tinjauan pustaka

5
TINJAUAN PUSTAKA
Semen Kambing
Kambing Peranakan Etawah (PE) merupakan persilangan antara kambing
Etawah yang berasal dari India yang disebut kambing Jamnapari dengan kambing
lokal (kacang) yang asli Indonesia. Ciri khas kambing PE adalah telinganya panjang
terkulai ke bawah, lembek, menggantung dan ujungnya agak melipat. Bentuk dahi
dan hidungnya cembung, dan dagu berjanggut, dibawah leher terdapat gelambir,
tanduk pendek berdiri agak kebelakang dengan ujung sedikit melingkar. Kambing PE
memiliki badan yang besar, tinggi tubuh sekitar 85 cm dengan bobot badan sekitar
60 kg, bulu tumbuh panjang dibagian leher, pundak, punggung dan paha, bulu paha
panjang dan tebal. Warna bulu umumnya belang hitam, belang coklat, coklat bertotol
putih, putih totol coklat atau putih totol hitam (Pamungkas et al. 2009).
Semen merupakan suspensi cairan seluler yang terdiri atas spermatozoa
sebagai gamet jantan dan sekreta yang berasal dari kelenjar-kelenjar kelamin
pelengkap pada saluran reproduksi hewan jantan. Cairan yang terkandung dalam
plasma semen yang dihasilkan pada saat ejakulat disebut plasma semen
(Ogbuewu et al. 2010).
Plasma Semen
Semen Kambing terdiri atas dua bagian yaitu plasma semen dan spermatozoa.
Plasma semen merupakan cairan yang disekresikan terutama oleh kelenjar
vesikularis dan kelenjar aksesoris lainya. Plasma semen berfungsi sebagai medium
perjalanan spermatozoa dari lingkungan saluran reproduksi jantan ke traktus
reproduksi betina selama ejakulasi, sebagai medium aktivasi bagi spermatozoa non
motil dan menyediakan penyangga serta kaya akan makanan yang penting untuk
hidup spermatozoa setelah deposisi ke traktus reproduksi betina. Plasma semen
berwarna kuning yang disebabkan oleh sekresi riboflavin dari kelenjar vesikularis.
Plasma semen yang komponen terbesarnya adalah air (75%), merupakan cairan
netral dengan tekanan isotonik serta berisi substansi organik dan inorganik sebagai
cadangan makanan dan perlindungan bagi spermatozoa. Cairan isotonik plasma
semen terutama dipertahankan oleh substansi organik seperti fruktosa, sorbitol,
inositol, asam sitrat, gliserilfosforikolin, fosfolipid, prostaglandin, dan protein.
Fruktosa merupakan sumber energi terbesar untuk spermatozoa dalam semen
(Morrell 2010). Bearden et al. (2004) menyatakan bahwa komponen plasma semen
terdiri dari glycosaminoglycan (GAG), yang merupakan suatu protein, natrium, dan
klorin sebagai bahan anorganik, penyangga dan sebagai sumber energi bagi
spermatozoa baik yang digunakan secara langsung seperti fruktosa dan sorbitol,
maupun secara tidak langsung digunakan yaitu glyceryl phosphoryln choline (GPC).
Sedangkan menurut Garner dan Hafez (2000) di dalam plasma semen terdapat asam
sitrat dalam konsentrasi tinggi, ergotionin, fruktosa, GPC dan sorbitol yang berfungsi
sebagai energi cadangan apabila substrat yang lain telah habis. Selain itu terdapat
pula asam amino, asam askorbat, protein, lipid, asam lemak dan beberapa enzim.
Komponen kimiawi yang terdapat di dalam plasma semen memiliki beberapa
peranan penting, antara lain: 1) protein sangat diperlukan untuk stabilitas dan
6
permeabilitas membran plasma spermatozoa, 2) Vitamin berperan melindungi
membran plasma spermatozoa dari kerusakan selama proses pembekuan semen,
dengan jalan mengikat radikal oksigen sehingga mencegah terbentuknya peroksida
lipid yang dapat menghambat glikolisis maupun motilitas, 3) kalium, natrium dan
klorida sangat diperlukan untuk menjaga integritas fungsional membran plasma
spermatozoa dan berperan pula untuk mempertahankan di dalam dan di luar sel
spermatozoa, 4) kalsium berperan dalam menginduksi motilitas dan hiperaktivitas
spermatozoa, 5) bikarbonat berperan sebagai agen penyangga untuk mencegah
penurunan pH semen selama proses penyimpanan, 6) fruktosa dimanfaatkan oleh
spermatozoa sebagai sumber energi, baik dalam kondisi anaerob (penyimpanan) dan
aerob (saluran reproduksi betina) (Purdy 2006a).
Spermatozoa
Spermatozoa merupakan gamet jantan yang diproduksi oleh tubuli seminiferi
testis. Struktur spermatozoa terdiri atas tiga bagian yaitu kepala, bagian tengah, dan
ekor, dimana kepala berbentuk oval memanjang, lebar dan pipih sebagai pembawa
materi genetik (DNA) yang berperan dalam menerjemahkan informasi genetik yang
dibawa oleh spermatozoa dan ekor sebagai alat penggeraknya (Garner dan Hafez
2000).
Spermatozoa sebagai hasil akhir proses spermatogenesis merupakan sel yang
berbentuk memanjang dengan bagian kepala sedikit pipih dan ekor yang panjang
(Garner dan Hafez 2000) (Gambar 2). Untuk proses fertilisasi, spermatozoa harus
mempunyai cukup energi untuk pergerakan, protein dan senyawa lain yang penting
selama dalam saluran kelamin betina, dan plasma membran yang baik sehingga dapat
melakukan fertilisasi tepat waktu (Purdy et al. 2010).
Ukuran kepala spermatozoa pada kambing bervariasi antar jenis, namun secara
normal panjang 8 sampai 10 µm, lebar 4 µm dan tebal 1 µm (Evan dan Maxwell
1987). Sedangkan pada kambing Osmanabadi (India) dilaporkan panjang dan lebar
kepala spermatozoa 8.96 µ dan 4.45 µ, panjang dan lebar bagian tengah ekor
spermatozoa masing-masing 12.70 µ dan 0.75 µ dan panjang ekor spermatozoa
36.37 µ. Ekor spermatozoa merupakan bagian yang terakhir dan terpanjang dari
spermatozoa, yang terbagi atas leher, bagian tengah, bagian utama dan bagian ujung.
Bagian leher spermatozoa kurang jelas bentuknya dan pada bagian ini pula akan
terlihat bagaimana kepala spermatozoa mudah terlepas dari bagian badan dan ekor.
Bagian tengah merupakan bagian yang paling lebar dari ekor spermatozoa dan
dikelilingi oleh selubung mitokondria. Bagian utama merupakan bagian terpanjang
dari ekor spermatozoa dan mengandung banyak mesin penggerak (propelling
machinery) serta mempunyai selubung yang berserat. Bagian ujung ekor relatif
pendek dan tidak mempunyai selubung (Evans dan Maxwell 1987).
Kepala spermatozoa secara umum berbentuk oval, sedikit pipih dan terdapat
nukleus yang mengandung kromosom (deoxyribonucleic acid = DNA) (Morel 1999).
Pada bagian ujung depan kepala ditutupi oleh akrosom, yaitu sebuah kantung tipis
dengan membran-ganda yang mengandung acrosin, hyaluronidase dan enzim
hidrolitik lain yang berperan pada penembusan corona radiata dan zona pellucida
pada proses fertilisasi (Bearden et al. 2004). Sedangkan bagian equatorial berperan
sebagai tempat yang mengawali proses penempelan dan penggabungan membran
spermatozoa dengan membran oosit selama proses fertilisasi (Morel 1999).
7
Ekor spermatozoa terdiri atas bagian leher (neck), tengah (midle), principal dan
ujung (end) (Garner dan Hafez 2000). Bagian leher menghubungkan kepala dengan
ekor. Ekor spermatozoa mengandung serabut-serabut fibril (axial filament) yang
tersusun secara radial. Axial filament ini tersusun mulai dari sentriol atas dan berjalan
sampai dengan ujung ekor. Susunannya dari luar ke tengah adalah 9 filamen besar,
9 pasang filamen kecil dan 2 filamen kecil di pusat (Bearden et al. 2004). Serabutserabut ini bertanggung jawab terhadap pergerakan spermatozoa. Pada middle piece
serabut-serabut tersebut diselubungi oleh mitokondria yang tersusun secara heliks
mengelilingi sumbu memanjang. Mitokondria merupakan tempat metabolisme yang
menghasilkan energi. Pada principal piece, serabut-serabut yang ada hanya 2 filamen
pusat dikelilingi 9 pasang filamen kecil. Sedangkan pada end piece hanya
mengandung 2 filamen pusat yang diselubungi membran.
Gambar 2 Spermatozoa dengan bagian-bagiannya (Toelihere 1985)
Metabolisme Spermatozoa
Mitokondria yang mengelilingi bagian midpiece spermatozoa berperan di
dalam metabolisme yang menghasilkan energi untuk pergerakan, dengan bantuan
8
berbagai enzim yang terdapat di dalamnya. Secara umum, sel spermatozoa akan
mengubah substrat menjadi energi melalui dua jalur, yaitu jalur glikolisis dan jalur
siklus Krebs. Pada kondisi anaerob, spermatozoa akan mengubah glukosa, fruktosa
dan manosa menjadi energi dan asam laktat melalui jalur Embden-Meyerhof
(glikolisis) yang terjadi di dalam sitosol (Toelihere 1985). Kondisi ini penting bagi
spermatozoa untuk bertahan hidup selama penyimpanan untuk keperluan inseminasi
buatan karena metabolisme anerobik berjalan lambat. Sedangkan pada kondisi aerob,
spermatozoa akan mengubah laktat atau piruvat hasil perombakan fruktosa untuk
menghasilkan karbon dioksida dan air melalui jalur siklus Krebs (siklus asam sitrat)
yang terjadi di dalam mitokondria (Morel 1999). Pada kondisi tanpa substrat
eksogen, spermatozoa akan menggunakan plasmalogen (glikolipid) membran sebagai
sumber energi jangka pendek (Garner dan Hafez 2000).
Menurut Garner dan Hafez (2000), energi untuk motilitas spermatozoa berasal
dari perombakan adenosin trifosfat (ATP) di dalam membran mitokondria melalui
reaksi-reaksi penguraiannya menjadi adenosin difosfat (ADP) dan adenosin
monofosfat (AMP). Pengubahan ATP menjadi ADP menghasilkan energi sebanyak
7000 kalori/mol (Bearden et al. 2004), dengan reaksi sebagai berikut:
ATP + H2O
ADP + H3PO4 + energi (7000 kalori/mol)
fosfatase
ADP + H2O
AMP + H3PO4 + energi (7000 kalori/mol)
Dalam keadaan normal energi yang dilepaskan dapat dipakai sebagai energi
mekanik atau energi kimia, jika tidak digunakan akan menghilang sebagai panas.
Apabila pemberian energi berupa senyawa phosphor (P–P) di dalam ATP dan ADP
habis, maka kontraksi fibril-fibril spermatozoa akan terhenti dan sperma tidak
bergerak. Supaya spermatozoa dapat bergerak kembali maka ATP dan ADP harus
dibangun lagi. Reaksi tersebut dapat berlangsung bolak-balik sehingga pergerakan
spermatozoa dapat berlangsung. Untuk Membangun kembali ATP dari ADP atau
ADP dari AMP dengan penambahan gugus phosphoryl diperlukan sumber energi
dari luar. Sebagian besar aktifitas sumber energi fisiologi tersebut didapat dari
karbohidrat dan lemak (Garner dan Hafez 2000).
Metabolisme karbohidrat sederhana (glukosa dan fruktosa) pada keadaan
anaerob menghasilkan 2 ATP atau setara dengan 14000 kalori. Reaksi ini
memperlihatkan kemampuan spermatozoa untuk menjaga daya tahannya pada waktu
penyimpanan. Selain menghasilkan ATP, hasil akhir metabolisme karbohidrat
tersebut juga dihasilkan asam laktat. Asam laktat ini dapat menyebabkan penurunan
pH semen yang nantinya akan berpengaruh terhadap motilitas dan viabilitas
spermatozoa. Pada keadaan aerob (ada oksigen) jalur reaksi metabolisme glukosa
dan fruktosa menjadi 19 kali lebih tinggi dalam menghasilkan energi yaitu 38 ATP
atau sama dengan 266000 kalori dan hasil sampingan berupa karbon dioksida serta
air. Selain karbohidrat sebagai sumber energi bagi spermatozoa di dalam plasma
semen juga terdapat glyceryl phosphoryl choline (GPC) yang dapat dimetabolisir
melalui jalur yang sama seperti pada fruktosa maupun glukosa (Bearden et al. 2004).
9
Faktor-Faktor Penyebab Kerusakan Sel Spermatozoa Selama Proses
Kriopreservasi
Fenomena utama selama proses kriopreservasi yang dapat menurunkan
viabilitas sel spermatozoa, yaitu kejutan dingin (cold shock) dan perubahan
intraseluler akibat pengeluran air yang berkaitan dengan pembentukan kristal es.
Selain itu ada faktor tambahan, yakni peroksidasi lipid dan faktor antibeku pada
plasma semen seperti egg-yolk coagulating enzyme, triglyserol lipase dan faktor anti
motilitas. Kerusakan umum pada sel spermatozoa selama proses kriopreservasi
akibat adanya fenomena tersebut adalah kerusakan mekanik yang ditandai dengan
kerusakan organel sitoplasma atau pecah karena ekspansi es, konsentrasi larutan
menjadi toksik dan tebal akibat adanya dehidrasi dari suspensi media baik intra
maupun ekstraseluler dan perubahan fisik serta kimiawi diantaranya presipitasi,
denaturasi, koagulasi dari protein, disosiasi ion dan kehilangan sifat-sifat absorpsi
atau sifat-sifat pengikat air (Paulenz et al. 2005). Dijelaskan lebih lanjut bahwa
khusus pada semen kambing, keberadaan faktor koagulan pada plasma semen seperti
egg-yolk coagulating enzyme dan triglycerol lipase sangat sensitif terhadap proses
kriopreservasi sehingga akan menurunkan viabilitas setelah thawing.
Cold Shock (kejutan dingin). Kejutan mencakup kerusakan pada membran
seluler dan perubahan dalam fungsi metabolik, yang kemungkinan disebabkan oleh
perubahan dalam susunan struktur membran (Medeiros et al. 2002a). Kejutan dingin
terjadi karena adanya penurunan temperatur secara mendadak dari temperatur tubuh
ke temperatur rendah (di bawah 0οC) sehingga akan menurunkan viabiltas sel.
Fenomena kejutan dingin berkaitan dengan fase transisi dari membran lipid yang
menyebabkan terjadinya fase pemisahan dan penurunan sifat-sifat permeabilitas
secara selektif dari membran biologik sel hidup (Watson 2000). Dijelaskan lebih
lanjut bahwa tingkat sensitivitas sel terhadap kejutan dingin dipengaruhi oleh tingkat
pendinginan dan interval suhu.
Efek kejutan dingin pada spermatozoa adalah penurunan aktivitas flagella,
kerusakan organel intraseluler dan kerusakan membran sel (Drobnis et al. 1993). Ada
dua tipe kerusakan pada sel akibat kejutan dingin dapat terjadi secara langsung dan
tidak langsung yang bersifat laten (Gazali dan Tambing 2002). Dijelaskan lebih
lanjut bahwa kerusakan langsung akan memengaruhi struktur dan fungsi seluler,
misalnya penurunan proses metabolisme spermatozoa, sedangkan kerusakan tidak
langsung sulit untuk diamati dan baru terlihat setelah proses pencairan kembali.
Pengaruh utama dari kejutan dingin terhadap sel spermatozoa ialah penurunan
motilitas dan daya hidup, perubahan permeabilitas dan perubahan komponen lipid
pada membran. Jumlah spermatozoa motil mengalami penurunan disertai pelepasan
enzim, perpindahan ion melewati membran dan penurunan kandungan lipid seperti
fosfolipid dan kolestrol yang sangat berperan dalam mempertahankan integritas
membran plasma, serta penurunan kemampuan sel spermatozoa untuk mengkontrol
aliran Ca2+ (Ogbuewu et al. 2010).
Pembentukan Kristal-kristal Es. Pembentukan kristal-kristal es selama
proses kriopreservasi menyebabkan terjadi penumpukan elektrolit di dalam sel, yang
mengakibatkan terjadinya kerusakan sel secara mekanik, dimana elektrolit yang
menumpuk akan merusak dinding sel sehingga pada waktu thawing permeabilitas
membran plasma akan berubah dan sel akan mati. Pembentukan kristal-kristal es
10
kemungkinan berkaitan dengan perubahan tekanan osmotik dalam fraksi yang tidak
mengalami pembekuan (Watson 2000).
Perubahan fisik di dalam sel selama kriopreservasi ada kaitannya dengan
cooling rate atau derajat penurunan suhu. Prinsip utama cooling rate adalah
kecepatan optimal yang dapat memberi kesempatan air keluar dari sel secara
kontinyu bertahap sebagai respon sel terhadap kenaikan konsentrasi larutan
ekstraseluler yang semakin tinggi diantara kristal-kristal es yang terbentuk. Jika
cooling rate berlangsung lambat, air akan banyak keluar dari sel untuk mencapai
keseimbangan potensial kimiawi air intra dan ekstraseluler serta terjadi dehidrasi
untuk menghindari pembekuan intraseluler. Apabila medium pengencer didinginkan
dibawah titik beku, maka kristal-kristal es bernukleasi dan air akan berkristalisasi
sebagai es (Watson 2000). Jika cooling rate cepat, keseimbangan potensial air akan
terganggu dan sel intraseluler membeku dan cooling rate yang sangat cepat akan
menyebabkan pembentukan kristal es intraseluler dimana mempunyai energi
permukaan yang besar dan tidak stabil serta cenderung membentuk kristal-kristal es
yang besar, akibatnya akan bersifat letal terhadap sel (Gazali dan Tambing 2002).
Efek yang ditimbulkan pada sel spermatozoa akibat pembentukan kristal-kristal
es adalah penurunan motilitas dan viabilitas spermatozoa, peningkatan pengeluaran
enzim-enzim intraseluler ke luar sel, dan kerusakan pada organel-organel sel, seperti
lisosom dan mitokondria (Gazali dan Tambing 2002). Dijelaskan lebih lanjut bahwa
jika lisosom pecah akan mengeluarkan asam hidrolase sehingga akan mencerna
bagian sel yang lain, sedangkan mitokondria rusak menyebabkan putusnya rantai
oksidasi. Organel mitokondria mempunyai peranan sebagai sumber energi yang akan
menggertak mikrotubul sehingga terjadi pergesekan diantara mikrotubul dan
akibatnya spermatozoa dapat bergerak secara bebas (motil progresif).
Radikal Bebas dan Peroksidasi Lipid. Radikal bebas yang merupakan
senyawa oksigen reaktif atau Reactive oxygen Species (ROS) adalah molekul atau
oksidan yang sangat reaktif walaupun derajat kekuatannya berbeda-beda karena
memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan dalam orbital luarnya,
sehingga dapat bereaksi dengan molekul sel dengan cara mengikat elekron dari
molekul sel tersebut, yang mengakibatkan reaksi berantai yang dapat menghasilkan
radikal bebas baru, seperti superoksida dismutase (SOD) dan nitric oxide (NO).
Dengan demikian radikal bebas dapat mengganggu integritas sel dan dapat bereaksi
dengan komponen-komponen sel, baik komponen struktural/ molekul-molekul
penyusun membran maupun komponen fungsional/ enzim-enzim dan DNA. Radikal
bebas dapat menyebabkan reaksi berlanjut sampai radikal bebas itu dihilangkan oleh
reaksi dengan radikal bebas lain atau sistem anti oksidan (Zhu et al. 2010).
Tingginya komposisi spermatozoa dengan asam lemak tidak jenuh memiliki
konsekuensi yang tidak menguntungkan karena menjadi rentan terhadap peroksidasi
lipid. Peroksidasi lipid yang meluas menimbulkan perusakan oksidatif terhadap asam
lemak tidak jenuh ganda atau lipid yang memiliki lebih dari dua ikatan kovalen
karbon-karbon (Gogol et al. 2009). Dijelaskan lebih lanjut bahwa kerusakan yang
terjadi tergantung pada terdapatnya oksigen. Prinsip dasarnya bahwa oksigen adalah
esensial, namun kelebihan oksigen menyebabkan kerusakan peroksidasi.
Peroksidasi lipid yang meluas, merusak matrik struktur lipid, yang
menyebabkan instabilitas membran karena terputusnya rantai asam lemak menjadi
senyawa yang bersifat toksik terhadap sel, seperti: aldehida (malonaldehide/MDA),
9-hidroksinonenal (HNE), bebagai hidrokarbon (etana/C2H6 atau pentana/C5H12)
11
yang kesemuanya mengakibatkan kerusakan membran sel yang parah dan
membahayakan (Ogbuewu et al. 2010). Efek peroksidasi pada spermatozoa beberapa
mamalia berupa hilangnya motilitas secara permanen, penghambatan fruktolisis dan
respirasi, pengikatan enzim intraseluler dan kerusakan struktur membran plasma,
terutama pada bagian akrosom sehingga juga menurunkan fertilitasnya (Anghel et al.
2009).
Faktor Antibeku pada Plasma Semen. Faktor antibeku yang terdapat dalam
plasma semen mamalia ialah egg-yolk coagulating enzyme. Egg-yolk coagulating
enzyme (EYCE) merupakan salah satu enzim antibeku yang terdapat pada plasma
semen kambing. EYCE diduga ialah enzim fosfolipase A yang disekresikan oleh
kelenjar bulbouretralis (kelenjar cowper). Bila bereaksi dengan kuning telur yang
terdapat dalam media pengencer akan mengakibatkan kematian spermatozoa. Enzim
fosfolipase A menguraikan lesitin dari kuning telur menjadi lisolesitin dan asam
lemak tak jenuh yang bersifat toksik (Paulenz et al. 2005). Menurut Ari dan Daskin
(2010), pembentukan lisolesitin terjadi karena fosfolipase A memutus gugus R2 dari
lesitin yang digantikan oleh asam oleat suatu asam lemak tak jenuh. Toksisitas dari
EYCE bergantung pada pH, suhu, konsentrasi plasma semen, musim produksi
semen, dan kandungan kuning telur. Terdapat hubungan linear antara aktivitas
penggumpalan dengan konsentrasi EYCE dalam jumlah terbatas pada plasma semen
ataupun pada kelenjar bulbouretralis (Leboeuf et al. 2000).
Komponen Pengencer dan Pengenceran Semen Kambing
Untuk menjamin kebutuhan fisik dan kimia sehingga spermatozoa dapat
mempertahankan kelangsungan hidupnya selama proses kriopreservasi maka harus
ditambahkan bahan pengencer. Syarat bahan pengencer antara lain mengandung
unsur-unsur yang hampir sama dengan sifat fisik dan kimia semen, tidak boleh
mengandung zat-zat yang bersifat racun baik terhadap spermatozoa maupun terhadap
seluran kelamin hewan betina dan tetap mempertahankan serta tidak membatasi daya
fertilitas spermatozoa (Purdy 2006a).
Bahan pengencer semen mempunyai fungsi, antara lain sebagai sumber energi,
melindungi spermatozoa terhadap kerusakan akibat pendinginan yang cepat (anti
cold shock), sebagai penyangga (buffer) yang mencegah efek membahayakan
terhadap perubahan pH akibat terbentuknya asam laktat, mempertahankan tekanan
osmotik dan keseimbangan elektrolit, menghambat pertumbuhan bakteri, menambah
volume semen, dan melindungi sel spermatozoa selama proses pembekuan
(krioprotektan). Secara umum bahan pengencer terdiri atas tiga bagian, yakni
1) bahan dasar seperti kuning telur dan susu, 2) bahan penyangga (buffer), seperti
natrium-kalium bikarbonat, asam sitrat, tris dan 3) bahan tambahan, seperti gliserol
dan antibiotik (Hafez 2000).
Berdasarkan rekomendasi dari Bearden et al. (2004), ada dua alternatif bahan
pengencer semen kambing, yaitu Tris-asam sitrat-fruktosa-kuning telur dan natrium
sitrat-fruktosa-kuning telur. Gazali dan Tambing (2002) menjelaskan bahwa
beberapa jenis bahan pengencer yang sering digunakan dalam pembekuan semen
antara lain adalah glukosa, laktosa, sukrosa, sitrat, susu skim dan tris. Glukosa,
laktosa dan sukrosa merupakan sumber energi sehingga spermatozoa tetap bertahan
hidup selama proses pembekuan. Sitrat berperan sebagai komponen penyangga
sehingga dapat mempertahankan pH semen secara fisiologi.
12
Bufer Tris
Tris (Tris hydroxymethyl aminomethane) banyak digunakan sebagai pengencer
semen beku pada sapi, yang memiliki toksisitas yang rendah dan sistem penyangga
yang baik, akan tetapi telah banyak pula peneliti menggunakan pengencer tris untuk
pengenceran semen kambing baik untuk keadaan cair maupun beku. Pengencer harus
berisikan beberapa agen protektif untuk melindungi spermatozoa selama proses
kriopreservasi, antara lain kuning telur untuk melindungi membran sel selama
pendinginan sampai suhu 5oC dan krioprotektan yang melindungi spermatozoa
terhadap kerusakan membran selama pembekuan (Khalifa dan El-Saidy 2006a).
Dijelaskan lebih lanjut bahwa tris aminomethan bersama asam sitrat yang berperan
sebagai penyangga untuk mempertahankan perubahan pH akibat terbentuknya asam
laktat hasil metabolisme spermatozoa juga berperan untuk mempertahankan tekanan
osmotik dan keseimbangan elektrolit. Gazali dan Tambing (2002) menyatakan
bahwa tris memiliki kelebihan sebagai pengencer karena memiliki kapasitas sebagai
penyangga yang baik dan mampu mempertahankan tekanan osmotik karena
mengandung garam-garam dan asam amino.
Kacang Kedelai
Menurut Aboagla dan Terada (2004a), yang menyatakan bahwa anti cold
shock, perlu ditambahkan dalam bahan pengencer agar dapat melindungi
spermatozoa pada saat perubahan suhu dari suhu ruang (28oC) pada saat pengolahan
ke suhu ekulibrasi (5oC). Anti cold shock yang umum ditambahkan adalah kuning
telur ataupun kacang kedelai yang dapat melindungi spermatozoa membran
spermatozoa pada saat pendinginan dan pembekuan. Khasiat utama kuning telur
ataupun kacang kedelai adalah kandungan lesitin (phosphatidyl choline) yang
bersifat membran couting untuk tetap mempertahankan konfigurasi normal dari
phospholipid bilayer yang merupakan susunan utama membran spermatozoa.
El-Keraby et al. (2010) menyatakan bahwa kacang kedelai mengandung lesitin lebih
unggul daripada kuning telur, selain itu kuning telur memiliki kecenderungan
terkontaminasi bakteri lebih besar daripada kacang kedelai. Lesitin dari kacang
kedelai merupakan pilihan yang tepat sebagai sumber lesitin bahan pengencer semen
dimasa yang akan datang (Aires et al. 2003). Kacang kedelai telah dilaporkan
mampu menekan stres oksidatif (Ogbuewu et al. 2010). Kacang kedelai yang belum
maupun yang sudah mengalami penyulingan memiliki kandungan fosfolipid
(Aku et al. 2007) (Tabel 1).
Lesitin kacang kedelai memiliki bahan-bahan yang mirip dengan lesitin pada
kuning telur yang digunakan untuk perlindungan terhadap cold shock pada saat
kriopreservasi (Thun et al. 2002; Aires et al. 2003). Meskipun lesitin dari bahan
nabati seperti lesitin dari kacang kedelai banyak tersedia, akan tetapi lesitin dari
kuning telur masih banyak digunakan untuk pembekuan semen (Aires et al. 2003;
Santiago-Moreno et al. 2008).
Kuning Telur
Kuning telur merupakan komponen yang paling umum digunakan pada bahan
pengencer untuk kriopreservasi karena terbukti memiliki efek yang menguntungkan
sebagai pelindung dari membran plasma dan akrosom terhadap kejutan dingin
apalagi bila digabungkan dengan komponen lainnya selama penyimpanan sebelum
inseminasi buatan (Amirat et al. 2004). Dijelaskan lebih lanjut bahwa didalam
13
kuning telur terdapat kandungan fosfolipid, kolesterol dan low density lipoprotein
yang berfungsi melindungi spermatozoa dari kejutan dingin selama proses
pembekuan.
Kuning telur mempunyai sifat sebagai penyangga tekanan osmotik sehingga
spermatozoa lebih toleran terhadap lingkungan yang hipotonik atau hipertonik
(Khalifa dan El-Saidy 2006b). Hal ini karena kuning telur mengandung beberapa
senyawa yang penting untuk kelangsungan hidup spermatozoa selama penyimpanan.
Komposisi fosfolipid kuning telur menurut Juneja et al. (1994) dan Dong et al.
(2006) tersaji pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi kacang kedelai dan kuning telur
Komposisi
Kacang kedelai
Kuning telur
(Aku et al. 2007) (Juneja et al. (Dong et al.
1994)
2006)
Fosfatidil kolin (lesitin)
17.50% - 23.00%
80.80%
77%
Fosfatidil etanolamin
15.00% - 20.00%
11.70%
18%
Glikolipid
13-16%
Fosfolipid lainnya
14-18%
Trigliserida
2-4%
Lisofosfatidil kolin
1.90%
Sphingomyelin
1.90%
3%
Lemak netral (nonpolar)
3.70%
dan bahan lain
Diduga komponen yang berperan aktif dalam melindungi membran
spermatozoa selama pembekuan adalah fraksi dengan berat jenis rendah, yaitu low
density lipoprotein (LDL) (Moussa et al. 2002). Low density lipoprotein menyusun
sekitar 2/3 dari total bahan padat kuning telur ayam. Senyawa ini mempunyai berat
jenis 1.019-1.063 g/mL, molekulnya bulat (spherical) dengan diameter 20-25 nm,
dan mempunyai inti lipid (trigliserida nonpolar dan ester kolesterol) yang dikelilingi
oleh lapisan fosfolipid dan protein dimana bagian ujung polarnya kontak dengan
aquous phase (Botham dan Mayes 2009; Moussa et al. 2002). Low density
lipoprotein tersusun atas 85-90% lipid (69% trigliserida, 26% fosfolipid dan
5% kolesterol) dan 10-15% protein. Botham dan Mayes (2009) menyelaskan lebih
lanjut bahwa LDL tersusun atas 79% lipid (dengan komponen utama kolestrol) dan
21% protein, protein utama yang membentuk LDL adalah Apo-B (apolipoprotein-B).
Didalam lipoprotein terdapat empat kelas utama lipid terdiri dari 16% triasilgliserol,
30% fosfolipid, 14% kolestrol, 36% ester kolesteril serta sedikit asam lemak rantaipanjang tak teresterifikasi (asam lemak bebas) (4%). Holt (2000) menyatakan bahwa
penggunaan konsentrasi akhir kuning telur dengan persentase yang berbeda berkisar
antara 0-20%, namun sebagian besar melaporkan kesuksesan inseminasi
menggunakan semen beku dengan konsentrasi kuning telur sebesar 20% pada bahan
pengencer.
Karbohidrat
Karbohidrat merupakan sumber energi bagi spermatozoa. Karbohidrat yang
ditambahkan kedalam pengencer semen memiliki beberapa fungsi, yakni
menyediakan sumber energi yang mendukung motilitas spermatozoa selama
14
inkubasi, mempertahankan tekanan osmotik cairan dan bertindak sebagai
krioprotektan. Kemampuan jenis karbohidrat dalam melindungi sel spermatozoa
tergantung pada suhu penyimpanan semen, berat molekul dari jenis karbohidrat dan
tipe dari penyangga yang digunakan dalam pengencer. Sebagai sumber energi selama
dalam preservasi dan kriopreservasi, kedalam media pengencer ditambahkan
senyawa karbohidrat. Beberapa yang biasa ditambahkan adalah monosakarida
(glukosa dan fruktosa), disakarida (laktosa, sukrosa dan trehalosa) dan oligosakarida
(rafinosa). Trehalosa (C12H22O11) yang merupakan gula nonpereduksi golongan
disakarida (α-D-glukopiranosil-(1Æ1)-α-D-glukopiranosida) dari dua molekul
glukosa yang terikat melalui ikatan α-1.1 (Gambar 3) dan mengandung antioksidan
(Best c1990), Trehalosa bukan merupakan gula pereduksi, karena 2 atom karbon
anomerik berikatan satu sama lain. Rafinosa (C18H32O16) yang merupakan gula
pereduksi golongan trisakarida (α-D-galaktopiranosil-(1Æ6)-α-D-glukopiranosidaβ-D-fruktofuranosil) dari satu molekul galaktosa dan glukosa yang terikat melalui
ikatan α-1.6, serta satu molekul fruktosa (Gambar 4) (Bender dan Mayes 2009).
CH2OH
O
HO OH
CH2OH
O
O
HO OH
HO
Gambar 3 Trehalosa
CH2OH
O
H
HO H
H OH
H
H
OH
CH2
O
H
H
HO OH
H
O
HOH2C
O
O
H
H
OH
OH
H
HO CH2OH
H
Gambar 4 Rafinosa
Penggunaan disakarida (trehalosa) dan trisakarida (rafinosa) pada pengenceran
semen beberapa ternak diduga lebih mampu melindungi spermatozoa dalam proses
pembekuan (Yildiz et al. 2000). Trehalosa dan rafinosa adalah karbohidrat dengan
molekul besar yang berfungsi sebagai krioprotektan ekstraseluler (Crowe dan Crowe
2000). Penggunaan trehalosa dan ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) pada
pembuatan semen beku domba dilaporkan dapat meningkatkan persentase
spermatozoa motil dibandingkan dengan hanya menggunakan fruktosa (Aisen et al.
2000). Pengencer tris sitrat yang mengandung trehalosa dapat meningkatkan
viabilitas spermatozoa pada saat pembekuan dan pencairan kembali semen beku
15
kambing. Selain itu trehalosa juga dapat meningkatkan kelangsungan hidup sel
spermatozoa selama penyimpanan dalam nitrogen cair, serta dapat meningkatkan
fluiditas membran akibat transisi suhu yang dapat menyebabkan membran sperma
dapat bertahan pada suhu rendah (Aboagla dan Terada 2003).
Beberapa laporan mengungkapkan informasi tris-kuning telur sebagai
pengencer terbaik untuk pengawetan semen sapi FH (Friesian Holstein) (Arifiantini
dan Purwantara 2010), ram (Nel-Themaat et al. 2006; Paulenz et al. 2003; Purdy
2006b; Soylu et al. 2007), kerbau (Rasul et al. 2000; Sukhato et al. 2001), kambing
(Fukui et al. 2008; Purdy 2006a), kambing Spanish Ibex (Santiago-Moreno et al.
2008), anjing (Hermansson dan Linde-Forsberg 2006; Schafer-Somi et al. 2006),
gajah (Graham et al. 2004). Arifiantini et al. (2005), menggunakan Tris Raffinosakuning telur, Tris Fruktosa-kuning telur dan bahan pengencer komersial berbasis
soya lechitin untuk pengawetan semen sapi FH (Friesian Holstein). Keunggulan
penambahan trehalosa telah dilaporkan pada semen tikus (Sztein et al. 2001), sapi
(Woelders et al. 1997), anjing (Yildiz et al. 2000), domba (Aisen et al. 2002),
kambing (Aboagla dan Terada 2004b) dan babi (Hu et al. 2009). Sedangkan
keunggulan rafinosa juga telah dilaporkan pada semen kambing Angora (Salamon
dan Ritar 1982) dan tikus (Holt 2000).
Krioprotektan
Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berfungsi mereduksi
pengaruh letal proses pemaparan kriopreservasi sel diantaranya baik yang berupa
efek larutan maupun pembentukan kristal es ekstra maupun intraseluler sehingga
dapat menjaga viabilitas sel setelah kriopreservasi (Purdy 2006a).
Leboeuf et al. (2000) menjelaskan bahwa krioprotektan dapat dikelompokan
berdasarkan perpaduan antara sifat fisik kimia (besar molekul, polaritas dan
koligatif) dengan sifat biologis membran sel yang semipermeabel maka dapat dibagi
menjadi dua bagian yaitu krioprotektan ekstraseluler dan intraseluler, yang termasuk
krioprotektan intraseluler yakni gliserol (gliserin), dimethylsulfoxide (DMSO),
1.2 prepanadiol dan etilen glikol. Sedangkan yang termasuk krioprotektan
ekstraseluler adalah polyvynilpirrolidone (PVP), gula dengan molekul besar seperti
sukrosa, rafinosa dan laktosa, protein dan lipoprotein, kuning telur dan susu.
Berdasarkan cara kerjanya krioprotektan dikelompokan menjadi penetrating
(bekerja di dalam dan di luar sel) dan non-penetrating (hanya di luar sel)
(Best c1990). Sedangkan berdasarkan bahan yang terkandung didalamnya
krioprotektan diklasifikasikan menjadi dua golongan, yaitu golongan alkohol (seperti
etilen glikol dan gliserol) dan golongan amida (seperti dimethilformamida, asetamida
dan methilformamida) (Alvarenga et al. 2005). Fungsi krioprotektan adalah
mencegah terbentuknya kristal-kristal es akibat dehidrasi sel yang berlebihan dari
dalam sel dan menstabilkan membran plasma sel sehingga dapat melindungi
kerusakan fisik maupun fungsional spermatozoa selama proses pembekuan dan
memodifikasi struktur kristal sehingga tidak merusak organel-organel sel (Gazali dan
Tambing 2002).
Krioprotektan intraseluler gliserol (C3H5(OH)3) (Gambar 5) merupakan
komponen utama lipida yang mengandung tiga atom karbon (C) dan tiga gugus OH
yang dibentuk melalui lipolisis, yakni disforilasi dan dioksidasi menjadi
dihidroksiaseton fosfat dan selanjutnya dihidrolisis menjadi gliseradehida 3-fosfat
(Voet et al. 1999). Penambahan gliserol ke dalam pengencer semen beku dapat
16
meningkatkan daya tahan spermatozoa. Efek lain gliserol adalah mencegah
pengumpulan molekul H2O dan mencegah kristalisasi es pada daerah titik beku
larutan. Gliserol akan berdifusi, menembus dan memasuki spermatozoa dan akan
digunakan untuk aktivitas metabolisme oksidatif, menggantikan sebagian air yang
bebas dan mendesak keluar elektrolit-elektrolit, menurunkan konsentrasi elektrolit
intraseluler dan mengurangi daya merusaknya terhadap spermatozoa dengan jalan
memodifisir kristal-kristal es yang terbentuk (Tambing et al. 2000).
H
O
H
C
CH3
N
CH3
H C OH
H C
OH
H C OH
H
Dimethilformamida (DMF) (CH3)2NCHO
Gliserol (C3H5(OH)3)
Gambar 5 Dimethilformamida (DMF) dan gliserol
Gliserol telah menjadi krioprotektan yang paling banyak digunakan untuk
pembekuan semen (Leboeuf et al. 2000). Namun demikian amida juga telah
menunjukan potensi yang baik sebagai krioprotektan, karena memiliki toksisitas
yang yang lebih rendah dan memiliki bobot molekul yang rendah pula
(Medeiros et al. 2002b). Bezerra et al. (2011) menyatakan bahwa amida memiliki
toksisitas yang lebih rendah dan dapat menjaga integritas akrosom. Amida telah
diusulkan sebagai krioprotektan alternatif untuk pembekuan semen, terutama untuk
semen dari pejantan yang lebih sensitif terhadap efek racun dari gliserol karena
amida memiliki bobot molekul (73.09) dan viskositas yang lebih rendah
dibandingkan dengan gliserol (dengan bobot molekul 92.05) dan untuk permeabilitas
membran yang lebih tinggi sehingga dapat mengurangi kemungkinan kerusakan sel
yang disebabkan oleh tekanan osmotik. Selain itu penambahan metil (CH3) kedalam
molekul amida dapat meningkatkan permeabilitas membran sperma dan
meningkatkan efisiensi kriopreservasi. Purdy (2006a) menyatakan bahwa walaupun
gliserol agak beracun bagi spermatozoa dan dapat menyebabkan kerusakan osmotik,
gliserol adalah krioprotektan yang paling banyak digunakan untuk pembekuan
semen. Penggunaan dimethilformamida (DMF) tidak lebih unggul daripada gliserol
jika digunakan sebagai krioprotektan untuk semen kambing (Bezerra et al. 2011).
Dimethilformamida (DMF) termasuk kedalam kelompok polar aprotik. DMF
memiliki titik didih 153°C, konstanta dielektrik 38 dan massa jenis 0.944 g/mL
(Pelarut 2011). DMF di digolongkan sebagai senyawa amida dan memiliki sifat basa
lemah (Bixara 2009). Dimethilformamida (DMF) merupakan pelarut aprotik polar
yang digunakan dalam pembekuan kering. Pelarut aprotik polar adalah pelarut yang
tidak memiliki proton untuk ikatan hidrogen pada inti dan akan melarutkan lebih
banyak kation daripada anion. Dengan demikian anion tersebut kurang terikat oleh
molekul pelarut dan lebih banyak tersedia untuk reaksi, sehingga semakin polar suatu
pelarut maka energi aktivasi untuk ionisasi akan semakin rendah dan derajat
reaksinya akan semakin cepat (Alvarenga et al. 2005). Dimethilformamida
17
merupakan salah satu cryoprotectant agent (CPA) dengan konstanta dielektrik yang
tinggi (Best c1990). Konstanta dielektrik merupakan suatu ukuran kemampuan zat
untuk memisahkan daya tarik antara partikel bermuatan listrik yang berlawanan
(Best c1990).
Dimethilformamida (DMF) merupakan derivat acyl dan mempunyai rumus
struktur (CH3)2NCHO (Gambar 5). Acyl terdiri atas sepasang grup fungsional
dimana sebuah karbonil bergabung dengan oksigen, halogen, sulfur atau atom
elektronegatif lainnya. Derivat acyl yang penting adalah asam klorida, ester dan
amida yang mendekati struktur asam karboksilat. N,N dimethilformamida adalah
amida yang dihasilkan N-alkil tersubtitusi atau N,N-dialkil tersubtitusi, dan amida
relatif stabil terhadap air (Fessenden dan Fessenden 2006). Dijelaskan lebih lanjut
oleh Fessenden dan Fessenden (2006), DMF merupakan pelarut aprotik polar, polar
berarti mengutub dimana satu atom mempunyai keelektronegatifan yang substansial
lebih besar dari atom lainnya. Semakin elektronegatif suatu atom, semakin besar
tarikannya terhadap elektron sehingga tidak cukup bagi atom untuk memecahkannya
menjadi ion. Atom ini mempunyai bagian elektron yang besar dan menghasilkan
suatu ikatan dengan distribusi elektron yang tidak merata.
Pelarut aprotik adalah pelarut yang tidak memiliki proton terhadap nukleofilik
(Pine et al. 1988), sedangkan nukleofilik adalah anion yang mengikat suatu halida
dalam suatu rekasi substitusi. Umumnya suatu nukleofil ialah spesi apa saja yang
tertarik kesuatu pusat positif dan merupakan suatu basa lewis dan zat yang dapat
memberikan sepasang elektron. Wade (2000) menjelaskan bahwa DMF yang
merupakan pelarut yang bersifat polar aprotik (tidak mempunyai atom -H untuk
ikatan hidrogen) dengan konstanta dielektrik dan moment dipol yang tinggi. Jadi
meskipun DMF melarutkan tidak bekerja membentuk ikatan hidrogen dengan anion.
DMF dapat melarutkan garam-garam terutama melalui kation larutan melalui daya
tarik pada ujung dipol C=O. Ujung positif dari dipol dilindungi di dalam molekul dan
dapat melarutkan anion tetapi sangat lemah. Pine et al. (1998) menjelaskan bahwa
amida dapat dengan mudah terbentuk dari senyawa yang sesuai yang memiliki gugus
amino dan gugus karboksilat. Oleh karena itu amida mudah bereaksi dengan asam
karboksilat di dalam reaksi asam-basa sehingga menghasilkan garam amonium.
(Fessenden dan Fessenden 2006) menyatakan bahwa hidrolisis suatu amida dalam
larutan asam berlangsung dalam suatu cara yang serupa dengan hidrolisis suatu ester.
Oksigen karbonil diprotonasi, karbon karbonil diserang oleh H2O, proton diserah
terimakan, dan suatu amina dibuang. Amina ini kemudian bereaksi dengan H+ dan
menghasilkan garam amina. Pembentukan garam amina menjelaskan bahwa H+
bersifat pereaksi, bukan katalis.
Krioprotektan ideal untuk pembekuan spermatozoa harus memiliki bobot
molekul yang kecil, mudah larut dalam air dan memiliki toksisitas yang rendah
(Alvarenga et al. 2005). Gliserol dapat masuk ke dalam spermatozoa sapi dalam
waktu 3 sampai 4 menit (Arifiantini dan Supriatna 2007). Dimethilformamida (DMF)
2% merupakan krioprotektan yang lebih baik dibandingkan gliserol atau kombinasi
DMF dan gliserol (Vidament et al. 2002). Dimethilformamida 5% juga mempunyai
kemampuan melindungi sel terhadap pembekuan lebih baik dibandingkan dimethil
asetamida, methil formamida atau gliserol dengan konsentrasi yang sama (Medeiros
et al. 2002b).
Beberapa penelitian melaporkan bahwa kriopreservasi spermatozoa telah
berhasil dilakukan dengan konsentrasi gliserol berkisar 3-9% (Leboeuf et al. 2000).
18
Penambahan gliserol ke dalam pengencer dapat mengurangi tingkat kerusakan akibat
pembekuan. Gliserol merupakan bahan osmotik aktif yang menyebabkan
penambahan secara temporer dikarenakan perubahan volume sel dan berkurangnya
kadar air didalam sel. Manfaat utama dari gliserol adalah secara intraseluler
memberikan efek langsung terhadap membran plasma. Gliserol mengubah sifat
koligatif air untuk menurunkan titik beku, sehingga memberikan waktu yang lebih
lama bagi air untuk keluar dari sel sebelum pembekuan dan pembekuan kristal es
yang dapat merusak organel intraseluler (Leboeuf et al. 2000).
Antibiotik
Pengendalian pertumbuhan mikroba merupakan langkah penting dalam
mencegah penyebaran penyakit reproduksi melalui penggunaan semen dan untuk
meningkatkan efisiensi reproduksi ternak. Komponen bahan pengencer seperti
kuning telur dapat meningkatkan pertumbuhan mikroba, sehingga penambahan
antibiotik pada bahan pengencer semen efektif untuk mengontrol pertumbuhan
mikrobiologis (Mitchell dan Doak 2004).
Dalam beberapa kasus, jaringan testis dan kelenjar kelamin pelengkap
merupakan daerah yang bebas bakteri dan kontaminasi bakteri cenderung terjadi dari
ejakulat selama proses koleksi semen. Antibiotik perlu ditambahkan pada pengencer
sejak komponen bahan pengencer dan semen berada pada temperatur 15-16°C yang
mendorong pertumbuhan bakteri gram negatif seperti Escherichia coli dan
Salmonella. Kontaminasi bakteri terutama mengarah kepada serangkaian perubahan
termasuk berkurangnya motilitas spermatozoa, aglutinasi, peningkatan perubahan
akrosom dan penurunan pH ke level asam (5.6-6.4) (Althouse et al. 2004).
Ekuilibrasi, Pembekuan dan Thawing
Ekulibrasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh spermatozoa untuk
menyesuaikan diri sebelum pembekuan, yang dilakukan dengan cara menempatkan
straw yang berisi semen pada temperatur 5oC selama empat jam. Leboeuf et al.
(2000) menyatakan bahwa ekulibrasi dilakukan selama 1.5-4 jam pada temperatur
4–5 oC. Setelah ekuilibrasi selesai dilakukan, tahap selanjutnya yang dilakukan
adalah pembekuan semen. Pembekuan semen dilakukan secara hati-hati dengan cara
meletakkan straw pada uap nitrogen (N2) cair pada jarak 3 cm di atas permukaan N2
cair selama 10 menit dengan mengunakan boks styrofoam. Semen beku tersebut
disimpan dalam kontainer N2 cair (-196oC) sampai dilakukan evaluasi (Purdy 2006a).
Thawing atau pencairan kembali merupakan periode kritis karena
berhubungan dengan perubahan suhu yang sangat menentukan daya fertilisasi
spermatozoa dan tidak hanya mempengaruhi motilitas tetapi juga membran plasma
utuh spermatozoa. Selama thawing terjadi pengaliran krioprotektan intraseluler
(gliserol) pada medium secara berangsung-angsur sehingga harus dilakukan sehatihati mungkin agar tidak merusak spermatozoa (Leboeuf et al. 2000). Pencairan
kembali pada semen beku kambing dilakukan dengan mencelupkan ministraw
kedalam air dengan suhu 37 oC selama 30 detik (Naing et al. 2010). Dijelaskan lebih
lanjut bahwa semen beku kambing yang dicairkan kedalam air dengan suhu 37oC
selama 30 detik memberikan hasil yang baik untuk kualitas dan fertilitas
spermatozoa.