – 10 cm-1 diserap oleh
sebuah molekul organik dan diubah menjadi energi vibrasi molekul. Spektrum vibrasi
tampak bukan sebagai garis-garis melainkan berupa pita-pita. Hal tersebut disebabkan
perubahan energi vibrasi tunggal selalu disertai sejumlah perubahan energi rotasi.
Panjang gelombang daerah vibrasi inframerah pada 4000 cm-1 dan 666 cm-1 (2,5 – 1,5µm)
(Silverstein, 1986).
Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe – tipe dari adanya gugus
fungsi dalam satu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi
tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang
menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan
data yang ada kadang – kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekul yang
tidak diketahui. (Pavia, 1979).
Vibrasi molekul dapat dibagi dalam dua golongan , yaitu :
1. Vibrasi regang
Di sini terjadi terus menerus perubahan jarak antara dua atom di didalam suatu
molekul. Vibrasi regang ini ada dua macam yaitu vibrasi regang simetris dan tak
simetri.
Universitas sumatera utara
2.Vibrasi lentur
Di sini terjadi perubahan sudut antara dua ikatan kimia. Ada empat macam vibrasi
lentur yaitu vibrasi lentur dalam bidang yang dapat berupa vibrasi scissoring atau
vibrasi rocking dan vibrasi keluar bidang yang dapat berupa waging atau berupa
twisting (Noerdin, 1985).
Banyaknya cuplikan yang diperlukan sangat bergantung pada spektrofotometer
yang digunakan. Bila spektrofotometer jenis lama diperlukan 5-25 mg cuplikan untuk
menghasilkan spektrum yang dapat diterima. Spektrofotometer yang lebih mutakhir yang
dilengkapi dengan Transform-Fourier mampu manghasilkan spektrum sangat baik
sdengan hanya 0,1 mg cuplikan (Markham, 1988).
2.5.3 Spektrometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan
alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan
informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul. Struktur NMR
memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen
dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom
hidrogen (Cresswell, 1982).
Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua protonproton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa kadang-kadang
menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa memberikan penaikan
menjadi puncak absorbsi tunggal dalam spektrum NMR. Di dalam medan magnet,
perputaran elektron-elektron valensi dari proton menghasilkan medan magnet yang
melawan medan magnet yang digunakan. Hingga setiap proton dalam molekul dilindungi
dari medan magnet yang digunakan dan bahwa besarnya perlindungan ini tergantung
pada kerapatan elektron yang mengelilinginya. Makin besar kerapatan elektron yang
Universitas sumatera utara
mengelilingi inti, maka makin besar pula medan yang dihasilkan yang melawan medan
yang digunakan (Bernasconi,1995).
Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah
tetrametilsilana (TMS). Beberapa keuntungan dari pemakaian standar internal TMS yaitu
:
1. TMS mempunyai 12 proton yang setara sehingga akan memberikan spektrum
puncak tunggal yang kuat.
CH3
CH3
Si
CH3
CH3
2. TMS merupakan cairan yang mudah menguap, dapat ditambahkan kedalam
larutan sampel dalam pelarut CDCl3 atau CCl4 (Silverstein, 1986).
Pada spektrometri RMI integrasi sangat penting. Harga integrasi menunjukkan
daerah atau luas puncak dari tiap – tiap proton . Sedangkan luas daerah atau luas puncak
tersebut sesuai dengan jumlah proton. Dengan demikian perbandingan tiap integrasi
proton sama dengan perbandingan jumlah proton dalam molekul (Muldja,1995).
Universitas sumatera utara