bahan dan metode

BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari hingga Juli 2011 di
Laboratorium Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi
FMIPA IPB.
Koleksi Sampel
Sampel yang digunakan adalah sampel darah sapi madura berasal dari
koleksi Laboratorium Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen
Biologi FMIPA IPB dan sampel darah sapi aceh berasal dari Balai Pembibitan
Ternak Unggul (BPTU) Indrapuri Aceh besar. Jumlah keseluruhan sampel yang
digunakan 83 sampel (Tabel 1).
Tabel 1 Sampel sapi yang digunakan pada penelitian
No.
Bangsa Sapi
1
Sapi aceh
2
Sapi madura
Lokasi
BPTU Indrapuri,
Kab. Aceh Besar
Kab. Sampang &
Kab. Bangkalan
Kode
Sampel
Kml_BosA
Jenis
Kelamin
♀
Jumlah
Sampel
23
Tahun
Koleksi
2010
AF
♀
43
2009
♂
17
2009
Keterangan ; Kab = Kabupaten, Kml = Kamaliah (Kolektor), AF = Achmad Farajallah (Kolektor),
Bos = Genus sapi, A=Aceh.
Ekstraksi Sampel
Ekstraksi yang digunakan untuk amplifikasi gen leptin menggunakan
Kapa Express Extract (Kapabiosystems).
Ekstraksi yang digunakan untuk
amplifikasi gen miostatin menggunakan Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood
(Geneaid). Sebelum dilakukan tahap ekstraksi, sampel darah di dalam alkohol
absolut dicuci dengan air destilata steril dan diendapkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Pencucian sampel darah dilakukan sebanyak
dua kali. Sampel darah diambil sebanyak 10 μl untuk proses ekstraksi
menggunakan Kapa Express Extract dan 200 μl untuk proses ekstraksi Genomic
DNA Mini Kit for Fresh Blood (Geneaid).
Tahapan ekstraksi Kapa Express Extract terdiri atas proses lisis dan
inaktivasi enzim protease. Endapan sel darah sebanyak 10 μl dilarutkan dalam 10x
buffer Kapa Express Extract dan 1 unit enzim protease Kapa Express Extract.
Larutan dilisis pada suhu 75 0C selama 10 menit. Selanjutnya, enzim protease
dilakukan inaktivasi pada suhu 95 0C selama 5 menit. Reaksi diendapkan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 1 menit. Supernatan merupakan
larutan yang diambil untuk tahap amplifikasi.
Ekstraksi Genomic DNA Mini Kit for Fresh Blood (Geneaid) yang
digunakan dimodifikasi pada tahap pencucian sampel darah dari alkohol dan tahap
resuspensi yang menggunakan air destilata steril. Endapan sel darah sebanyak 200
μl dilisis menggunakan larutan GB buffer sebanyak 200 μl, kemudian diinkubasi
pada suhu 35 0C selama 10 menit. Selanjutnya DNA diikat pada matriks di dalam
tabung. Tahap pengikatan DNA pada matriks bertujuan untuk memisahkan DNA
dari makromolekul sel lainnya. DNA terikat pada matriks, sedangkan
makromolekul sel lainnya mengendap pada bagian dasar tabung. DNA pada
matriks dicuci menggunakan larutan 400 μl W1 buffer dan 600 μl Wash buffer.
Selanjutnya DNA diencerkan menggunakan larutan Elution buffer sebanyak 100
μl.
Amplifikasi Gen Leptin
Gen leptin yang diamplifikasi yaitu ekson 2 hingga ekson 3 menggunakan
mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) ESCO Swift Maxi Thermal Cycler.
Pasangan primer yang digunakan mengapit daerah ekson 2, yaitu primer forward
L5 (5’-CCATGGCAGACAGCAAATCTCGT-3’) dan primer reverse L6 (5’TGGTGTCATCCTGGACCTTCC-3’) (Buchanan et al. 2002). Panjang daerah
ekson 2 yang diapit oleh sepasang primer tersebut 234 pb. Volume total reaksi
amplifikasi sebanyak 25 μl terdiri atas 12,5 μl 1 unit KAPA2G Robust Hotstart
ReadyMix (MgCl2 2mM dan masing-masing dNTP 0,2 mM), masing-masing
primer 0,5 μM 1,25 μl, dan genom DNA 10 ng. Kondisi PCR yang digunakan
untuk amplifikasi daerah ekson 2 terdiri atas tahap pradenaturasi pada suhu 950C
selama 3 menit. Tahap selanjutnya 30 siklus dengan kondisi denaturasi pada suhu
950C selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 55 0C selama 15 detik, dan
elongasi pada suhu 720C selama 15 detik. Elongasi akhir pada suhu 72 0C selama
10 menit.
Amplifikasi daerah ekson 3 menggunakan pasangan primer forward L1
(5’-GTCTGGAGGCAAAGGGCAGAGT-3’)dan
primer
reverse
L2
(
5’-
CCACCACCTCTGTGGAGTAG-3’) (Lien et al. 1997). Panjang daerah ekson 3
yang diapit oleh sepasang primer tersebut 522 pb. Reaksi dan kondisi amplifikasi
gen leptin daerah ekson 3 sama dengan reaksi dan kondisi amplifikasi pada daerah
ekson 2, tetapi amplifikasi daerah ekson 3 menggunakan suhu penempelan primer
pada 640C selama 15 detik.
Amplifikasi Gen Miostatin
Gen miostatin pada ruas promotor diamplifikasi menggunakan mesin PCR
(Polymerase Chain Reaction) ESCO Swift Maxi Thermal Cycler. Pasangan primer
yang digunakan untuk amplifikasi gen miostatin ruas promotor adalah primer
forward AF56 (5’-TTCAGGCTACTGAGTTGCATTTT-3’)dan
reverse AF74
(5’-GCTTTCCAGCGGTAAAAGAA-3’). Urutan basa primer yang digunakan
disusun menggunakan program Primer3 berdasarkan species Bos taurus (No.
akses AF348479.1) dari data GenBank. Sepasang primer tersebut mengapit daerah
sekuen target sepanjang 580 pb. Volume reaksi total amplifikasi sebanyak 12 μl
terdiri atas 1 unit KapaTaq DNA Polymerase ReadyMix (MgCl2 2mM dan dNTP
0,4 mM), masing-masing primer 0,4 μM, dan genom DNA 10-100 ng. Kondisi
amplifikasi yang digunakan terdiri atas tahap pradenaturasi pada suhu 950C
selama 3 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus dengan kondisi denaturasi 950C
selama 15 detik, penempelan primer pada suhu 580C selama 15 detik,
pemanjangan primer pada suhu 720C selama 15 detik, dan pemanjangan primer
akhir pada suhu 720C selama 10 menit.
Visualisasi Produk Amplifikasi
Produk amplifikasi gen leptin daerah ekson 2, gen leptin daerah ekson 3,
dan gen miostatin pada ruas promotor dimigrasikan menggunakan teknik
Elektroforesis Gel Poliakrilamid (PAGE 6%) dengan konsentrasi bufer 1Χ TBE
(Tris-HCl 0,5; Asam Borat 0,65; EDTA 0,02 M). Visualisasi DNA menggunakan
pewarnaan perak berdasarkan Byun et al. (2009). Penentuan ukuran pita DNA
dilakukan menggunakan rumus Fungsi Regresi Linier.
Pengurutan Nukleotida
Pengurutan
nukleotida
menggunakan
jasa
pelayanan
perusahaan
sekuensing. Primer yang digunakan untuk pengurutan nukleotida pada gen leptin
daerah ekson 2 sama dengan primer yang digunakan pada tahap amplifikasi (L5
dan L6). Sedangkan primer yang digunakan untuk gen miostatin pada ruas
promotor adalah primer forward (AF56). Gen leptin daerah ekson 3 tidak dapat
dilanjutkan ke tahap sekuensing karena produk amplifikasi gen leptin daerah
ekson 3 memberikan pita DNA lainnya yang bukan merupakan pita target.
Analisis Data
Data dalam bentuk urutan basa nukleotida diedit menggunakan program
BioEdit versi 7.0.9.0 dan Genetyx-Win versi 4.0. Data tersebut disejajarkan
menggunakan program Geneious versi 5.4.4. Kemudian data diedit kembali dan
dianalisis menggunakan program Mega 5.05.
Urutan nukleotida disejajarkan dengan data dari data GenBank. Gen Leptin
disejajarkan dengan Bos indicus haplotipe ATGCT (No. akses FJ626856.1), Bos
indicus haplotipe GCATC (No. akses FJ626855.1), Bos taurus (No. akses
AJ512638.1), Bos frontalis (No. akses EU642566.1), dan Bos taurus Χ Bos
indicus (No. akses EU921637.1). Gen Miostatin disejajarkan dengan Bos taurus
(No. akses AF348479.1).
Persentase komposisi nukleotida pada gen Leptin dan gen Miostatin
menggunakan aplikasi yang telah tersedia pada program Mega 5.05. Urutan
nukleotida yang telah diedit disejajarkan menggunakan pensejajaran Crustal W.
Pada gen Leptin perubahan nukleotida menjadi asam amino menggunakan
program Genetyx-Win versi 4.0.
Rekonstruksi pohon filogeni pada gen Leptin dilakukan menggunakan
metode Neighbour-Joining (NJ) berdasarkan urutan nukleotida dan asam amino.
Filogeni berdasarkan nukleotida menggunakan model Kimura-2-parameter
dengan nilai bootstrap 1000x pengulangan. Filogeni berdasarkan urutan asam
amino menggunakan nilai bootstrap 1000x pengulangan.
Rekonstruksi pohon filogeni pada gen Miostatin dilakukan berdasarkan
urutan nukleotida menggunakan metode Neighbour-Joining (NJ), model Kimura2-parameter, dan nilai bootstrap 1000x pengulangan.