Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi

Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
ELEKTROFORESIS HASIL ISOLAT DNA GENOM DARI BAKTERI Escherichia coli
DAN DARAH KAMBING PERANAKAN ETAWA
Nikman Azmin1, Erni Suryani2
Dosen Program Studi Pendidikan Biologi, Sekolah Tinggi Keguruan dan Ilmu Pendidikan
(STKIP) Bima, Nusa Tengara Barat, Indonesia
( e-mail: [email protected] )
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan tehnik pemisahan senyawa dengan metode
elektroforesis horizontal gel agarose pada DNA genom dari bakteri Escherichia coli dan
darah kambing peranakan Etawa. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2016 sampai
dengan Agustus 2016. Hasil penelitian menunjukan bahwa Visualisasi GelDoc
elektroforesis isolat DNA genom Eschericia coli dan darah kambing peranakan Etawa
menunjukkan adanya pita-pita DNA yang terbentuk. Dari hasil isolasi DNA genom darah
kambing Etawa dan genom Eschericia coli diperoleh isolasi sebanyak 0,12 ml yang
ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus yang terdapat pada DNA serta faktor-faktor
yang mempengaruhi laju migrasi DNA pada gel elektroforesis antara lain: ukuran dan
muatan DNA, konsentrasi gel agarose, arus listrik dan arah medan listrik.
Kata-Kata Kunci: Isolasi DNA, Escherichia coli, Darah Peranakan Kambing Etawa
PENDAHULUAN
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah DNA
nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan
DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein
histon (Kullkarni, et al, 2011). Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri
khas yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis induk. Hal ini sangat
berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua induk. Di
lihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot.
DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Bruyn, 2011). DNA memiliki
struktur salinan utas ganda yang anti paralel dengan komponen-komponennya yaitu gula
pentosa, gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua
macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G)
yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan
timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin,
maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan
Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen (Lewis, 2003)
Ekstraksi DNA merupakan salah satu cara untuk memisahkan DNA kromososm
atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA dapat berasal dari
tanaman, kultur mikroorganisme, maupun sel manusia. Pada dasarnya isolasi DNA dapat
dilakukan dari berbagai sumber, antara lain adalah organ manusia, darah, daun, daging
buah, serangga, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan. Pada individu yang sama DNA
yang diperoleh dari berbagai sumber yang akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang
sama. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
20
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
metabolisme sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid sehingga menyulitkan
proses isolasi DNA. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah
satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tingkat tinggi adalah proses destruksi dinding sel
untuk melepaskan isi sel, hal ini disebabkan karena tanaman tingkat tinggi memiliki
dinding sel yang kuat dan sering kali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut
sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat
menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan
menggangu proses amplifikasi DNA dengan PCR
Pada penelitian ini akan mecoba melakukan isolasi DNA genom bakteri Escherichia
coli dari darah kambing Etawa. Pada saat proses destruksi jaringan hewan maupun bakteri
dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease,
karena itu digunakanlah buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB
dan buffer lisis yang mengandung potassium asetat dan SDS. Proteinase digunakan untuk
membantu mendenaturasi protein pada jaringan. Senyawa CTAB dan SDS merupakan
detergen yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi protein. Selain itu CTAB
dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuklease.
Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan dengan debris sel dan protein
sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB Potasium asetat protein-debris sel.
Selanjutnya pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol yang membantu
mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk
mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 96%-100%.
METODE
Isolasi DNA genom Bakteri Escherichia coli
Alat
Mikropipet ukuran 200 μl 2 buah, Frezer 1 set, Gelas beker 1 set, Hot plate dan
autoclave 1 set, Stopwatch1 buah, Mikropipet ukuran 1000 μl 2 buah, Tipt ukuran 20 μl 2
buah, Tipt ukuran 200 μl 2 buah, Tipt ukuran 1000 μl 2 buah, Colection tube 1,5 ml 2
buah, Sentrifuge 1 set Vortex 1 set, Incubator shaker 1 set, Gene JETTM genomic DNA
purification column 2 buah
Bahan
Trypton 1% Secukup, Proteinase K 200 μl, Etanol
50% 400 μl,Wash buffer I 500
μl, Wash buffer II 500 μl, Elution buffer 200 μl, Kertas tisu Secukup, Yeast extract 0,5%
Secukup, NaCl 0,5% Secukup, Akuades sebanyak 20 ml
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa
Alat
Mikropipet ukuran 20 μl, Gene JETTM genomic DNA purification column, Freezer,
Gelas beker, Hot plate dan autoclave, Stopwatch, Mikropipet ukuran 200 μl, Mikropipet
ukuran 1000 μl, Tipt ukuran 20 μl, Tipt ukuran 200 μl, Tipt ukuran 1000 μl, Colection tube
1,5 ml, Colection tube 2 ml, Sentrifuge, Vortex, Incubator shaker
Bahan
Darah kambing peranakan Etawa, Lysis solution, Proteinase K, Etanol 96%, Wash
buffer I, sebanyak 500 μl Wash buffer II sebanyak 500 μl, Elution buffer sebanyak 200 μl
Cara Kerja
Isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
21
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
Pembuatan Media. Bahan yang digunakan untuk pemmbuatan media disiapkan, antara
lain: trypton 1%, yeast extract 0,5% dan NaCl 0,5%
1.
2.
3.
4.
5.
Semua bahan dicampur dan ditambahkan 20 ml akuades
Campuran bahan panaskan sambil diaduk agar rata
Campuran bahan disterilisasi
Pada campuran tersebut ditambahkan koloni bakteri Escherichia coli
Koloni bakteri Escherichia coli dalam media dishaker pada suhu 370C
Isolassi DNA genom bakteri Escherichia coli
1. Pembiakan Escherichia coli sebanyak 1,5 ml diambil dan dimasukan ke dalam
collection tube 1,5 ml, kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000
rpm
2. Bagian supernatan dibuang dan ditambahkan 180 μl digestion solution dan 20 μl
proteinase K ke dalam collection tube. Campuran divortex hingga homogen, kemudian
diinkubasi dalam shaker pada suhu 560C selama 30 menit dan 200 μl lisis solution
ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian divortex selama 15 detik dan 400 μl
etanol 50% ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian divortex selama 15 detik
hingga terbentuk lisat (campuran dari semua larutan)
3. Lisat diambil dan dipindahkan ke Gene JETTM genomic DNA purifcation collumn,
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada
di bagian bawah dibuang dan Collum dipindahkan ke collection tube 2 ml
4. 500 ml wash buffer I ditambahkan ke dalam collection tube, kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang,
tetapi tubenya tidak dan 500 μl wash buffer II dipindahkan ke collection tube, kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 3 menit
5. Cairan yang ada di bagian bawah dibuang. Tube disentrifugasi dalam keadaan kosong
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang ada di bagian bawah
dibuang. Kemudian dipindahkan ke collumn 1,5 ml microcentrifuge tube serta 200 μl
collection buffer ditambahkan tepat di bagian tengah membran
6. Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Campuran disentrifugasi
dengan kecepatan 8.000 rpm selama 1 menit. Collumn dibuang, sedangkan isolat
disimpan pada suhu -20oC
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa
1. 200 μl darah kambing peranakan Etawa dimasukkan ke dalam colection tube 1,5 ml.
Kemudian 400 μl lisis solution ditambahkan ke dalam collection tube. Selanjutnya 20 μl
proteinase K ditambahkan ke dalam collection tube
2. Campuran diinkubasi dengan waterbath pada suhu 56oC selama 10 menit. Kemudian
tambahkan 200 μl etanol 96% ditambahkan ke dalam campuran tersebut, kemudian
divortex
3. Lisat dipindahkan ke Gene JETTM genom DNA purification. Lisat disentrifugasi selama
1 menit dengan kecepatan 4.200 rpm (cairan yang ada di bagian bawah dibuang)
4. Collumn dimasukkan kembali. Kemudian tambahkan 500 μl wash buffer I ditambahkan
ke dalamnya, kemudian disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 5.600 rpm
(cairan yang ada di bagian bawah dibuang). Dan tambahkan 500 μl wash buffer II
ditambahkan ke dalamnya (cairan yang ada di bagian bawah dibuang). Selanjutnya,
tube disentrifugasi lagi dalam keadaan kosong (tanpa penambahan larutan) selama 1
menit dengan kecepatan 8.400 rpm
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
22
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
5. Collumn dipindahkan ke collumn 1,5 ml microsentrifuge tube, masukan 200 μl elution
buffer ditambahkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian campuran diinkubasi
selama 2 menit pada suhu ruang
6. Selanjutnya, campuran disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 5.600 rpm.
Larutan yang yang digunakan adalah bagian bawah dan Larutan disimpan pada suhu 20oC
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli
DNA genom yang diisolasi berasal dari bakteri Escherichia coli. DNA genom yang
diisolasi dari Escherichia coli adalah 16S rRNA pada bakteri memiliki bagian yang stabil
dalam sekuens dan satu sel bakteri memiliki ribuan kopi RNA. Gen 16S RNA berupa
polinukleotida berukuran besar (1500-2000 basa) dan merupakan bagian dari sub unit
kecil dari ribososm prokariotik. Bakteri Escherichia coli merupakan salah satu spesies
utama dari bakteri Gram negatif Escherichia coli
Pada proses tahapan-tahapan yang dilakukan dalam isolasi DNA genom bakteri
Gram negatif Escherichia coli, antara lain: bakteri Escherichia coli dibiakkan dalam media
yang mengandung trypton 1%, yeast extract 0,5%, dan NaCl 0,5% (Wayan et al, 2014).
Bahan-bahan tersebut dicampur dan ditambahkan akuades sebanyak 20 ml sebagai pelarut.
Bahan-bahan tersebut didihkan sambil diaduk. Proses pengadukan bertujuan untuk
mempercepat proses pelarutan. Selanjutnya, media disterilisasi agar nantinya hanya
Escherichia coli saja yang tumbuh dalam media. Tahapan berikutnya yaitu media
ditambahkan koloni Escherichia coli dishaker pada suhu 37oC. Bakteri diinkubasi dan
ishaker pada suhu 37oC bertujuan untuk mengoptimalisasikan pertumbuhan koloni bakteri
Escherichia coli. Koloni bakteri dishaker dengan kecepatan 100 rpm selama overnight atau
semalam (Gambar 1)
Dari proses perbanyakan bakteri Escherichia coli akan diperoleh jumlah koloni
bakteri yang mencukupi untuk proses isolasi DNA genom. Selanjutnya, sebanyak 1,5 ml
untuk pembiakan bakteri Escherichia coli dari hasil perbanyakan diambil dan dimasukkan
ke dalam collection tube, kemudian bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm
selama 10 menit. Sentrifugasi awal ini dilakukan bertujuan untuk memisahkan bakteri
dengan pengotor yang berupa senyawa lain yang tercampur dengan bakteri. Supernatan
yang dihasilkan dibuang, sedangkan bagian pellet ditambahkan dengan 100 µl digestion
solution dan 20 µl proteinase K lalu divortex. Larutan digenstion solution berfungsi untuk
melisiskan membrane atau dinding sel sebagai bagian terluar dari bakteri. Priteinase K
digunakan sebagai reagen pelisis agar komponen DNA di dalam sitoplasma sel dapat
keluar untuk diisolasi. Vortex dilakukan untuk mencampur semua komponen agar
homogen, sehingga proses dari tahapan isolasi yang berupa pelisisan dinding sel dan
membran sel dapat berjalan secara optimal.
Tahapan selanjutnya yaitu bahan isolasi yang ada di dalam tube diinkubasi pada
shaker dengan suhu 56oC selama 30 menit. Proses inkubasi pada shaker bertujuan untuk
meningkatkan kerja enzim proteinase K dalam melisiskan protein dalam sel untuk
mengeluarkan DNA. Suhu dalam inkubasi adalah 56 oC karena enzim proteinase K bekerja
spesifik dan optimal pada suhu tersebut (Wayan et al, 2014).
Campuran komponen isolasi DNA (sampel) ditambahkan 400 µl etanol 50% lalu
divortex. Etanol digunakan untuk melarutkan bahan-bahan selain DNA, sehingga saat
disentrifugasi DNA bisa mengendap di bawah. Etanol 50% juga berfungsi untuk menarik
molekul air dari DNA dan membersihkan lysis solution. Vortex dilakukan bertujuan untuk
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
23
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
menghomogenisasi komponen-komponen sehingga proses pelarutan bahan selain DNA
dapat berlangsung secara optimal. Dari proses vortex akan dihasilkan lisat. Lisat
merupakan hasil dari proses lisis. Lisat yang diperoleh dipindahkan ke Gene JETTM
genomic DNA purification column yang merupakan collection tube khusus dimana tube
mempunyai membrane yang digunakan dalam isolasi atau purifikasi DNA. Tube Gene
JETTM mempunyai 2 lapisan dimana 1 lapisan untuk menampung cairan yang jatuh dan
lapisan yang lain untuk menampung DNA. Lisat yang terdapat di dalam Gene JET
disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 1 menit. Sentrifugasi akan menghasilkan
pellet pada lapisan atas dan supernatan yang terkumpul pada lapisan bawah.
Bagian supernatan dibuang, kemudian column dipindahkan ke collection tube 2 ml
dan sampel ditambah dengan 500 µl wash buffer I. Wash buffer I digunakan untuk mencuci
atau membersihkan DNA dari pengotor pada tahapan awal. Selanjutnya, sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit untuk mengoptimalkan
pencucian yang pertama. Bagian supernatant dibuang dan bagian pellet ditambahkan 500
µl wash buffer II lalu disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit.
Penambahan wash buffer II berfungsi untuk membersihkan sisa-sisa dari DNA yang masih
ada setelah proses pencucian yang pertama. Dari hasil pemisahan oleh sentrifugasi,
supernatan (caitran yang ada di bagian bawah) dibuang lalu tube dan column dalam
keadaan kosong disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Proses
sentrifugasi dalam keadaan kosong bertujuan untuk memastikan bahwa tidak ada pengotor
pada DNA yang akan dipakai. Bagian supernatan dibuang dan ditambah collection tube
nya. Sampel dipindahkan ke column 1,5 ml microsentrifuge tube dan ditambah 200 µl
elution buffer tepat di bagian tengah. Elution buffer ditambahkan tepat di bagian tengah
bertujuan untuk mengikat kotoran lain selain DNA, sehingga yang ada pada
microsentrifuge tube hanya DNA saja.
Tahapan berikutnya, sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 2 menit. Hal ini
bertujuan untuk mengoptimalkan proses elution buffer dalam mengikat kotoran. Sampel
disentrifuge dengan kecepatan8000 rpm selama 1 menit. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dari pengotor untuk diperoleh hasil isolate murni dari DNA. Hasil dari
proses isolasi DNA akan diperoleh isolate DNA. Column dibuang dan isolate DNA
disimpan pada suhu -20oC. Penyimpanan isolate pada suhu 20oC bertujuan untuk menjaga
agar sampel isolate DNA tidak mengalami kerusakan.
Hasil isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli diperoleh isolate DNA genom
sebanyak 0,1 ml dan terlihat pita-pita halus DNA genom bakteri Escherichia coli (gambar
1). Hasil isolate DNA yang diperoleh sebanyak 0,12 ml. Hal ini didukung dengan hasil
penelitian yang dilakukan oleh (Beermann et al, 2011), menyetakan bahwa pada isolasi
DNA genom, hal yang dilakukan adalah memisahkan DNA genom dari komponenkomponen yang lainnya. Kemudian DNA genom yang diisolasi dari Escherichia coli
adalah 16S rRNA dan akan mendapatkan isolat bakteri yang sangat bagus
Isolasi DNA genom darah kambing peranakan Etawa
Isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel. Darah
kambing peranakan Etawa digunakan karena lebih mudah diekstraksi, prosedurnya lebih
mudah, lebih murah dan hasil yang didapatkan lebih banyak. Hasil isolasi DNA genom
darah kambing peranakan Etawa menunjukan bahwa pada proses isolat didapatkan isolat
DNA berbentuk cairan bening yang secara kasat mata akan terlihat pita-pita DNA seperti
benang-benang halus . Hasil isolat DNA yang diperoleh sebanyak 0,12 ml
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
24
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
Gambar 1. Hasil Hasil isolat DNA
Dari kedua sampel yang digunakan, keduanya menghasilkan isolate DNA yang
ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus yang ditunjukan pada garis panah 1 sampai 4
pada (Gambar 5) DNA yang dapat dilihat secara kasat mata. Hal ini mengindikasikan
bahwa tahapan isolasi DNA yang dilakukan cukup berhasil. Menurut Zunaedi (2013),
faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan isolasi DNA genom, antara lain:
1. Karakter sampel dari sel atau jaringan organism. Setiap organisme memiliki tipe sel
dan jaringan yang berfariasi, sehingga metode isolasi atau ekstraksi yang digunakan
harus sesuai dengan jenis karakter sampel.
2. Metode ekstraksi dan isolasi yang tepat. Metode yang ideal, akan beragam tergantung
dari jenis sel atau jaringan sampel, bagaimana sampel diperoleh dari sumbernya,
bagaimana sampel diperlakukan, dan bagaimana sampel disimpan sebelum diekstrak
DNA. Hal-hal tersebut akan menetukan keberhasilan isolasi DNA.
3. Metode isolasi harus meminimalisasi degradasi DNA.
Upaya untuk meminimalisasikan degradasi DNA dapat dilakukan dengan cara
menghindari ekspor terhadap panas, cahaya, freeze-thow yang berulang-ulang, dan
vortex.
4. Kondisis laboratorium. Laboratorium harus dikondisikan dan diatur sedemikian rupa
untuk menghindarkan kemungkinan kontaminasi silang pada sampel.
5. Reagen atau senyawa yang digunakan. Dalam 5 tahapan utama isolasi DNA, reagen
memegang peranan penting yang akan menentukan keberhasilan isolasi DNA genom.
Kesesuaian reagen dengan karakter sel DNA genom harus menjadi dasar pertimbangan
dalam memilih metode ektraksi atau isolasi DNA genom.
KESIMPULAN
1. Dari hasil isolasi DNA genom bakteri Escherichia coli diperoleh isolasi sebanyak 0,1
ml yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus DNA.
2. Dari hasil isolasi DNA genom darah kambing Etawa diperoleh isolasi sebanyak 0,12
ml yang ditandai dengan terlihatnya pita-pita halus DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Beermann, A., Ghanjati, Santurludis, S. 2011. Methods for Separate Isolation of Cell Free
DNA and Celluler DNA from Urine-Aplication of Methylation Specific PCR on
both DNA Fraction. The Open Biomarker Journal 4(2): 15-27
Bruyn, M. D.., Darenti, L. R.., Cravalho, G. R. 2011. Succesful Extraction of DNA from
Archieved Alkohol Fixed White-Eye Fish Specimens Using an Ancient DNA
Protocol. Journal of Fish Biology 78 (1): 2074-2079
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
25
Elektroforesis Hasil Isolat DNA ……
Nikman Azmin, dkk
Kullkarni, K. K., Oswal, R. J., Antre, R, V., Panjwani, D. T. 2011. A Biotechnological
Significance: Isolation of DNA from onion. International Journal of Pharma
Research and Development 2(2): 42-45
Wayan, S dan Dyah A,W., Komang J, P,P. 2014. Penentuan Marka Genetik Escherichia
coli O157:H7 Asal Hewan dan Manusia dengan Metode Random Amplified
Polymorphic DNA. Jurnal Veteriner. Vol. 15 No. 3 : 323-329
Zunaedi, P. 2013. Prinsip Manipulasi Gen. Erlangga. Jakarta
Bidang Biologi dan Pembelajaran Biologi
ISBN: 978-602-61335-0-2
26