IDENTIFIKASI EKSPRESI PROTEIN RESEPTOR ORGAN OTAK

Bimafika, 2011, 3, 216 -224
IDENTIFIKASI EKSPRESI PROTEIN RESEPTOR ORGAN OTAK IKAN KERAPU
TIKUS (Cromileptes altivelis) PADA INFEKSI VIBRIOSIS
Inem Ode
Staff Pengajar Fakultas kelautan dan Perikanan
Universitas Darussalam Ambon
Diterima 1-12-2010; Terbit 31-06-2011
ABSTRACT
Vibrio spp. is pathogen bacteria which causes vibriosis disease that often attack the grouper. Brain is one of
the often infected organ. It is caused by the presence of spesific tissue or cellular receptor for pathogen
colonization. The aim of the research was to know the expression of receptor protein of the brain organ of
the Humpback Grouper (Cromileptes altivelis) at the vibriosis infection and to know the specification of the
brain organ at molecular level of Humpback Grouper brain that can be used for development of construc
primer mRNA receptor that infected by vibriosis. The research used exploration and descriptive methods by
isolating receptor protein of Humpback Grouper brain and analizing the spesific protein expresion by
hemaglutinin test SDS-PAGE, dot blotting and western blotting. The conclusion of the research is the
brain organ of Humpback Grouper has receptor protein that able to recognize the bacteria adhesion
protein of vibrio alginolyticus (47,98 kDa), vibrio harveyi (51,16 kDa), vibrio parahemolyticus (19,35
kDa), and vibrio anguilarum (57,08 kDa) that is expected is virulence factor in the infection
mechanism. The adhesion protein that is known by receptor protein of brain organ is the
immunogenic adhesion protein that showed by the presence of positive reaction between
immunogenic adhesion protein and antibody (Ig) anti grouper.
Keywords: C.altivelis, receptor protein, brain, vibriosis.
Pendahuluan
Vibrio spp. adalah bakteri patogen penyebab
penyakit vibriosis yang sering meyerang ikan
jenis kerapu. Infeksi bakteri patogen Vibrio
diduga sebagai penyebab rendahnya laju
sintasan (Survival Rate, SR) pada pembanihan
ikan kerapu tikus, yaitu berkisar antara 1,2 –
2,9% (Koesharyani dkk., 2000). Proses yang
menyebabkan terjadinya infeksi bakteri diawali
dengan perlekatan, kolonisasi, kemudian invasi.
Perlekatan bakteri terhadap permukaan sel
membutuhkan dua faktor yaitu reseptor dan
adhesin. Otak merupakan salah satu organ yang
sering terinfeksi bakteri. Hal ini disebabkan
karena adanya jaringan spesifik atau reseptor
seluler bagi kolonisasi patogen, dan juga
didukung oleh syarat-syarat optimum baik dari
sisi kecukupan nutrien maupun lingkungan bagi
pertumbuhan patogen (Irianto, 2005).
Berdasarkan penelitian pendahuluan yang
dilakukan menunjukkan bahwa organ otak ikan
kerapu tikus (Cromileptes altivelis) dapat
mengekpresikan protein reseptor pada infeksi
vibriosis (V. alginolyticus, V. anguilarum, V.
parahaemolyticus dan V. harveyi). Saat ini belum
ada penelitian yang dilakukan untuk menemukan
jenis protein spesifik yang bersifat general yang
* Korespondensi : email:
dapat mengenali antigen termasuk Vibriosis
ataupun virus khususnya pada ikan kerapu tikus
(C. altivelis). Mengingat kerapu tikus (C. altivelis)
merupakan ikan ekonomis penting baik sebagai
ikan hias dan ikan konsumsi dalam negeri, juga
sebagai komoditas ekspor andalan ikan hidup,
maka produksi benih kerapu tikus (C. altivelis)
yang bebas penyakit merupakan salah satu
kunci keberhasilannya, dengan mengetahui
ekspresi protein reseptor ikan kerapu tikus (C.
altivelis) dan tingkat spesifitasnya pada infeksi
vibriosis, dapat dijadikan acuan untuk bahan
konstruk primer bagi pengembangan vaksin
peptida dalam mengatasi penyakit Vibriosis.
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui
ekspresi protein reseptor organ otak ikan kerapu
tikus (C. altivelis) pada infeksi Vibriosis dan juga
Mengetahui spesifikasi molekuler organ otak
ikan kerapu tikus (C. altivelis) yang dapat
dijadikan sebagai dasar untuk pengembangan
bahan konstruks primer mRNA reseptor yang
terinfeksi Vibriosis. Manfaat praktis dari
penelitian ini adalah memperoleh bahan peptida
untuk pembuatan vaksin dalam rangka
menghasilkan benih ikan kerapu tikus (C.
altivelis) yang unggul.
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
pemeliharaan pada akuarium selama 1 bulan.
Ikan kerapu yang pergerakannya lincah dan
tidak terjadi perubahan morfologi (tidak terjadi
pendarahan pada bagian tubuh, mata normal
dan tidak menonjol, sisik dan sirip utuh) yang
akan digunakan sebagai
sampel pada
penelitian.
Metode Penelitian
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium
Sentral, laboratorium Ilmu-Ilmu Perairan dan
Bioteknologi Kelautan Fakutas Perikanan dan
Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya Malang.
Waktu penelitian dilaksanakan mulai September
2008 – Juli 2009.
Kultur Bakteri Vibrio
Dalam penelitian ini, bakteri yang digunakan
adalah Vibrio alginolyticus, vibrio harveyi, Vibrio
anguilarum, dan Vibrio parahaemolyticus. Isolasi
Vibrio menggunakan media TCG yang dapat
memperkaya pertumbuhan Vibrio . Media agar
dibuat dalam botol volume 250 ml secara miring
sebanyak 100 botol, setiap botol berisi 50 ml
agar. Vibrio yang dipilih ditanam pada media
o
TCBS yang dieramkan 24 C selama 24 jam.
Hasil biakan diambil dengan cara kerokan yang
sebelumnya dituangkan PBS steril pH 7,4
secukupnya. Suspensi bakteri dimasukkan
dalam botol yang berisi 1000 ml larutan Brain
Heart infusion Broth (BHI), kemudian digoyang
kuat selama 30 menit pada penangas air suhu
o
37 C. kemudian suspensi bakteri sebanyak 10
ml dimasukkan dalam setiap botol yang
mengandung media TCG. Selanjutnya dilakukan
o
pengeraman suhu 37 C selama 2 x 24 jam.
Isolasi Crude Protein Bakteri Vibrio.
Isolasi protein bakteri dilakukan dengan
tahapan sebagai berikut : Kultur bakteri pada
media BHI yang telah di inkubasi selama 24 jam
(suhu kamar), kemudian di sentrifuse pada
kecepatan 4000 rpm (10 menit) sehingga
didapat pellet / whole cell. Kemudian pellet yang
telah didapat digerus/homogenisasi dengan
tujuan untuk menghancurkan dinding sel bakteri,
setelah itu di tambahkan larutan NOG 0,05%.
Kemudian dimasukkan kedalam eppendof dan
disentrifuse dengan kecepatan 11000 rpm
o
selama 20 menit (suhu 4 C). Kemudian protein
akan berada pada bagian atas eppendof dan
whole cell (pellet) berada pada bagian bawah.
Protein diambil dan simpan pada suhu (-20oC).
Metode Uji Hemaglutinasi ( HA )
Sel darah merah (Eritrosit) ikan kerapu tikus
diambil dengan jarum spuit pada bagian caudal
aorta, disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm
selama 10 menit. Kemudian dibuat pengenceran
50 μl eritrosit ditambahkan PBS sampai volume
10 ml lalu dihomogenkan dan selanjutnya siap
digunakan uji HA.
Pengenceran sampel dibuat konsentrasi ½
pada microplan V tiap sumur volumenya 50 μl.
Setiap sumur ditambahkan darah merah
(eritrosit) ikan konsentrasi 0,5% volume sama.
Metode Penelitian
Penelitian
ini
menggunakan
metode
eksploratif dan deskriptif berdasarkan kajian
molekuler.
Persiapan Wadah Pemeliharaan
Wadah pemeliharaan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah akuarium berkapasitas 60
liter (ukuran 75x35x35 cm) sebanyak 6 buah,
dan akuarium berkapasitas 18 liter (ukuran
30x30x30cm) sebanyak 4 buah (digunakan
untuk hewan uji yang terinfeksi). Sebelum
akuarium tersebut digunakan, terlebih dahulu
akuarium
disterillkan
dengan
KCl
lalu
dikeringkan dan dibiarkan selama 24 jam,
setelah itu direndam dengan air tawar dan
dibiarkan selama 2 hari. Kemudian air tawar
dibuang dan diisi air laut yang bersalinitas 30-33
ppt, setelah air laut terisi, disterilkan dengan
menggunakan kaporit (CaCOl2) 100 mg/L dan
dibiarkan selama 3 hari, dengan aerasi
terpasang yang fungsinya untuk menguapkan
sisa-sisa kaporit. Setelah 3 hari air laut
dinetralisir dengan menggunakan natrium
thiosulfat (Na2S2O3) dengan konsentrasi 100 ppt.
Untuk menjaga oksigen dan kestabilan suhu
akuarium dilengkapi dengan aerasi dan hitter,
dengan sistem resirkulasi tertutup.
Aklimatisasi Ikan Kerapu Tikus
Penelitian ini menggunakan Ikan kerapu tikus
(Cromileptes altivelis) yang sehat (tidak
terinfeksi) berdasarkan ciri-ciri morfologi yang
didatangkan dari BBAP Situbondo sebanyak 50
ekor dengan ukuran 9-15 cm, yang ditempatkan
pada
enam
akuarium
dan
dipisahkan
berdasarkan ukuran ikan. Sebelum benih ikan
dimasukkan dalam akuarium, terlebih dahulu
dilakukan aklimatisasi, Pakan yang digunakan
berupa ikan rucah segar. Pemberian pakan
dilakukan sebanyak dua kali per hari, yaitu pada
jam 08.00 pagi dan jam 16.00 sore. Pemberian
pakan dilakukan secara adlibitum, yaitu
memberikan makan sekenang-kenyangnya.
Untuk memastikan ikan kerapu yang akan
digunakan merupakan ikan sehat, dilakukan
217
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
bakteri
(V.algino,
V.anguilarum,
dan
V.parahaemolyticus). tiap sumuran 50 μl (1:10
dalam PBS skim 5%), kemudian diikubasi
overnight pada suhu ruang. Kemudian dibloking
dengan PBS skim 5 % selama 1 jam. Kemudian
dicuci dengan PBS tween 0,05 % (3 x 5 menit).
Menambahkan antibodi primer (1:50 dalam PBS
skim 5 %) tiap sumuran 50 μl. Kemudian
diinkubasi overnight pada suhu ruang. Kemudian
cuci dengan PBS tween 0,05 % (3 x 5 menit),
dan ditambahkan antibodi sekunder (1:50 dalam
PBS skim 3%) tiap sumuran 50 μl. Kemudian
menambahkan substrat chromogen NBT tiap
sumuran 50 μl (buat alquot). Kemudian inkubasi
selama 3 jam pada suhu ruang. Stop reaksi
dengan aquadest, 50 μl tiap sumuran dan amati
hasil.
Kemudian digoyang dengan menggunakan
rotator plate selama satu menit. Selanjutnya
diletakkan pada suhu kamar selam 1 jam.
Besarnya titer ditentukan dengan pengamatan
adanya
aglutinasi
darah
merah
pada
pengenceran yang terendah. Sampel yang diuji
adalah crude protein bakteri. Jenis darah merah
yang digunakan adalah eritrosit ikan kerapu tikus
C. altivelis.
Paparan bakteri Vibrio Ke ikan kerapu.
Stok bakteri diencerkan hingga kepadatan
5
mencapai 10 CFU/ml kemudian dituang pada
air pemeliharaan ikan, setelah bakteri tercampur
ikan kerapu tikus dimasukkan pada aquarium
sebanyak 3 ekor. dan dipelihara selama 2
minggu, setelah itu ikan yang terinfeksi diambil
organ otak untuk diisolasi protein reseptornya
dan isolasi antibodi. Isolasi antibodi dilakukan
dengan menganestesi ikan dengan minyak
cengkeh, darah diambil dari caudal aorta dengan
spuit kemudian dimasukkan dalam eppendorf
yang berisi EDTA. Selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 11.000 rpm selama 15 menit,
0
4 C. Supernatan/serum yang diperoleh disimpan
o
dalam -40 C.
Isolasi Protein Reseptor organ otak ikan
kerapu.
Isolasi protein reseptor dilakukan dengan
tahapan sebagai berikut : organ yang telah
diisolasi ditimbang beratnya, kemudian organ
dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali lalu digerus
sampai halus diusahakan jangan terlalu lama
(digerus dalam mortal yang sudah didinginkan)
yang diletakkan diatas balok es. Kemudian
ditambahkan buffer ekstrak ke dalam mortal dan
diratakan (banyaknya buffer ekstrak yang di
masukkan tergantung berat organ yang ada).
setelah homogen, dituang kedalam eppendof
dan di sentrifuse dengan kecepatan 11000 rpm
pada suhu 4oC selama 20 menit. Pellet / whole
cell yang mengendap di dasar tabung dibuang.
Kemudian supernatan diambil dan dimasukkan
kedalam 2 tabung eppendof, sebanyak 20 μl
untuk SDS-PAGE dan sisanya diukur konsentasi
proteinnya dengan metode Bradford (Nano
drop).
Identifikasi protein reseptor organ ikan
kerapu yang spesifik terhadap protein vibrio
spesifik dengan teknik Dot Blotting.
Kertas nitrosellulosa direndam dalam PBS
selama 30 menit, kemudian nitrosellulosa
dipasang dalam Chamber dot blot, kemudian
organ dimasukkan ke dalam sumuran. Tiap
sumuran 50 μl (1:10 dalam PBS skim 5%).
Kemudian diinkubasi selama 1 jam pada sehu
ruang. Tambahkan antigen dari crude protein
Identifikasi protein reseptor organ ikan
kerapu yang spesifik terhadap protein vibrio
spesifik dengan teknik Western Blott
Western
Blot
dilakukan
dengan
menggunakan Metode Towbin, satu gel
dipindahkan
pada
kertas
nitrosellulosa
menggunakan alat semi dry setelah sampel
tersebut
dilakukan
SDS-page.
Kemudian
dilakukan pengecatan dengan pewarna ponco
2% yang mengandung TSA sampai 3%, untuk
mengetahui apakah protein sampel telah pindah
pada kertas nitrosellulosa dan diberi tanda untuk
menentukan bobot molekul. Kertas nitrosellulosa
dipotong sesuai dengan lajur sumuran.
Selanjutnya, di blok dengan TBE yang
mengandung albumin 3% dalam TBE pH 7,4
ditambah BSA 1% digoyang selama 2 jam.
Selanjutnya, ditambah antibodi sekunder yaitu
anti grouper IgM kosentrasi 1/1000 dalam TBE
pH 7,4 dan BSA 1%, dan dilindungi terhadap
sinar. Digoyang selama 2 jam, kemudian
dilakukan pencucian 2 kali selama 5 menit
menggunakan TBE pH 7,4 tween 20 0,05%.
Sebagai bahan warna digunakan tablet β Cip
yang dilarutkan pada H2O 10 ml. Larutan ini
dituangkan pada kertas nitrosellulosa dan
dilakukan pengamatan terjadinya warna merah.
Jika reaksi, cukup dibilas dengan H2O,
selanjutnya dikeringkan dengan kertas saring.
Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel
Elektrophoresis (SDS-Page)
Sampel crude protein bakteri dan crude
protein organ otak terinfeksi bakteri vibrio
dengan reducing sample buffer (RSB) dan
dipanaskan pada air mendidih 100º C selama 5
menit lalu diinjeksikan pada sumur gel 12,5%
kemudian di running pada kondisi voltase
218
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
konstan 120 V selama 90 menit. Selanjutnya gel
diambil dari plate dan direndam dalam larutan
staining dan destaining dan dishaker selama 30
menit. Sebagai bahan pewarna digunakan
coomassie brilliant blue. Selanjutnya dilakukan
pengamatan pita protein yang terbentuk.
Elektroelusi
Pita protein hasil elektrophoresis dipotong
sesuai dengan berat molekul yang teridentifikasi.
Potongan pita protein selanjutnya dimasukan ke
dalam kantong selofan yang telah diisi dengan
running buffer, selanjutnya dielusi pada alat
elektro elufer vertikal untuk mengangkat protein
yang terdapat di dalam gel, pada tegangan 110
volt selama 2 jam. Kantong selofan yang telah
berisi larutan selanjutnya dilakukan dialisa untuk
memisahkan protein dari bahan-bahan non
protein.
Dialisa
Membran selofan direbus selama 5 menit,
dimasukkan ke dalam cawan petri berisi
aquadest, diikat bagian bawah membran selofan
menggunakan benang. Kemudian diambil
supernatan sampel menggunakan micropipet SL
1000 dan blue tip sebanyak 500 μl, kemudian
dimasukkan
ke
dalam
eppendorf
dan
ditambahkan PBS sebanyak 500 μl ke dalam
eppendorf, sampel dimasukkan ke dalam
membran selofan menggunakan micropipet SL
1000 dan blue tip. Kemudian bagian atas
membran selofan diikat dengan benang. Agar
membran dapat mengapung diikat pelampung
dari steroform tipis. Kemudian dimasukkan buffer
phospat sebanyak 1 liter ke dalam becker glass,
sampel siap dimasukkan ke dalam becker glass
dan ditutup
bagian atas menggunakan
aluminium voil, kemudian dimasukkan magnet
stike ke dalam becker glass. becker glass
diletakkan di atas stirer dan dilakukan stirer
selama 12 jam. Kemudian stirer dimatikan dan
becker glass diangkat. Kemudian dibuka
aluminium
voil,
angkat
sampel
dialisa
menggunakan pinset dan diletakkan dalam
cawan petri. sampel dipindahkan dari dalam
membran
selofan
ke
dalam
eppendorf
menggunakan micropipet SL 1000 dan blue tip
Hasil Dan Pembahasan
Hasil Kultur Bakteri Vibrio spp.
Hasil kultur bakteri vibrio alginolyticus, vibrio
harveyi, vibrio parahemoliticus dan vibrio
anguilarum Koloni bakteri vibrio pada media
TCBSA
adalah
menyebar,
tepi
tajam,
permukaan halus, berwarna kuning. Morfologi
bakteri vibrio yang tampak adalah bentuk batang
bengkok, gram negatif.
Hasil Uji Hemaglutinasi (Ha) Crude Protein
Vibrio spp.
Perlekatan bakteri pada sel inang diperankan
protein adhesin yang identik dengan protein
hemaglutinin. Protein hemaglutinin merupakan
salah satu kelompok protein adhesin yang
berperan dalam perlekatan saat mekanisme
infeksi bakteri. Untuk mengetahui hemaglutinin
Vibrio spp. terhadap eritrosit ikan kerapu dilakukan
uji hemaglutinasi (Ha). Reaksi hemaglutinasi
dapat
dibaca
setelah
kontrol
eritrosit
mengendap. Reaksi dikatakan positif apabila
terjadi aglutinat (penggumpalan) di dasar tabung
dan negatif apabila terjadi endapan di dasar
tabung seperti pada kontrol eritrosit. Uji
hemaglutinasi crude protein vibrio terhadap
eritrosit ikan kerapu tikus, tertera pada Gambar 1.
Pengujian hemaglutinasi crude protein Vibrio spp.
dengan eritrosit ikan kerapu tikus diperoleh hasil
bahwa pada vibrio alginolitycus hemaglutinasi
positif pada titer pengenceran ¼,, vibrio harveyi
pada titer pengenceran 1/8, vibrio parahemolitycus
pada titer pengencean ¼ dan vibrio anguilarum
hemaglutinasi positif terjadi pada semua titer
pengenceran.
Keterangan :
A. Crude protein V. alginolyticus dengan titer aglutinasi
positif sampai pengencaran ¼.
B. Crude protein V. harveyi dengan titer aglutinasi positif
sampai pengencaran 1/8.
C. Crude protein V. parahaemolyticus dengan titer
aglutinasi positif sampai pengencaran ¼.
D. Crude protein V. anguilarum dengan titer aglutinasi
positif sampai pengencaran 1/1024.
Analisis Data
Analisa pita protein hasil elektroforesis dan uji
respon reseptor dengan western bloting melalui
penghitungan jarak protein (Rf) menggunakan
regresi untuk menentukan bobot molekul organ
otak. Dan Ekspresi reseptor dengan dot blot
yang dianalisa menggunakan program coral
draw graphic suite X4.
Gambar 1. Uji hemaglutinasi (Ha) crude protein
vibrio dengan eritrosit ikan kerapu.
Hal ini berarti bahwa crude protein Vibrio spp.
merupakan antigen yang mempunyai kesesuaian
untuk berikatan dengan reseptor pada eritrosit
219
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
ikan kerapu tikus, yang menunjukkan adanya
epitop yang diikat oleh reseptor. Hasil uji
hemaglutinasi crude protein Vibrio spp. tertera
pada Tabel 1.
organ otak normal dan organ otak yang terinfeksi
bakteri vibrio tertera pada Gambar 3.
Identifikasi Crude Protein Bakteri Vibrio
Isolasi bakteri Vibrio bertujuan untuk
mendapatkan crude protein bakteri vibrio. Crude
protein adalah antigen dari bakteri yang
berfungsi sebagai faktor penting dalam proses
infeksi bakteri pada hospes. Identifikasi protein
bakteri dilakukan dengan metode SDS PAGE
Elektroforesis
dengan
menggunakan
poliakrilamid 12.5% dan pewarnaan marker
protein dengan PRO-STAIN. Gambaran pita
protein yang muncul dan bobot molekulnya (BM)
dihitung
dengan
regresi-korelasi
yang
dibandingkan dengan marker. Profil pita protein
crude protein bakteri vibrio spp. tertera pada
Gambar 2
Gambar 3. Profil pita protein organ otak ikan
kerapu tikus yang normal dan terinfeksi vibrio.
Berdasarkan hasil elektroforesis SDS-PAGE,
diperoleh ekspresi protein pada organ otak
normal terpapar 13 pita protein, pada organ otak
terinfeksi vibrio alginolyticus terpapar 21 pita
protein, pada organ otak terinfeksi vibrio harveyi
14 pita protein, pada organ otak terinfeksi vibrio
anguilarum dan vibrio parahemolyticus terpapar
masing-masing 14 pita protein.
Hasil Uji Reaksi Silang (Cross Reaction)
Protein Reseptor Organ Otak Ikan Kerapu
Tikus, Crude Protein Vibrio dan Antibodi (IgM)
Ikan Terinfeksi Vibrio dengan Teknik Dot Blot
Uji Reaksi Silang (Cross Reaction) Protein
Reseptor Organ Otak Ikan Kerapu Tikus, Crude
Protein Vibrio dan Antibodi (IgM) Ikan Terinfeksi
Vibrio dengan Teknik Dot Blot bertujuan untuk
mengetahui apakah antibodi dapat mengenali
antigen dengan perantara protein reseptor. Hasil
dot blot tertera pada Gambar 4.
Crude v.alginolyticus
Gambar 2. Profil pita crude protein bakteri vibrio
Ig
algi
Berdasarkan hasil elektroforesis SDS-PAGE
diperoleh ekspresi pita protein pada vibrio
alginolitycus terpapar pada 14 pita protein, vibrio
harveyi 16 pita protein, vibrio parahaemolitycus
19 pita protein dan vibrio anguillarum 15 pita
protein.
Ig
har
Ig.
para
Crude v.harveyi
Ig.
ang
Ig
algi
Ig.
har
Ig.
Ig
ang
para
otak
Crude vparahemolyticus
Ig
algi
Identifikasi Protein Reseptor Organ Otak Ikan
Kerapu Tikus Normal
dan
Organ
OtakTerinfeksi Bakteri Vibrio.
Protein reseptor organ otak ikan kerapu tikus
(C. altivelis) didapatkan dengan melakukan
isolasi organ otak dengan Buffer Ekstrak, bobot
molekul
diperoleh
dengan
melakukan
elektroforesis SDS-PAGE menggunakan marker
TM
protein PRO-STAIN . Gambaran pola bobot
molekul protein reseptor yang terekspresi pada
Ig
har
Ig.
para
Crude v.anguilarum
Ig.
ang
Ig
algi
Ig.
har
Ig.
Ig
ang
para
otak
Gambar 4. Hasil Uji Reaksi Silang (Cross
Reaction) Protein Reseptor Organ Otak Ikan
Kerapu Tikus, Crude Protein dan Antibodi (IgM)
Ikan Terinfeksi Vibrio dengan Teknik Dot Blot.
Berdasarkan hasil uji reaksi silang pada 16
sampel menunjukan bahwa terjadi reaksi positif
220
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
antara protein reseptor, protein bakteri dan antibodi
(IgM) ikan terinfeksi vibrio yang ditunjukkan dengan
adanya titik (dot) warna biru keunguan pada
membran Nitrosellulosa (NC). Hal ini berarti
bahwa antibodi mampu mengenali antigen
melalui protein reseptor. Semakin gelap warna
pada membran NC semakin kuat pengenalan
antara antigen dan antibodi. Hasil visualisasi
warna
pada
membran
NC
dapat
dikuantifikasikan
dengan
menggunakan
kombinasi Corel Graphics Suite X4 dan ImageJ
Program NIH USA. Hasil kuantifikasi tertera
pada Tabel 2.
Tabel 2. Hasil Kuantifikasi Uji Reaksi Silang
(Cross Reaction).
Crude v.alginolyticus
Ig
algi
Ig
har
Ig.
para
Uji Hemaglutinasi Protein Adhesin
Protein adhesin hasil dialisa selanjutnya
dilakukan pengujian tingkat virulensinya dengan
menggunakan uji hemaglutinasi (HA). Hasil uji
protein adhesin ke empat bakteri tertera pada
Gambar 5.
1/2
1/4
1/8
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024
K(-)
101,50
A
47,98
114,16
B
65,92
51,16
Crude v.harveyi
Ig.
ang
Ig
algi
Ig.
har
Ig.
36,49
Ig
ang
85,45
77,58
para
otak
88,9
64,9
54,9
37,2
80,5
82,7
62,3
97,12
C
64
52,72
Crude v.parahemolyticus
Ig
algi
Ig
har
Ig.
para
Crude v.anguilarum
Ig.
ang
Ig
algi
Ig.
har
Ig.
35,83
19,13
Ig
ang
para
70,44
otak
54,1
66,8
93,9
40
58,4
82,3
35,2
51,7
57,22
D
Berdasarkan tabel 4 hasil kuantifikasi uji
cross reaction terlihat bahwa antigen vibrio
dikenali oleh ke empat antibodi (IgM). Pada
antigen vibrio alginolyticus nilai kuantifikasi
tertinggi pada IgM vibrio alginolyticus yaitu 88,9
%. Pada antigen vibrio harveyi nilai kuantifikasi
tertinggi pada antibodi (IgM) vibrio harveyi yaitu
82,7 %. Antigen vibrio parahemolyticus nilai
kuantifikasi tertinggi pada antibodi (IgM) vibrio
parahemolyticus yaitu 93,9 %. Dan antigen vibrio
anguilarum nilai kuantifikasi tertinggi pada
antibodi (IgM) vibrio harveyi yaitu 51,7 %.
Identifikasi Protein Adhesin Bakteri Vibrio
Berdasarkan hasil SDS-Page crude protein
bakteri vibrio dilakukan identifikasi pita mayor
berdasarkan ketebalan pita, kejelasan pita dan
non dimernya pita protein untuk memperoleh pita
protein spesifik yang diduga merupakan protein
adhesin bakteri dan bersifat imunogenik. Pada
V.alginolyticus terdapat dua pita protein spesifik
yaitu 101,50 dan 47,98 kDa dari 14 pita protein
yang terekspresi. Pada V.harveyi memiliki empat
pita protein yaitu 114.16; 65.92; 51.16; 36.49
kDa
dari 16
pita
protein.
Pada
V.
parahaemolitycus memiliki enam pita protein
yaitu 85.45, 77.58, 70.44, 52.72, 35.83 dan
19.13 kDa dari 15 pita protein. Dan Pada V.
anguilarum terdapat lima pita protein yaitu 97.12,
57.22, 40.22, 32.26 dan 20.76 kDa dari 19 pita
protein.
40,22
32,26
20,76
Keterangan : (A). Pita protein adhesin
v.alginolyticus, (B). Pita protein adhesin
v.harveyi, (C). Pita protein adhesin
v.parahemolyticus, (D). Pita protein adhesin
v.anguilarum.
Gambar 5. Pita protein
Berdasarkan uji hemaglutinasi, pada vibrio
alginolitycus protein adhesin yang paling virulen
adalah 47,98 kDa hemaglutinasi positif pada titer
pengenceran 1/32. pada vibrio harveyi protein
adhesion yang paling virulen adalah 51,16 kDa
hemaglutinasi positif pada titer pengenceran 1/8.
Pada vibrio parahemolitycus protein adhesin
yang paling virulen adalah 19,13 kDa
hemaglutinasi positif pada titer pengenceran
1/64. Pada vibrio anguilarum protein adhesin
yang paling virulen adalah 57,22 kDa
hemaglutinasi positif pada titer pengenceran
1/256.
Hasil Uji Respon Spesifik Protein Reseptor
Organ Otak yang mengenali Protein Adhesin
Imunogenik Bakteri Vibrio Dengan westrn
Blott
221
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
Identifikasi ekspresi protein reseptor dengan
western blotting dapat dilihat pada Gambar 6.
proses endositosis yang berlanjut dengan proses
inflamasi dan infeksi pada sel epitel (Brooks,
1996).
Berdasarkan hasil SDS Page organ otak
normal dan organ otak yang terinfeksi bakteri
vibrio terlihat bahwa pada organ otak normal
terekspresi 13 pita protein, pada organ otak
terinfeksi vibrio alginolyticus terekspresi 21 pita
protein dan pada organ otak terinfeksi vibrio
harveyi,
vibrio
anguilarum,
vibrio
parahemolyticus masing-masing terekspresi 14
pita protein. Terjadi perubahan ekspresi protein
reseptor pada organ otak terinfeksi bakteri vibrio
hal ini diduga bahwa setelah infeksi, terjadi
perubahan fungsi proteomik seperti perubahan
regulasi gen pada tingkat mRNA, respon seluler
dan molekuler, dan terjadi regulasi protein.
Lodish, (2001) menjelaskan bahwa spesifitas
protein yang terkspresi tergantung pula pada
besarnya energi dalam bentuk ATP yang
terbentuk saat proses translasi, di dalam proses
terbentuk
koding
protein
yang
akan
mengekspresikan asam amino. Ekspresi protein
juga terbentuk melalui adanya suatu reaksi
karena adanya autoinducer didalam sel.
Autoinducer tersebut teraktivasi karena signal
transducer didalam sel yang melibatkan protein
unfolding, karena adanya paparan ligand seperti
bakteri mengakibatkan protein menjadi folding,
sehingga pada proses tersebut
dapat
mempengaruhi fungsi protein yang terekspresi.
Hasil uji hemaglutinasi terhadap pita protein
adhesin pada ke empat bakteri diketahui bahwa
pada vibrio alginolitycus pita protein adhesin
yang paling virulen adalah 47,98 kDa, pada
vibrio harveyi 51,16 kDa, pada vibrio
parahemolitycus 19,13 kDa dan Pada vibrio
anguilarum adalah 57,22 kDa. Ke empat pita
protein adhesin ini diduga merupakan protein
immunogenik dengan adanya aglutinasi positif
pada titer pengenceran 1/8 – 1/512. Murdjani
(2002) telah mendapatkan karakter protein
paling virulen dari isolat extra cellular product
(ECP) vibrio alginoliticus dengan bobot molekul
46,03 kDa. Maftuch, (2006) mendapatkan Outer
Membran Protein (Omp) 42,95 kDa yang
merupakan protein adesin pada sel epitel usus
ikan kerapu tikus. Penelitian yang dilakukan oleh
Qin et al,.(2007) mendapatkan flagellin dan OMP
yang merupakan antigen immunogenik utama
pada V harveyi yang dapat mengakibatkan
kematian pada ikan. Hasilnya bahwa, flagellin
dengan berat molekul 52 kDa bereaksi kuat.
Sedangkan OMP dengan berat molekul 52 kDa
juga menunjukkan hal yang sama.
Gambar 6. Hasil Uji Respon Spesifik Protein
Reseptor Organ Otak Dengan westrn Blott.
Dari hasil pengujian dengan tehnik western
blotting diperoleh molekul protein yang tertransfer
pada membran NC yaitu pada vibrio alginolyticus
(47,98 kDa), vibrio harveyi (51,16 kDa), vibrio
parahemolitycus (19,35 kDa) dan pada vibrio
anguilarum (57,08 kDa). Hal ini berarti bahwa
protein reseptor organ otak mampu mengenali
protein adhesin bakteri vibrio. Molekul adhesin yang
dikenali ini merupakan protein adhesin imunogenik.
Berdasarkan uji hemaglutinasi antara crude
protein vibrio dengan eritrosit ikan kerapu tikus
menunjukan hasil hemaglutinasi positif, Hal ini
berarti bahwa crude protein Vibrio merupakan
protein hemaglutinin yang identik dengan protein
adhesin yang mempunyai kesesuaian untuk
berikatan dengan reseptor pada eritrosit ikan
kerapu tikus. Hemaglutinasi menunjukkan
adanya epitop yang diikat oleh reseptor.Titer
aglutinasi tertinggi ditemukan pada crude protein
vibrio anguilarum, hal ini berarti bahwa crude
protein vibrio anguilarum merupakan molekul
adhesin spesifik yang berikatan kuat dengan
eritrosit ikan kerapu sehingga mampu menunjukan
titer haemaglutinasi tertinggi.
Proses
infeksi
akan
menyebabkan
perubahan ekspresi protein reseptor pada organ
ikan. Organ otak ikan kerapu tikus yang normal
mempunyai molekul reseptor yang diperankan
oleh protein dari superfamili immunoglobulin,
cadherin, integrin dan selectin, yang melekat ke
crude protein ekstraseluler. Protein pada matriks
ekstraseluler sel host dapat berinteraksi secara
langsung (binding) dengan molekul adhesin
bakteri. Adesi bakteri diperankan oleh protein
adhesin yang diketahui sebagai integrin berada
pada permukaan membran dan sitosol, yang
selanjutnya mengadakan kontak dengan protein
reseptor dari inang untuk proses seluler lebih
lanjut yang melibatkan mekanisme signal
tranduksi. Dalam mekanisme bakteri ini akan
melakukan penetrasi ke dalam sel melalui
222
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
sel otak akan akan mengenali protein adhesin
bakteri vibrio untuk proses perlekatan.
Dari hasil pengujian dengan tehnik western
blotting diketahui bahwa protein reseptor organ
otak ikan kerapu tikus mampu mengenali protein
adhesin imunogenik vibrio alginolyticus (47,98 kDa),
vibrio harveyi (51,16 kDa), vibrio parahemolitycus
(19,35 kDa) dan vibrio anguilarum (57,08 kDa). Hal
ini berarti bahwa protein reseptor pada organ otak
memberikan respon terhadap keberadaan antigen,
hal ini dimungkinkan karena organ otak
mempunyai reseptor scavenger, reseptor Ig
FC, TLR dan secretory immunoglobulin yang
mampu mencegah masuknya protein asing
ke dalam membran sel.
Kodama et al., 1985, mengemukakan bahwa
protein hemolysin dan enzim proteolitik
memegang peranan penting dalam patogenitas
vibrio anguillarum. Crosa et al (1977)
mengemukakan tingginya tingkat virulensi strain
vibrio anguillarum karena strain mempunyai
plasmid yang digunakan bakteri sebagai bahan
metabolisme bakteri. Vibrio anguillarum yang
mempunyai plasmid, mampu hidup dan
berkembang karena dapat mengambil zat besi
meskipun
konsentrasinya
rendah
dan
berkompetisi dengan trasferin serta laktoferin
inang Untuk meningkatkan pengambilan zat
besi bakteri Vibrio anguillarum yang memiliki
plasmid membentuk membran protein luar dan
siderophore. Siderophore dilepas keluar sel dan
berfungsi sebagai pengikat ion fe sehingga
menjadi Fe-sidephore. Sedangkan membran
yang letaknya diluar dinding sel berfungsi
sebagai reseptor terhadap kompleks Fesiderophore (Crosa et al., 1980).
Strain V. parahaemolyticus merupakan
penyebab penyakit gastroenteritis. Bakteri V.
parahaemolyticus
ini
menghasilkan
beta
hemolisis pada agar darah yang disebut
Kanagawa–phenomenon
(KP)
yang
berhubungan
dengan
produksi
TDH
(thermostable direct hemolysin). TDH ini akan
menghasilkan
toksin
yang
mengubah
keseimbangan ion sel tubuh. Keberadaan gen
THD
digunakan
sebagai
alat
untuk
mengidentifikasi
patogenitas
bakteri
V.
parahaemolyticus (Boyd et al., 2008).
Berdasarkan hasil dot blot menunjukkan
adanya reaksi pengenalan antibodi dengan
antigen melalui protein reseptor organ otak. Hal
ini berarti bahwa organ otak memiliki
karakteristik molekular sebagai organ reseptor
spesifik yang menjadi portal entry bagi bakteri
vibrio
untuk
melakukan
proses
infeksi
(Perlekatan, kolonisasi dan penyerangan sel
host). Proses infeksi oleh bakteri diawali dengan
perlekatan (adhesi/attachment), selanjutnya
bakteri masuk ke dalam sel inang, dan
melakukan invasi dengan penyebaran lokal atau
sistemik dalam tubuh inang, kemudian bakteri
akan melakukan multiplikasi yang ditandai
dengan kerusakan tubuh inang yang disebabkan
faktor virulensi, selanjutnya bakteri akan
melakukan kolonisasi yang ditandai dengan
penyebaran bakteri secara sistemik dan produksi
toksin. Pada pemaparan bakteri vibrio pada ikan
kerapu, organ otak dapat terinfeksi oleh bakteri
melalui saluran pernafasan atas kemudian
melalui peredaran darah ke epitel olfactorius dan
selanjutnya ke organ otak. Protein reseptor pada
Kesimpulan dan Saran
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
bahwa :
1. Organ otak ikan kerapu tikus yang
terinfeksi bakteri vibrio mengekspresikan
protein reseptor yang mampu mengenali
protein adhesin vibrio alginolyticus (47,98
kDa), vibrio harveyi (51,16 kDa), vibrio
parahemolyticus (19,35 kDa), dan vibrio
anguilarum (57,08 kDa).
2. Protein adhesin yang dikenali oleh protein
reseptor organ otak merupakan protein
adhesin imunogenik yang diduga sebagai
faktor virulensi dalam mekanisme infeksi
yang ditunjukan oleh adanya reaksi positif
antara protein adhesin imunogenik dengan
antibodi (Ig) anti grouper.
Dari hasil penelitian dapat disarankan bahwa
protein adhesin imunogenik vibrio alginolyticus
(47,98 kDa), vibrio harveyi (51,16 kDa), vibrio
parahemolyticus (19,35 kDa), dan vibrio
anguilarum (57,08 kDa) yang dikenali oleh
protein reseptor organ otak dapat digunakan
sebagai
bahan
konstruk
primer
bagi
pengembangan vaksin peptida dalam mengatasi
penyakit vibriosis.
DAFTAR PUSTAKA
Boyd, E. F., A.L Cohen, L. M Naughton, D. W
Ussery, T. T.Binnewies, O C Stine, and M.
A Parent. 2008. Molecular analysis of the
emergence
of
pandemic
Vibrio
parahaemolyticus.
BMC
Microbiology.
8:110
Brooks, G. F., J.S., Butel, and S.A. Morse.,
2001.
Mikrobiologi
Kedokteran.
Penerjemahan : Eddy, M., Kuntaman, Eddy
223
I. Ode / Bimafika, 2011, 3, 216 -224
Bagus, W, Ni Made, M., Setio., Lidawati. A.
Salemba Medika. Jakarta. 528 hal
Crosa .J.H., M.H. Schiewe, and M.H. S. Falkow,
1977. Evidence for plasmid Contribution to
The virulence of the fish pathogen Vibrio
anguillarum. J Infect. Immmunol., 18(3):
509-513
______ J.H.., L.L Hodges, and M.H Schiewe,
1980. Curing of plasmid is correlated with
an attenuation of virulence in the marine
fish pathogen vibrio anguillarum. J Infect.
Immmunol., 27(3): 897-902
Irianto, A., 2005. Patologi ikan teleostei.Gaja
mada University Press. Yogyakarta.
Kodama, H., M. Moustafa, S. Ishigura, T. Mikami,
H. Izawa. 1984. Extracellular virulence
factors of fish Vibrio: relationships between
toxic material, haemolysins and proteolytic
enzyme. Am J Vet Res 45:2203–2207
Koesharyani, I., Mahardika, K., dan Yuasa, K.
2004. Infeksi Viral Nervous Necrosia pada
Benih Ikan Kerapu Bebek, Cromileptes
altivelis, Jurnal Penelitian Perikanan
Indonesia. 10 (2) : 77-81.
Lodish, Berk, Matsudaira, Kaiser, Krieger, Scott,
Zifursky and Darnell. 2001. Molecular Cell
Biology. Fifth Edition.
Maftuch, 2006. Karakterisasi protein hemaglutinin
dan
protein
adhesion
Omp Vibrio
alginolitycus.
Program
Doktor
Ilmu
Kedokteran. Universitas Brawijaya. Malang.
Murdjani, M., 2002. Identifikasi dan Patologi
Bakteri Vibrio alginolyticus pada Ikan
Kerapu Tikus. Disertasi. Program Pasca
Sarjana. Universitas Brawijaya. Malang.
Nurmawaty, T., 2008. Perubahan jumlah sel
neuron dan microglia pada kultur neuron
yang dipapar dengan Lipopolysacharida
(LPS) dan alfa pinen. Thesis program studi
Biomedik.
Kekhususan
farmakologi.
Universitas Brawijaya. Malang.
Price, S.A and
Wilson, L. Mc., 1982.
Pathophysiology Clinical Concepts of
Disease Processes. Second edition. EGC.
Wang, X.H. and Leung K.Y., 2000. Biochemical
characterization of different types of
adherence of Vibrio species to fish epithelial
cells. Department of Biological Science,
Faculty of Science, National University of
Singapore.
224