5 BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. VIRUS INFLUENZA Virus

5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. VIRUS INFLUENZA
Virus influenza merupakan anggota family Orthomyxoviridae. Partikel
virus influenza memiliki struktur bulat dengan diameter sekitar 100 nm.
Perbedaan antigen ditunjukkan oleh dua protein stuktural internal, yaitu
protein nukleokapsid dikode oleh gen NP dan protein matriks dikode oleh
gen M. Perbedaan tersebut digunakan untuk mengelompokkan virus
influenza menjadi tipe A, B, dan C. Influenza tipe A menginfeksi manusia dan
hewan, influenza tipe B menginfeksi manusia, sedangkan influenza tipe C
menginfeksi manusia dan babi (Horimoto & Kawaoka 2001: 130--131).
Genom RNA untai tunggal virus influenza A dan B tersusun dalam 8
segmen RNA, sedangkan virus influenza C mengandung 7 segmen RNA.
Virus influenza C tidak memiliki gen NA pengkode neuraminidase. Sebagian
besar segmen mengkode satu protein. Dua belas nukleotida pertama pada
tiap segmen merupakan segmen penting dalam transkripsi virus (Brooks dkk.
2005: 209).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
6
B. VIRUS INFLUENZA TIPE A
Virus influenza tipe A diketahui dapat menginfeksi burung, babi, kuda,
anjing laut, dan manusia. Genom virus influenza tipe A berupa RNA untai
tunggal, negative sense, dengan panjang sekitar 13.558 nukleotida tersusun
dalam 8 segmen dan mengkode 10 macam protein. Kedelapan segmen
tersebut mengkode protein polymerase basic (PB1 dan PB2), polymerase
acidic (PA), hemaglutinin (HA), nukleoprotein (NP), neuraminidase (NA),
matriks (M1 dan M2), serta nonstruktural (NS1 dan NS2) (Gambar 1)
(Asmara 2007: 3).
Variasi antigen glikoprotein permukaan sel virus, yaitu hemaglutinin
dan neuraminidase digunakan untuk menentukan subtipe virus. Terdapat 16
subtipe gen HA (H1--H16) dan 9 subtipe gen NA (N1--N9) (Swayne
2004: 80). Perubahan antigen glikoprotein permukaan sel virus terus terjadi
pada virus influenza tipe A karena adanya mutasi. Mutasi tersebut
menyebabkan variasi antigen glikoprotein virus dan menjadi penyebab
sebagian besar kasus epidemi influenza (Tumpey dkk. 2002: 6349).
C. AVIAN INFLUENZA
Avian influenza (AI) adalah penyakit yang disebabkan oleh virus avian
influenza A. Virus AI memiliki banyak variasi antigen glikoprotein permukaan,
yaitu hemaglutinin dikode oleh gen HA dan neuraminidase dikode oleh gen
NA. Hemaglutinin berperan dalam proses penempelan virus pada reseptor
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
7
permukaan sel inang, sedangkan neuraminidase berperan dalam proses
hidrolisis ikatan antara galaktosa dan N- acetylneraminic pada rantai ujung
oligosakarida-glikoprotein untuk melepaskan partikel virus yang telah
bereplikasi dalam sel (Gambar 2) (Asmara 2007: 1).
Virus influenza isolat asal manusia mempunyai spesifisitas terhadap
reseptor N-acetylneuraminic acid α-2,6-galactose, sedangkan virus AI isolat
ayam cenderung mengenali dan berikatan dengan reseptor oligosakarida
yang mengandung N-acetylneuraminic acid α-2,3-galactose (Radji 2006: 60).
Penelitian molekular menunjukkan bahwa reseptor α-2,3-sialic acid terdapat
pada jaringan tracheobronchial, epitel bersilia pada bronkus, pneumosit
alveoli, dan metaplastic epithelium manusia. Keberadaan reseptor tersebut
menyebabkan virus AI dapat menginfeksi manusia (Nicholls dkk. 2007: 3).
Berdasarkan virulensi pada unggas, virus AI dibedakan menjadi low
pathogenic avian influenza (LPAI) dan highly pathogenic avian influenza
(HPAI). Virus HPAI memiliki hemaglutinin yang sangat peka terhadap
protease endogen atau selular sel inang, sedangkan virus LPAI
membutuhkan protease ekstraselular aktif spesifik seperti tripsin. Analisis
molekular menunjukkan adanya perbedaan susunan asam amino pada
hemagglutinin cleavage site, yaitu adanya multiple amino acid sequence
pada virus HPAI. Sekuen tersebut mengandung 5 arginin dan 2 lisin.
Subtipe H5 dan H7 merupakan HPAI pada ayam, tetapi tidak semua isolat
subtipe H5 dan H7 dikarakteristik sebagai HPAI (Olender 2006: 1).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
8
D. PATOGENISITAS AVIAN INFLUENZA
Patogenisitas adalah kemampuan yang dimiliki oleh agen penyakit
sehingga seseorang atau sekelompok penduduk yang terinfeksi menjadi
sakit. Virus AI dapat menyebabkan wabah epidemi dan pandemi. Wabah
epidemi adalah timbulnya suatu penyakit yang menyerang sekelompok
masyarakat dalam suatu wilayah yang sama dengan angka kejadian melebihi
angka normal dari kejadian penyakit tersebut, sedangkan pandemi
merupakan wabah penyakit yang menyerang masyarakat pada beberapa
wilayah lebih luas (Capua & Alexander 2002: 2--3).
Epidemi influenza disebabkan oleh fenomena antigenic drift atau
mutasi titik pada protein hemaglutinin (HA) atau neuraminidase (NA) virus
influenza. Mutasi titik tersebut dapat terjadi setiap beberapa tahun (Capua &
Alexander 2002: 2--3). Pandemi influenza disebabkan oleh fenomena
antigenic shift atau pergeseran genetik, sehingga menimbulkan strain virus
influenza baru dengan kombinasi genom baru yang terjadi setiap beberapa
dekade. Pandemi influenza dapat menyebabkan tingkat kematian tinggi
karena populasi yang terinfeksi tidak memiliki imunitas terhadap strain virus
baru (Cinti 2005: 61).
Penularan AI dapat terjadi karena droplet infection (infeksi akibat
percikan cairan hidung/mulut), serta kontak langsung dan tidak langsung
dengan unggas yang terinfeksi AI. Infeksi dan replikasi primer virus terjadi di
sel epitel kolumnar saluran pernafasan. Fase penempelan pada reseptor
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
9
α-2,3-sialic acid sel inang merupakan fase paling menentukan dari
kemampuan virus masuk ke dalam sel inang dan melanjutkan replikasi. Virus
AI melalui spikes hemaglutinin akan berikatan dengan reseptor α-2,3-sialic
acid pada permukan sel inang (Russell & Webster 2005: 369).
Masa inkubasi virus AI tipe A berkisar antara 2--4 hari setelah
terinfeksi. Sebagian besar pasien yang terinfeksi virus AI memperlihatkan
gejala awal berupa demam tinggi (biasanya lebih dari 38° C), dan gejala flu,
serta kelainan saluran pernapasan. Gejala lain yang timbul adalah diare,
muntah, sakit perut, sakit pada dada, hipotensi, dan terjadi pendarahan dari
hidung serta gusi. Gejala sesak napas mulai terjadi setelah satu minggu
berikutnya (Chotpitayasunondh dkk. 2005: 203).
E. PROTEIN NEURAMINIDASE VIRUS INFLUENZA
Protein neuraminidase virus influenza A merupakan glikoprotein yang
diekspresikan pada permukaan sel. Kemampuan neuraminidase memecah
sialic acid (SA) membantu virus berpenetrasi ke dalam mukus organisme
terinfeksi. Sembilan subtipe gen NA telah teridentifikasi mengkode ekspresi
neuraminidase dengan bentuk tetramer dan struktur kepala globular, daerah
tangkai tipis, serta daerah hidrofobik yang memungkinkan protein menempel
pada permukaan sel (Gambar 3) (Reid dkk. 2000: 6785).
Protein neuraminidase terdiri atas rantai polipeptida tunggal yang
memiliki orientasi berlawanan dengan antigen hemaglutinin. Rantai
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
10
polipeptida tunggal tersebut mengandung 6 rantai tunggal asam amino polar.
Situs aktif membentuk kantung pada bagian permukaan yang setiap
subunitnya disusun oleh 15 asam amino. Asam amino tersebut terdapat
pada semua virus influenza A (Reid dkk. 2000: 6785). Segmen genom
pengkode neuraminidase (NA) memiliki berat molekul 50 kD tersusun atas
1.413 nukleotida (Brooks dkk. 2005: 211).
F. UJI DIAGNOSTIK AVIAN INFLUENZA
1. Kultur virus
Virus dapat diisolasi dan diperbanyak dengan kultur sel, yaitu
menumbuhkan sel yang terinfeksi virus secara in vitro. Teknik tersebut dapat
digunakan untuk identifikasi, karakterisasi antigen, dan genetik virus.
Fasilitas biosafety level-3 (BSL-3) diperlukan untuk melakukan kultur virus
karena virus AI memiliki virulensi tinggi dan ditularkan melalui udara. Media
digunakan untuk kultur yaitu madin-darby canine kidney cells (MDCK) atau
embrio telur ayam. Identifikasi dan deteksi hasil dapat dilakukan dengan
PCR, immunofluorescence (IFA) menggunakan antibodi monoklonal spesifik,
atau dengan haemagglutination (HA), serta analisis antigen dengan
haemagglutination-inhibition (HI) menggunakan serum anti AI (WHO
2007: 21).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
11
2. Deteksi antigen
Deteksi antigen virus AI bertujuan menemukan virus influenza
intraselular di spesimen penderita. Metode yang digunakan adalah IFA dan
enzyme immuno assay (EIA). Hasilnya dapat diketahui dalam waktu 15--30
menit. Lima macam pemeriksaan antigen virus metode EIA sudah tersedia
secara komersial, tetapi sensitivitas tes bergantung pada kualitas sampel
atau isolat, kualitas reagen, dan ketrampilan personal laboratorium.
Penambahan IgG fluorescent isothiocyanate conjugated (FITC) diperlukan
untuk fluoresensi ikatan kompleks antigen dan antibodi. Hasil positif jika
ditemukan fluoresensi hijau kekuningan di inti atau sitoplasma pada satu atau
lebih sel utuh (Mulyadi & Prihatini 2005: 77).
3. Deteksi antibodi spesifik
Deteksi antibodi spesifik digunakan untuk menemukan antibodi
spesifik influenza. Beberapa cara digunakan yaitu HI, complement fixation
(CF), EIA, dan uji netralisasi misalnya microneutralization assay (MN).
Deteksi antibodi spesifik membutuhkan sampel serum akut dan
penyembuhan, dengan peningkatan titer sebesar empat kali atau lebih untuk
dapat mendiagnosis influenza A (WHO 2007: 13).
Beberapa uji yang umum digunakan saat ini yaitu MN, CF, dan
fluorescent antibody. Prinsip uji MN adalah mengetahui adanya antibodi
dalam serum yang dapat menetralisasi infeksi virus spesifik. Prinsip uji CF
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
12
yaitu menemukan antibodi dalam serum penderita yang dapat berikatan
dengan komplemen sehingga hemolisis eritrosit tidak terjadi. Prinsip
fluorescent antibody adalah pewarnaan dengan fluorescein atau rhodamine
yang dapat berikatan dengan molekul antibodi dan dapat dilihat dengan
mikroskop fluoresen (Mulyadi & Prihatini 2005: 79).
4. Deteksi genom avian influenza dengan reverse transcription polymerase
chain reaction (RT-PCR)
Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu metode
memperbanyak sekuen DNA spesifik secara in vitro (Russell 1994: 304).
Prinsip metode PCR adalah perbanyakan segmen DNA spesifik dengan
menggunakan DNA polymerase dan primer oligonukleotida (Klug &
Cummings 1994: 402). Komponen-komponen yang diperlukan dalam reaksi
PCR adalah ddH2O atau akuabides steril, buffer PCR, deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP), MgCl2, primer, enzim DNA polymerase, dan DNA cetakan
(Yuwono 2006: 26).
Siklus PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan
polimerisasi (Gambar 4). Denaturasi adalah tahap dalam siklus PCR yang
memisahkan DNA utas ganda menjadi utas tunggal dan menghentikan
semua reaksi enzimatik, dilakukan pada suhu tinggi, yaitu 92--94° C.
Annealing adalah tahap perlekatan primer pada masing-masing utas tunggal
DNA yang mengapit daerah sekuen DNA spesifik untuk diperbanyak,
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
13
dilakukan pada suhu lebih rendah, yaitu 25--65° C. Polimerisasi adalah
tahap pemanjangan primer dengan bantuan Taq DNA polymerase, dilakukan
pada suhu lebih tinggi dari tahap annealing, yaitu 70--75° C (Raven &
Johnson 2002: 398).
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) merupakan
teknik PCR paling sensitif untuk mendeteksi genom virus dengan bantuan
enzim reverse transcriptase, serta untuk mengetahui kuantitas messenger
ribonucleic acid (mRNA). Enzim reverse transcriptase dimiliki oleh retrovirus,
seperti avian myeloblastosis virus (AMV), moloney murine leukemia virus
(MMLV), atau human immunodeficiency virus (HIV). Reverse transcriptase
merupakan enzim multifungsional dengan 3 aktivitas enzim, yaitu RNAdependent DNA polymerase, hybrid-dependent exoribonuclease (RNase H),
dan DNA-dependent DNA polymerase (Qiagen 2004: 9)
Beberapa teknik RT-PCR yang umum digunakan untuk uji diagnostik
penyakit infeksi virus dan bakteri antara lain, one-step RT-PCR, two-step RTPCR, nested RT-PCR, dan multiplex RT-PCR. Teknik two-step RT-PCR
menggunakan 2 jenis enzim, yaitu reverse transcriptase dan DNA
polymerase. Reverse transcriptase digunakan secara in vitro untuk sintesis
untai pertama cDNA dari RNA (Gambar 5). Complementer deoxyribonucleic
acid (cDNA) diperbanyak pada reaksi amplifikasi menggunakan enzim DNA
polymerase. Deteksi produk dari hasil konvensional RT-PCR dilakukan pada
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
14
akhir reaksi menggunakan teknik elektroforesis atau enzyme linked immuno
assay (ELISA) (WHO 2007: 7).
Uji diagnostik dengan RT-PCR merupakan uji deteksi virus AI yang
cepat dan memiliki sensitivitas serta spesifisitas yang tinggi. Sawabe dkk.
(2006: 328) melakukan deteksi HPAI subtipe H5N1 dari sampel darah burung
di peternakan daerah Kyoto, Jepang, yang telah terinfeksi virus influenza
A/chicken/Kyoto/3/2004. Deteksi dilakukan menggunakan teknik RT-PCR
dengan mengamplifikasi fragmen gen M dan HA. Hasil yang diperoleh ialah
10% dari 30% sampel positif AI merupakan subtipe H5 virus AI.
Lisa dkk. (2006: 2) melakukan deteksi infeksi virus influenza A subtipe
H5N1 dari sampel allantoic fluid, cloacal, tracheal swab, dan homogenized
pooled organ serta jaringan manusia menggunakan metode one-step reverse
transcription (RT)-PCR system [Qiagen]. Metode one-step reverse
transcription (RT)-PCR menggunakan RNA virus AI sebagai cetakan untuk
deteksi genom AI. Primer spesifik H5 yang telah dirancang secara khusus
digunakan untuk reaksi amplifikasi. Hasil yang diperoleh ialah 100% sampel
allantoic fluid, 67% sampel cloacal dan tracheal swab, serta 86% sampel
homogenized pooled organ dan jaringan yang positif terdeteksi H5N1.
Noroozian dkk. (2007: 407) melakukan deteksi virus AI subtipe H9 dari
10 sampel faeces ayam yang telah terinfeksi virus dengan metode two-step
RT-PCR. Metode two-step reverse transcription (RT)-PCR menggunakan
cDNA virus AI sebagai cetakan untuk deteksi genom AI. Amplifikasi
dilakukan menggunakan primer HA. Enzim M-MVLV [Fermentas] digunakan
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
15
untuk reaksi reverse transcription dan enzim Taq DNA polymerase
[Cinnagen] digunakan untuk reaksi amplifikasi. Hasil yang diperoleh ialah 10
sampel faeces ayam menunjukkan hasil positif terdeteksi H5N1.
G. HOT-STAR TAQ DNA POLYMERASE
Hot-Star Taq DNA polymerase merupakan modifikasi dari enzim Taq
DNA polymerase berukuran 94 kDa. Enzim Hot-Star Taq DNA polymerase
tidak aktif pada suhu ruang atau rendah. Inkubasi pada suhu 95o C selama
5--15 menit diperlukan untuk mengaktifkan enzim. Tahap tersebut
bermanfaat mencegah terjadinya misprimed product dan dimer primer pada
suhu rendah (Qiagen 2005: 3).
Hot-Star Taq DNA polymerase sangat sesuai untuk reaksi amplifikasi
melibatkan genom yang kompleks, cDNA sebagai cetakan, memiliki jumlah
DNA cetakan terbatas, atau menggunakan banyak pasangan primer. HotStar Taq DNA polymerase [Qiagen] memiliki kelebihan dibandingkan enzim
polymerase lainnya karena dilengkapi dengan buffer yang berfungsi menjaga
keseimbangan kombinasi kalium klorida (KCl) dan ammonium sulfat
((NH4)2SO4). Hal tersebut dapat mencegah terjadinya perubahan
penempelan primer yang spesifik menjadi tidak spesifik akibat suhu
annealing atau konsentrasi ion Mg2+ tidak sesuai sehingga dapat mereduksi
produk non-spesifik dan dimer primer (Qiagen 2005: 7).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
16
H. PERANCANGAN PRIMER DAN OPTIMASI PCR
Primer merupakan oligonukleotida yang diperlukan untuk mengawali
proses polimerisasi untaian DNA. Primer yang baik adalah primer yang tidak
membentuk hairpin loops atau dimer primer karena dapat menghambat
proses polimerisasi. Beberapa persyaratan dalam perancangan primer
adalah primer terdiri atas 17--28 basa dengan komposisi basa (G+C) sekitar
50--60%. Primer harus diakhiri dengan basa G atau C, atau GC, atau CG
pada ujung 3’. Temperature melting (Tm) primer sekitar 55--80° C. Basabasa pada ujung 3’ primer tidak bersifat komplementer dan tidak bersifat selfcomplementary (membentuk struktur sekunder seperti hairpin) (Rybicki
2001: 10).
Seleksi dan perancangan primer saat ini dapat dilakukan dengan
bantuan program komputer. Program tersebut dirancang untuk menentukan
susunan oligonukleotida, kondisi konsentrasi garam dan suhu annealing
primer. Namun demikian, pada reaksi PCR diperlukan proses optimasi untuk
mendapatkan kondisi reaksi PCR yang optimal (Nuncbrand 2007: 1).
Proses amplifikasi yang optimal bergantung pada beberapa faktor
meliputi suhu dan konsentrasi MgCl2 dalam larutan buffer. Cara yang paling
sering dilakukan untuk optimasi PCR adalah dengan mengubah konsentrasi
MgCl2, suhu annealing, dan konsentrasi primer. Ion Mg2+ memengaruhi
proses penempelan primer pada cetakan DNA. Menurut Stratagene (2007:
2), enzim Taq DNA polymerase sangat sensitif terhadap MgCl2. Konsentrasi
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
17
MgCl2 rendah menyebabkan keakuratan enzim Taq DNA polymerase tinggi,
tetapi kecepatan polimerisasi rendah, sedangkan konsentrasi MgCl2 tinggi
menyebabkan keakuratan enzim Taq DNA polymerase rendah, tetapi
kecepatan polimerisasi tinggi. Menurut Nuncbrand (2007: 2), konsentrasi ion
Mg2+ yang rendah dapat meningkatkan spesifisitas PCR, sedangkan
konsentrasi ion Mg2+ yang tinggi dapat menurunkan spesifisitas PCR.
Masing-masing pasangan primer memerlukan konsentrasi MgCl2 yang
berbeda untuk menempel pada cetakan DNA. Hal tersebut dipengaruhi oleh
kondisi rancangan primer, meliputi ukuran basa primer, persentase
kandungan Guanin (G) dan sitosin (C), serta Tm primer (Kramer & Coen
2001: 15.1.7).
Suhu annealing dan konsentrasi primer memengaruhi spesifisitas
amplifikasi dan ukuran produk PCR yang dihasilkan. Suhu annealing terlalu
rendah dapat menyebabkan primer menempel pada beberapa daerah DNA
cetakan sehingga meningkatkan proses amplifikasi, namun menurunkan
spesifisitas PCR (Rybicki 2001: 1--3). Konsentrasi primer terlalu tinggi dapat
menyebabkan peningkatan mispriming atau penempelan primer bukan pada
daerah target dan menurunkan spesifisitas PCR (Qiagen 1997: 2).
I. UJI SPESIFISITAS PCR
Uji spesifisitas PCR dilakukan untuk mengetahui kemampuan dan
ketepatan primer dalam mengamplifikasi gen target. Spesifisitas PCR dapat
diuji dengan menggunakan beberapa gen virus atau bakteri yang bukan
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
18
merupakan gen target reaksi PCR. Beberapa strain virus influenza
digunakan untuk menguji spesifisitas PCR dengan primer yang telah
dirancang secara khusus untuk mendeteksi subtipe virus influenza tertentu
(Enders dkk. 2005: 1303). Payungporn dkk. (2006: 145) menggunakan
cetakan DNA dari Newcastle disease virus, respiratory syncytial virus A dan
B, infectious bronchitis virus, dan virus influenza subtipe H3N2, H4N6, H7N7,
H9N2, serta H10N9, untuk menguji spesifisitas PCR menggunakan primer M,
H5, dan N1. Lisa dkk. (2006: 2) menggunakan virus influenza A strain H3N8,
H5N3, H7N3, dan H9N2 untuk menguji spesifisitas PCR dengan primer
spesifik H5N1.
J. UJI SENSITIVITAS PCR
Uji sensitivitas PCR dilakukan untuk mengetahui konsentrasi cetakan
DNA paling rendah yang dibutuhkan untuk mendeteksi keberadaan virus.
Sensitivitas PCR dapat diketahui dengan melakukan pengenceran cetakan
DNA hingga konsentrasi tertentu. Konsentrasi cDNA dapat diketahui dengan
menggunakan spektrofotometer. Konsentrasi cDNA ditentukan dari hasil
pengukuran energi cahaya yang diserap oleh larutan cDNA pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Kadar kemurnian suatu nukleopolipeptida
dapat diketahui dengan pengukuran penyerapan energi cahaya pada kisaran
panjang gelombang sinar UV 20--360 nm. Nilai kadar kemurnian DNA yang
baik yaitu 1,8, sedangkan untuk nilai kadar kemurnian RNA yang baik yaitu 2
(Bregman 1990: 41--42).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
19
Pengenceran dapat dilakukan dengan menggunakan phosphatebuffered saline (PBS) (Shumei Zou dkk. 2007: 1890). Pengenceran
menggunakan buffer bertujuan mempertahankan kondisi DNA atau RNA agar
tidak rusak selama penyimpanan. Pengenceran bertahap umumnya
dilakukan sebanyak 8--10 kali (10; 1; 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7;
10-8 ng), bergantung pada konsentrasi awal cetakan DNA dan konsentrasi
paling rendah yang ingin digunakan untuk uji sensitivitas (Pan dkk. 2001:
134).
K. VISUALISASI HASIL PCR DENGAN ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul organik yang
bermuatan berdasarkan kecepatan migrasi dalam suatu medan listrik
(Seidman & Moore 2000: 263). Teknik tersebut banyak digunakan untuk
memisahkan berbagai macam molekul organik seperti DNA, RNA, dan
protein. Elektroforesis juga digunakan untuk menentukan panjang fragmen
DNA berdasarkan jumlah pasangan basa, menentukan berat protein spesifik,
menentukan titik isoelektrik suatu protein, dan menentukan kemurnian protein
yang telah diisolasi (Ritter 1996: 93).
Gel yang umum digunakan dalam elektroforesis adalah agarosa dan
poliakrilamida. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen
DNA berukuran besar dengan kisaran 100--20.000 pb. Gel poliakrilamida
digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berukuran kecil dengan
kisaran 10--500 pb (Sambrook & Russell 2001: 5.7).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
20
Elektroforesis gel agarosa dengan pewarnaan etidium bromida (EtBr)
banyak digunakan untuk visualisasi hasil deteksi virus influenza dengan PCR.
Beladi dkk. (2005: 582) menggunakan 1% gel agarosa untuk visualisasi hasil
nested PCR gen M virus AI dengan ukuran 600 bp. Lisa dkk. (2006: 2)
menggunakan 1,2% gel agarosa untuk visualisasi hasil one-step RT-PCR
gen HA virus AI dengan ukuran 456 bp. Noroozian dkk. (2007: 407)
menggunakan 1,5% gel agarosa untuk visualisasi hasil two-step RT-PCR gen
HA virus AI dengan ukuran 432 bp.
L. BAKTERI-BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT SALURAN PERNAPASAN
1. Haemophilus influenzae (Lehmann & Neuman 1896) Winslow et al.1917
Haemophilus influenzae merupakan bakteri Gram negatif, basilokokus,
dan termasuk dalam family Pasteurellaceae (Gambar 6). Genom
H. influenzae berukuran 1. 830 pb mengkode 1.740 protein, 58 transfer RNA
(tRNA), dan 18 RNA lainnya. Dua kelompok utama strain H. influenzae
adalah unencapsulated dan encapsulated. Haemophilus influenzae
ditemukan pada selaput lendir saluran pernapasan bagian atas manusia dan
merupakan penyebab penyakit meningitis pada anak (Todar 2007: 1).
Haemophilus influenzae masuk melalui saluran pernapasan, kemudian
memasuki aliran darah dan menyebar ke selaput otak atau beberapa tetap
berada di sendi dan mengakibatkan arthritis septik (Brooks dkk. 2006: 397).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
21
2. Neisseria meningitidis Albrecht & Ghon 1901
Neisseria meningitidis adalah bakteri Gram negatif, diplokokus non
motil, berdiameter sekitar 0,8 µm, dan berbentuk ginjal (Gambar 6).
Neisseria meningitidis merupakan anggota family Neisseriaceae. Tiga belas
serogrup N. meningitidis telah diidentifikasi dengan menggunakan spesifikasi
immunologi terhadap polisakarida kapsuler. Serogrup N. meningitidis yang
paling penting berhubungan dengan penyakit pada manusia adalah A, B, C,
Y, dan W-135 (Brooks dkk. 2006: 420).
Hidung dan tenggorokan merupakan pintu masuk bagi N. meningitidis.
Neisseria meningitidis akan menempel pada sel epitel dengan bantuan pili,
membentuk flora transient (berumur pendek), kemudian menuju aliran darah
menimbulkan bakterimia. Meningitis adalah suatu komplikasi paling banyak
ditemui pada meningococcemia. Gejala mendadak yang muncul pada
meningitis adalah sakit kepala yang terus menerus, muntah, dan leher kaku,
serta dapat menyebabkan koma dalam waktu beberapa jam (Todar 2004 : 1).
3. Streptococcus pneumonia (Klein 1884) Chester 1901
Streptococcus pneumoniae adalah bakteri Gram positif, diplokokus,
berbentuk lancet atau rantai, memiliki kapsul polisakarida yang memudahkan
pengelompokan antiserum spesifik (Gambar 6). Streptococcus pneumonia
merupakan anggota family Streptococcaceae. Polisakarida kapsuler secara
imunologi dibedakan menjadi 84 tipe. Polisakarida kapsuler bersifat
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008
22
nontoksik dan noninflammatory. Polisakarida kapsuler S. pneumonia
berfungsi mencegah atau menunda pencernaan oleh fagosit (Brooks dkk.
2006: 341--342).
Streptococcus pneumonia merupakan flora normal dari saluran
pernapasan bagian atas manusia, sekitar 5--40% dan dapat menyebabkan
pneumonia, sinusitis, otitis, bronkitis, bakteremia, meningitis, dan proses
infeksi lainnya. Streptococcus pneumonia mampu berkembang biak di dalam
jaringan dan tidak menghasilkan toksin. Infeksi S. pneumonia menyebabkan
pengeluaran cairan edema fibrin secara berlebihan ke dalam alveoli.
Penyakit pneumonia biasanya mendadak, diikuti dengan demam, menggigil,
dan nyeri tajam pada pleura. Sputum mirip dengan eksudat alveolar, secara
karakteristik berdarah atau berwarna merah kecoklatan (Todar 2008: 2).
Deteksi Fragmen..., Sylvia Sance Marantina, FMIPA UI, 2008