identifikasi genotipe dan karakterisasi genome

0422: Tedjo Sasmono dkk.
KO-199
IDENTIFIKASI GENOTIPE DAN KARAKTERISASI GENOME VIRUS
DENGUE DI INDONESIA UNTUK PENENTUAN PROTOTIPE VIRUS
BAHAN PEMBUATAN VAKSIN DENGUE BERBASIS STRAIN
INDONESIA
Tedjo Sasmono1), Benediktus Yohan1),Tri Yuli Setianingsih1),Aryati2,3), Puspa Wardhani2,3), Fedik. A. Rantam3)
Lembaga Biologi Molekuler Eijkman, Jl. Diponegoro 69, Jakarta 10430
Departemen Patologi Klinik dan 3)Lembaga Penyakit Tropis, Universitas Airlangga, Surabaya
1)
2)
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Demam Berdarah Dengue saat ini masih merupakan penyakit virus terpenting di dunia, termasuk di Indonesia yang
merupakan negara endemis penyakit ini. Penyakit ini disebabkan oleh virus dengue yang terdiri dari 4 serotipe yakni DEN-1,
DEN-2, DEN-3, dan DEN-4. Saat ini belum tersedia obat untuk penyakit ini, demikian juga dengan vaksin, sehingga
penanggulangan penyakit ini umumnya bergantung pada tatalaksana penderita dan pengendalian vektor nyamuk. Seperti
penyakit lain yang disebabkan oleh virus, penyakit dengue bisa dicegah dengan vaksinasi. Saat ini beberapa pihak sedang
mengembangkan vaksin dengue dan uji klinis vaksin ini juga sedang dilaksanakan di Indonesia. Walaupun ada kemungkinan
keberhasilan vaksin dengue yang sedang diuji klinis saat ini, masih ada kemungkinan kegagalan atau ketidaksempurnaan vaksin
tersebut untuk memberikan perlindungan terhadap infeksi dengue, terutama disebabkan karena faktor keragaman genetik virus
dengue. Konsorsium Vaksin Dengue di Indonesia saat ini sedang mencoba mengembangkan vaksin dengue berbasis strain lokal
Indonesia. Salah satu langkah awal pengembangan vaksin dengue adalah penyediaan strain virus prototipe yang akan dijadikan
kandidat vaksin. Untuk itu, perlu dilakukan identifikasi genotipe dan karakterisasi genetik virus dengue di Indonesia, dengan
harapan bisa menyediakan informasi dalam pemilihan strain lokal virus untuk seed vaksin.Dalam penelitian tahun pertama ini,
telah dilakukan pengumpulan sampel isolat virus dengue dari delapan kota di Indonesia. Dari sampel-sampel tersebut, telah
diketahui jenis-jenis serotipe virus dengue di Indonesia, di mana semua serotipe virus dengue beredar di Indonesia. Dari semua
jenis serotipe tersebut, telah dilakukan penelitian mendalam untuk melihat genotipe dari masing-masing serotipe virus. Untuk
virus DEN-1, genotipe yang beredar di Indonesia adalah Genotipe I dan IV, kemudian untuk DEN-2, genotipe yang ada adalah
Genotipe Cosmopolitan. Selanjutnya DEN-3 didominasi oleh Genotipe I, serta DEN-4 didominasi oleh Genotipe II. Karakterisasi
genetik terhadap virus dengue dilakukan lebih mendalam dengan melakukan pengurutan genom lengkap virus sebanyak 25 isolat.
Variasi genetik didapatkan dari hasil analisa genom virus tersebut. Dari hasil penelitian ini, virus dengue yang secara genetik
paling umum ditemukan di Indonesia akan dipilih sebagai prototipe virus yang selanjutnya akan digunakan dalam pengembangan
vaksin dengue strain Indonesia oleh Konsorsium Vaksin Dengue Indonesia.
Kata kunci: Dengue, genetik, genotipe, genom lengkap, vaksin
I. PENDAHULUAN
Penyakit demam dengue (DD) merupakan salah satu
penyakit virus terpenting pada manusia yang ditularkan
melalui gigitan nyamuk dari genus Aedes. Penyakit ini
menyerang hampir 50 juta orang di dunia setiap tahunnya
dan sekitar 500.000 individu dirawat di rumah sakit akibat
demam berdarah dengue [1]. Kebanyakan kasus dengue
adalah asimptomatik ataupun demam ringan yang
kemudian bias sembuh dengan sendirinya. Akan tetapi pada
kasus tertentu, demam dengue bias berkembang menjadi
keadaan yang lebih parah yang bias dikenali sebagai demam
berdarah dengue (DBD) dan sindrom renjatan dengue
(SRD), yang apabila tidak ditangani dengan baik bias
menjadi fatal [2].
Di wilayah Asia Tenggara, Indonesia menempati
peringkat pertama dalam jumlah kasus per tahunnya
(WHO-SEARO 2010). Kasus DBD pertama dilaporkan di
Surabaya dan Jakarta pada tahun 1968, dan sejak saat itu
jumlah kasus DBD meningkat. Kejadian luar biasa terjadi
pada tahun 1988, 1998, dan 2004[3].
Infeksi oleh satu serotipe virus dengue menghasilkan
kekebalan seumur hidup terhadap serotipe tersebut.
Namun, tidak terdapat kekebalan protektif silang antar
0422: Tedjo Sasmono dkk.
KO-200
serotipe sehingga seseorang yang tinggal di area yang
endemik dengue dapat terinfeksi oleh lebih dari satu
serotipe virus dalam hidupnya [1].
Virus dengue yang merupakan anggota familia
Flaviviridae memiliki empat serotipe, yaitu: DEN-1, DEN-2,
DEN-3, dan DEN-4. Genom virus dengue berupa RNA
(Ribonucleic Acid, asam ribonukleat) untai tunggal berukuran
kurang lebih 10,7 kilo basa (kb). Seperti halnya dengan virus
lainnya, virus dengue mempunyai keragaman genetik yang
disebabkan oleh laju mutasi yang tergolong cepat, seperti
tampak pada adanya kelompok-kelompok virus yang
mempunyai kemiripan genetik dalam satu serotipe, yang
lazim disebut sebagai “genotipe”. Masing-masing serotipe
virus dengue mempunyai beberapa genotipe, misalnya
Genotipe I-IV pada DEN-1, Genotipe Cosmopolitan dan
Asian pada DEN-2 dan sebagainya [4].
Terdapat paling tidak dua aspek yang berhubungan
dengan keragaman genetik/genotipe virus dengue. Pertama
adalah bahwa genotipe tertentu mempunyai penyebaran
geografis yang khas dan hanya dtemukan di daerah tertentu
di dunia, misalnya genotipe III dari DEN-1 yang tersebar di
Amerika, India, dan Asia Tenggara, sedangkan genotipe I
DEN-1 hanya terbatas di Asia Tenggara [4]. Aspek kedua
adalah bahwa genotipe virus dengue bisa jadi berhubungan
dengan keganasan penyakit, misalnya genotipe American
dari DEN-2 diketahui menyebabkan derajat keparahan yang
lebih rendah daripada genotipe Asian dari DEN-2 [4].
Penyebaran geografis genotipe virus dengue yang tidak
seragam dan terjadinya perpindahan genetik serta keluar
masuknya genotipe-genotipe tertentu virus dengue di suatu
daerah bisa berimplikasi terhadap pengembangan vaksin
dengue. Vaksin dengue didisain untuk memberikan
imunitas terhadap semua serotipe, namun bisa jadi tidaklah
mampu memberikan imunitas silang yang sempurna [5]. Hal
yang mungkin terjadi adalah bahwa suatu vaksin yang
dibuat dengan menggunakan virus dengue yang berbeda
genotipenya dengan genotipe yang beredar di suatu daerah
tidak memberikan imunitas sempurna. Sebagai contoh
adalah vaksin dengue yang saat ini sedang dikembangkan
oleh pabrikan Sanofi Pasteur, yang menggunakan seed
vaksin dengue DEN-1, -2, -3 dari Thailand dan DEN-4 dari
Indonesia [6], apakah nantinya vaksin tersebut bisa benarbenar protektif terhadap virus-virus yang beredar di
Indonesia? Penelitian awal kami [7] menemukan adanya
perbedaan genotipe virus dengue di Indonesia dengan strain
virus untuk vaksin tersebut. Hal-hal inilah yang membuat
penelitian mengenai aspek genetik virus dengue secara detil
sampai mencakup urutan nukleotida genome lengkap di
Indonesia diperlukan.
Konsorsium Vaksin Dengue Indonesia pada saat ini
berupaya untuk mengembangkan vaksin dengue dengan
menggunakan strain virus lokal dari Indonesia. Penelitian
bersama dimulai dari karakterisasi genetik virus dengue dari
berbagai daerah di Indonesia, pemilihan prototipe virus
yang akan digunakan untuk pembuatan vaksin, pembuatan
vaksin dengan metode a.l. live attenuation, rekombinan virus
dll. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan karakterisasi
genetik virus-virus dengue Indonesia melalui pemetaan
serotipe dan genotipe virus dengue, pengurutan genome
lengkap virus dengue, karakterisasi biologis, serta pemilihan
strain virus yang selanjutnya akan dipakai dalam
pembuatan seed vaksin dengue.
Pada makalah ini, akan dilaporkan hasil penelitian tahun
pertama.
II. METODOLOGI
Pengumpulan isolat virus dilakukan bersama-sama
dengan anggota konsorsium dari delapan kota di Indonesia
yang meliputi Jakarta, Surabaya, Medan, Denpasar,
Makassar, Samarinda, Jayapura, danKendari. Isolasi virus
dilakukan secara langsung dari serum pasien atau setelah
propagasi pada kultur sel C6/36.Ekstraksi RNA virus
dilakukan menggunakan QIAamp Viral RNA Mini Kit
(Qiagen). Deteksi virus dan penentuan serotype virus
dilakukan menggunakan metode Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction (RT-PCR) berdasarkan metode
Lanciotti et al(1992) [8] dan Harris et al (1998) [9].
Penentuan genotipe virus dengue dilakukan dengan
pengurutan (sequencing) gen E (Envelope) di fasilitas DNA
sequencing Lembaga Eijkman. Analisis filogenetik dilakukan
terhadap sekuen gen E menggunakan model Minimum
Evolution dengan model substitusi Tamura-Neidan 500
replikasi boot strap yang terdapat pada program MEGA
versi
5
[10].
KlasifikasiisolatkedalamgenotipedilakukanpadamasingmasingserotipeberdasarkanklasifikasiGoncalvezet al (2002)
[11], Twiddyet al (2003) [12],Lanciottiet al (1994) [13] dan
Lanciottiet al (1997) [14] masing-masing untuk DEN-1, DEN2, DEN-3, dan DEN-4 secara berurutan.
Pengurutan genome lengkap (whole genome sequencing)
dilakukan terhadap virus-virus perwakilan masing-masing
serotipe. Metode yang digunakan adalah sesuai dengan
metode Ong et al (2008) [15] (sekuens primer lengkap dapat
dilihat pada referensi tsb). Hasil pengurutan lengkap
genome virus dengue dilakukan pensejajaran untuk dilihat
homologi dan keragaman dari genom. Secara bersamaan,
dilakukan karakterisasi biologis dari virus-virus terpilih
untuk melihat
karakter pertumbuhannya.
Analisa
pertumbuhan dilakukan dengan menggunakan metode
plaque assay[16] ataupun dengan mengukur jumlah kopi
genome menggunakan metode RT-PCR.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Peta serotipe virus dengue di Indonesia
Dalam penelitian ini, dilakukan pemetaan virus dengue
untuk mengetahui penyebaran keempat serotipe virus. Hal
ini perlu dilakukan untuk mendapatkan gambaran nyata
0422: Tedjo Sasmono dkk.
serotipe apa saja yang ada dan dominan di Indonesia.
Sampel didapatkan dalam kurun waktu 2010 sampai 2012 di
delapan kota di Indonesia. Dari semua sampel dilakukan
deteksi secara molekuler untuk konfirmasi infeksi dan
dilakukan penetuan serotipenya. Tidak semua sampel
berhasil diketahui serotipenya. Demikian juga dengan
genotipenya, tidak semua sampel bisa ditentukan
genotipenya. Hal ini bisa sebabkan a.l. karena kualitas
sampel yang buruk sehingga menyebabkan terjadinya
degradasi RNA virus yang menyebabkan tidak berhasilnya
amplifikasi cetakan DNA untuk penentuan serotipe dan
genotipe. Selain itu, bisa jadi pengambilan sampel dilakukan
setelah masa viremia sehingga virus tidak berada dalam
jumlah yang cukup dalam darah untuk deteksi secara
molekuler. Jumlah sampel deteksi dan serotipe dapat dilihat
di Tabel 1.
Table 1. Jumlah sampel dan penentuan serotipe serta genotipe.
Untuk serotipe virus dengue, selama waktu penelitian,
didapatkan hasil bahwa semua jenis serotipe dengue ada di
Indonesia. Di beberapa kota misalnya Surabaya dan
Jayapura, DEN-1 tampak mendominasi, sedangkan di kota
lain seperti di Medan dan Denpasar, DEN-3 yang lebih
banyak dijumpai (Gambar 1). Data ini memberikan
gambaran terkini penyebaran virus dengue di Indonesia dan
menjadi modal awal untuk memperoleh data selajutnya.
KO-201
Peta genotipe virus dengue
Setelah mengetahui sebaran serotipe virus, dilakukan
penelitian lebih mendalam mengenai genotipe virus dari
masing-masing serotipe. Mengunakan analisis filogenetik
berdasarkan sekuens gen E dan dibandingkan dengan virusvirus referensi dari berbagai negara, didapatkan data
genotipe dengue di Indonesia (Tabel 2, data pohon filogeni
tidak ditampilkan di sini). Seperti yang terlihat pada Tabel 2,
untuk virus serotipe DEN-1, di Indonesia bersirkulasi dua
macam genotipe, yakni Genotipe I dan IV. Genotipe IV
adalah genotipe lama yang sudah beredar di Indonesia sejak
lama [15], sedangkan Genotipe I tampaknya merupakan
genotipe yang ditemukan baru-baru ini. Untuk DEN-2,
virus-virus yang beredar di Indonesia termasuk dalam
Genotipe Cosmopolitan (Tabel2). Genotipe ini cukup merata
penyebarannya di dunia dan di Indonesia pun genotipe ini
mendominasi. Untuk DEN-3, penyebaran virus dengue
didominasi oleh Genotipe I. Kemudian untuk virus DEN-4,
genotipe yang umum ditemukan di Indonesia adalah
Genotipe II (Table II).Berdasarkan hasil ini, secara umum
bisa dikatakan bahwa data genotipe virus dengue di
Indonesia sudah diketahui. Informasi ini bisa menjadi dasar
untuk penentuan strain virus dari genotipe apa yang
dominan saat ini. Dari aspek pemilihan genotipe virus untuk
kandidat seed vaksin, bisa dipilih genotipe-genotipe
dominan. Untuk DEN-1, karena jumlah Genotipe I dan IV
hampir seimbang, bisa dipakai kedua genotipe tersebut,
sedangkan untuk DEN-2, -3, dan -4, bisa dipilih genotipegenotipe seperti terlihat pada Tabel 2.
Table 2. Data genotipe virus dengue di berbagai kota di Indonesia.
Data dari kota dengan tanda bintang adalah data lama dari
publikasi sebelumnya.
Karakteristik genetik virus dengue Indonesia dilihat dari sekuens
genomnya
Gambar 1. Distribusi serotipe dengue di 8 kota di Indonesia tahun
2010-2012. Angka dalam grafik batang menunjukkan jumlah
sampel yang berhasil ditentukan serotipenya.
Untuk melihat lebih dalam karakteristik genetik virus
dengue di Indonesia, dilakukan pengurutan genome
lengkap terhadap beberapa isolat virus dengue yang
mewakili masing-masing serotipe. Rencana awal untuk
kegiatan penelitian ini adalah masing-masing serotipe akan
diurutkan genom lengkapnya sebanyak 10 isolat (total 40
KO-202
genom). Pada kegiatan tahun pertama ini, berhasil dilakukan
pengurutan genome lengkap terhadap 25 isolat virus. Isolatisolat yang sudah berhasil diurutkan genom lengkapnya
adalah seperti terlihat pada Tabel 3. Karena panjangnya
genom dari masing-masing virus, data sekuens genom
tersebut tidak dapat kami tampilkan di sini. Pengurutan
genom akan dilanjutkan pada tahun kedua penelitian.
0422: Tedjo Sasmono dkk.
virus-virus yang dikoleksi (Gambar 2C). Hal ini
menandakan bahwa virus-virus DEN-2 di Indonesia cukup
stabil secara genetis.
Table 3. Isolat virus dengue dari beberapa kota yang sudah berhasil
diurutkan genom lengkapnya.
Sebagai langkah awal untuk melihat keragaman genetik
virus dengue di Indonesia, dilakukan pensejajaran sekuens
asam amino (AA) dari gen-gen tertentu yakni gen Envelope
(E) dan gen Non-structural Protein 1 (NS1). Gen E
merupakan penyandi protein Envelope yang berfungsi
dalam menempelnya virus dengue dan fusi virus kedalamsel
inang [17]. Selain itu, protein ini merupakan protein
struktural yang paling conserved serta target dari antibodi
netralisasi [18]. Adapun protein NS1 merupakan protein
yang berperan dalam replikasi virus [19] dan merupakan
protein target untuk vaksin. Virus-virus yang beredar
sebelumnya, yakni tahun 2004 dan 2005 [15], digunakan
sebagai referensi.
Dari hasil pensejajaran AA protein E, terlihat bahwa
secara umum virus dengue Serotipe 1bisa dibedakan dalam
dua kelompok genotipe, yakni Genotipe I dan IV (Gambar
2A dan B). Virus-virus Genotipe I tampak lebih sedikit
variasi AA-nya (8 variasi per 495 AA di protein E)
dibandingkan dengan virus-virus Genotipe IV (8/495).
Hal ini bisa mengindikasikan bahwa virus Genotipe I
merupakan virus yang belum lama masuk ke Indonesia dan
lebih sedikit mengalami perubahan genetik dibanding
Genotipe IV.Untuk virus-virus DEN-2, pensejajaran AA gen
E menunjukkan relatif sedikitnya perubahan genetik pada
Gambar 3. Pensejajaran asam-amino protein E isolat virus dengue.
Hanya ditampilkan urutan AA yang mengalami perubahan dari
total 495 AA di protein E DEN-1, -2, dan -4 serta 493 AA dari
DEN-3.
Kemudian untuk DEN-3, didapatkan variasi AA protein
E yang cukup banyak (Gambar 3D) yang mengindikasikan
kedinamisan karakteristik genetik virus ini di Indonesia.
Sedangkan untuk DEN-4, hanya ditemui sedikit perubahan
AA di protein E (Gambar 3E) yang menandakan stabilnya
sifat genetik serotipe ini di Indonesia.
Untuk pensejajaran urutan AA pada protein NS1,
terdapat pola yang agak mirip dengan pada protein E. DEN1 juga dikelopmokkan dalam dua genotipe, yakni I dan IV.
Genotipe I lebih sedikit bervariasi AA nya dibanding
Genotipe IV (Gambar 4A dan B). Kemudian untuk DEN-2,
variasi AA juga lebih sedikit (5 AA dalam 352) yang
menandakan stabilnya genetik virus ini (Gambar 4C). Untuk
DEN-3, keragaman genetik mirip dengan yang ada pada
protein E (Gambar 4D). Sedangkan DEN-4 menunjukkan
adanya variasi genetik yang lebih banyak daripada DEN-2
0422: Tedjo Sasmono dkk.
(Gambar 4E) yang mengindikasikan terjadinya dinamisasi
protein NS1.
Hasil yang didapat dalam penelitian ini belumlah final
karena masih akan dilanjutkan pada tahun ke dua. Akan
tetapi dari hasil analisa genetik di atas, bisa diambil
kesimpulan sementara bahwa terdapat variasi genetik pada
tingkatan genotipe untuk DEN-1, sedangkan untuk serotipe
lainnya, hanya ada satu genotipe yang dominan.
KO-203
pada Gambar 5. Terlihat adanya kemiripan laju
pertumbuhan virus antara keduanya. Hasil ini masih perlu
dikonfirmasi dengan menggunakan lebih banyak isolat dan
juga menggunakan sel mamalia sebagai inang pertumbuhan,
yang akan dilakukan pada tahun kedua penelitian.
IV. KESIMPULAN
Dari hasil yang didapat selama tahun pertama penelitian
ini, beberapa kesimpulan dapat diambil. Di Indonesia saat
ini beredar keempat serotipe virus dengue yakni DEN-1, -2, 3, dan -4. Dominasi serotipe bervariasi tergantung dari kota
yang diteliti. Dari serotipe-serotipe yang ada di Indonesia,
didapatkan data bahwa DEN-1 terdiri dari Genotipe I dan
IV, DEN-2 termasuk dalam Genotipe Cosmopolitan, DEN-3
didominasi Genotipe I, dan DEN-4 termasuk Genotipe II.
Terdapat variasi genetik pada masing-masing serotipe
walaupun pada umumnya masih cukup seragam. Genome
lengkap dari 25 isolat virus sudah berhasil diurutkan.
Penelitian lebih lanjut akan dilaksanakan pada tahun kedua.
Informasi genetik yang didapatkan diharapkan bisa
digunakan dalam pemilihan strain virus bahan pembuatan
vaksin dengue Indonesia.
Gambar 5. Kinetik pertumbuhan dua isolat virus yang diukur
selama 72 jam.
Gambar 4. Pensejajaran asam-amino protein NS1 isolat virus
dengue. Hanya ditampilkan urutan AA yang mengalami
perubahan dari total 352 AA di protein NS1.
Setelah diketahui karakteristik genetik virus dengue di
Indonesia, penelitian akan dilanjutkan untuk melihat
karakteristik biologis virus dengan melihat kecepatan
pertumbuhan virus in vitro. Pada tahun pertama ini, sudah
mulai dilakukan perbandingan kecepatan pertumbuhan
virus dengan cara ditumbuhkan pada sel nyamuk C6/36 dan
dipantau kecepatan replikasi dengan melihat jumlah kopi
genom virus yang dihasilkan selama pertumbuhan virus
tersebut. Isolat virus yang mulai dilihat kinetik
pertumbuhannya adalah virus yang mewakili Genotipe I
dan IV dari DEN-1. Hasil awal yang didapatkan bisa dilihat
DAFTAR PUSTAKA
[1]
[2]
[3]
[4]
Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, et al. Dengue: a
continuing global threat. Nat Rev Microbiol. 2010; 8
(12Suppl) : S7-16.
Halstead SB. Dengue.Lancet.2007 Nov 10;370
(9599):1644-52. Review.
Kusriastuti R. Dengue Problems in Indonesia. The 2nd
Tuberculosis and Dengue International Symposium.
Novartis-Eijkman-Hassanudin
Clinical
Research
Institute. Universitas Hassanudin, Makasar. 2009.
Holmes EC, RNA virus genomics: a world of
possibilities. J Clin Invest. 2009, 119:9
KO-204
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
Whitehead, S.S., Blaney, J.E., Durbin, A.P., and Murphy,
B.R. Prospects for a dengue virus vaccine. Nat. Rev.
Microbiol. 2007; 5:518–528.
Guy B, Saville M, Lang J. Development of Sanofi
Pasteur tetravalent dengue vaccine. Hum Vaccin. 2010
Sep 16;6(9).
Sasmono RT, Wahid I, Trimarsanto H, et al. Molecular
Epidemiology of Dengue Viruses from MakassarIndonesia.2012Submitted for publication.
Lanciotti RS, Calisher CH, Gubler DJ, et al. Rapid
detection and typing of dengue viruses from clinical
samples by using reverse transcriptase-polymerase
chain reaction. J Clin Microbiol. 1992;30(3):545-51.
Harris E, Roberts TG, Smith L, et al. Typing of dengue
viruses in clinical specimens and mosquitoes by singletube multiplex reverse transcriptase PCR. J Clin
Microbiol. 1998;36(9):2634-9.
Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics Analysis using
Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and
Maximum Parsimony Methods. Mol Biol Evol.
2011;28(10):2731-9.
Goncalvez AP, Escalante AA, Pujol FH, et al. Diversity
andevolution of the envelope gene of dengue virus type
1. Virology. 2002;303(1):110-9.
Twiddy SS, Farrar JJ, Vinh Chau N, et al. Phylogenetic
relationships and differential selection pressures among
genotypes of dengue-2 virus. Virology. 2002;298(1):6372.
Lanciotti RS, Lewis JG, Gubler DJ, Trent DW. Molecular
evolution and epidemiology of dengue-3 viruses. J Gen
Virol. 1994;75(1):65-75.
Lanciotti RS, Gubler DJ, Trent DW. Molecular evolution
and phylogeny of dengue-4 viruses. J Gen Virol.
1997;78(9):2279-84.
Ong SH, Yip JT, Chen YL, et al. Periodic re-emergence
of endemic strains with strong epidemic potential-a
proposed explanation for the 2004 Indonesian dengue
epidemic. Infect Genet Evol. 2008 Mar;8(2):191-204.
Fink, J., Gu, F., Ling, et al.. Host gene expression
profiling of dengue virus infection in cell lines and
patients. PLoS Negl Trop Dis 2007 (1) e86.
Chen Y, Maguire T, Marks RM.Demonstration of
binding of dengue virus envelope protein to target
cells.J Virol. 1996 Dec;70(12):8765-72.
Mandl CW, Guirakhoo F, Holzmann H, Heinz FX, Kunz
C.Antigenic structure of the flavivirus envelope protein
E at the molecular level, using tick-borne encephalitis
virus as a model.J Virol. 1989 Feb;63(2):564-71.
Mackenzie
JM,
Jones
MK,
Young
PR.
Immunolocalization of the dengue virus nonstructural
glycoprotein NS1 suggests a role in viral RNA
replication.Virology. 1996 Jun 1;220(1):232-40.
0422: Tedjo Sasmono dkk.