G:\Muji\ARTIKEL\Agrosains bu am

KEKERABATAN ANTAR ISOLAT MIKORIZA RHIZOCTONIA DARI VANILI
BERDASARKAN ANALISIS PCR-RFLP
Relationship between the Isolates of Rhizoctonia Mycorrhizal from Vanilla
Based on PCR-RFLP Analysis
1
2
2
Haryuni , Bambang Hadisutrisno , Achmadi Priyatmodjo , Jaka Widada
2
ABSTRACT
The
experiment was carried out at the Laboratory of Agricultural Biotecnology, Gadjah Mada University in Yogyakarta and the Research Center of Perum Perhutani Cepu. Object of the experiment was to study on the genetic relationship between the isolates of Rhizoctonia Mycorrhizal from vanilla root based on PCR-RFLP analysis. It was arranged in PCR with pimer of ITS 1 and ITS 4, and RFLP
with restriction enzyme of Hinf I, Hae III, Msp I, and Bsrd I. The results suggested that based on the PCR-RFLP
analysis, isolate of SR-8 had no relationship to isolate of SR-9 and TMG-2 whereas between the latest isolates were
close related.
Key words : Rhizoctonia mycorrhizal, PCR-RFLP, vanilla
PENDAHULUAN
Penurunan harga vanili Indonesia di dalam negeri
terutama karena vanili Indonesia ditolak di pasaran luar
negeri, sehingga buah vanili melimpah. Penolakan ini
terutama disebabkan oleh mutu buah vanili rendah
karena kekeringan, dan penyakit busuk batang
(Hadisutrisno, 2005).
Rhizoctonia spp. yang berperan sebagai mikoriza
ditemukan di anggrekan yaitu Rhizoctonia stahlii, R.
goodyerae-repentis juga pada Goodyerae repens, dan
R. mucoroides, pada Dactylorhiza. Jamur tersebut
membantu perkecambahan biji anggrek (Sneh et al.,
1991). Keberadaan mikoriza dalam tanah membantu
menyediakan unsur hara biji anggrek pada saat proses
perkecambahan, terutama kebutuhan unsur fosfor dan
nitrogen (Taylor et al., 2004).
Rhizoctonia terdiri atas jamur yang mempunyai
simbiosis mutualisme. Pengelompokan dibedakan
berdasarkan pada morfologi koloni, karakteristik
pertumbuhan, dan patogenisitasnya pada tanaman
inang. Anggota Rhizoctonia. berperan sebagai patogen,
saprofit, mikoriza, dan Plant Grwoth Promoting Fungi
(PGPF) (Sneh et al., 1991; Alexopoulus et al., 1996;
1
Andersen & Rasmussen, 1996; Priyatmojo et al., 2001;
Hyakumachi, 2004).
Diferensiasi miselium mikoriza menjadi struktur
infeksi, dan penetrasinya ke tanaman inang dipengaruhi
oleh faktor biotik, dan abiotik. Faktor biotik yang penting
ialah kemampuan tanaman menghasilkan sinyal-sinyal
tertentu sebagai pengenal inang dan tempat infeksi pada
akar. Didukung oleh fakta adanya akar tanaman, eksudat
akar, suspensi kultur sel, dan produk sel (Anonim, 2007;
Nusantara, 2007).
Mikoriza anggrekan membentuk peloton yang
berfungsi mensuplai sumber karbon dan nutrien selama
perkecambahan biji. Anggrek Corallorhiza maculata
mempunyai variasi genetik terhadap berbagai jenis
mikoriza (Taylor et al., 2003).
PCR-RFLP merupakan salah satu metode
identifikasi kelompok jasad hidup yang akurat dan cepat
sehingga lebih mudah diketahui kelompok jasad tersebut.
Identifikasi dan karakterisasi molekuler pada Rhizoctonia
spp. diharapkan membantu mendapatkan fragmenfragmen DNA yang lebih spesifik sehingga dapat
diketahui hubungan kekerabatannya secara akurat.
2
Mahasiswa Doktoral Fitopatologi Fakultas Pertanian UGM Yogyakarta,
Dosen Fakultas Pertanain UTP Surakarta. E-mail: [email protected]
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
34
Agrosains 12(2): 34-38, 2010
BAHAN DAN METODE
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai
dengan bulan Oktober 2009 di Laboratorium Bioteknologi
Pertanian UGM dan Laboratorium Bioteknologi Pusat
Penelitian dan Pengembangan (Puslitbang) Perhutani
Cepu.
1. ITS-RFLP dengan Enzim Hae III dan Bsrd I
Isolat mikoriza Rhizoctonia yang berasal dari
Kelompok peneliti Fakultas Pertanian UGM dengan kode
isolat (SR-8=A, SR-9=B, dan TMG-2=C).
Ekstraksi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan teknik CTAB
(Cetyltrimetyl ammonium bromide). Larutan CTAB
ditambahkan PVP (Poly Vinil Pyrolidone).
Fragmen DNA pada gel agarose 1,5 % diamati
dengan pewarnaan dan dideteksi dengan penyinaran
ultraviolet. Panjang gelombang 260 nm - 280 nm, batas
kemurnian DNA 1,8-2,0 (Anonim, 1999).
Gambar 1: Elektroforesis ITS-RFLP dengan enzim Hae
III ( isolat A,B, dan C) dan enzim Bsrd I ( isolat
A1, B1, dan C1) pada gel agarose 3%, M=Marker
berukuran 1 Kb. Isolat A dan A1= SR-8; B dan
B1= SR-9; C dan C1=TMG-2
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pada tahap ini menguji kemampuan dari primer
ITS 1 (forward): 5'- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3' dan ITS 4 -B (reverse) : 5' -
Enzim Hae III
CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3' (Pharmacia
Biotech, Sweden) untuk mengamplifikasi bagian DNA
ribosomal jamur. Amplifikasi dengan mesin PCR
campuran dengan reaksi total dalam volume 20 ?l,
kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR (Biorad My
50 bp sampai kurang lebih 500 bp dengan jumlah 2
fragmen DNA pada masing - masing isolat (Gambar 1).
Ketiga isolat A, B, dan C tidak terlihat adanya hubungan
kekerabatan dengan pengujian enzim Hae III karena
memiliki pola fragmen DNA yang tidak mirip.
Cycler TM Thermal Cycler), hasil PCR dielektroforesis
menggunakan gel agarose 1,5% dan marker (DNA
Ladder). PCR pada tegangan 100 volt selama 25 menit,
kemudian gel diamati bagian fragmen DNA diatas UV
transluminator.
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction
Fragment Length Polymorphisms)
Hasil amplifikasi DNA dengan ITS 1 dan ITS 4.
Digunakan sebagai cetakan reaksi RFLP dengan enzim
restriksi, yaitu Hinf1, HaeIII, MspI, dan Bsrd I (New
England Rbiolabs, Beverly, MA, USA) (Sen et al., 1999).
Analisis
Hubungan kekerabatan antarisolat Rhizoctonia
didasarkan pada koefisien kesamaan pola fragmen DNA
hasil PCR-RFLP dan dendrogram UPGMA-NTSYS (SPSS
Inc., Chicago, II, USA)
PCR-RFLP dengan enzim Hae III menghasilkan
fragmen DNA pada semua isolat berukuran kurang lebih
Enzim Bsrd I
Elektroforesis hasil RFLP-PCR-ITS dengan
menggunakan enzim Bsrd I menunjukan bahwa restriksi
produk PCR-ITS menghasilkan satu sampai 2 fragmen
DNA pada masing - masing isolat (Gambar 1). Fragmen
DNA yang dihasilkan berukuran kurang lebih 250 bp
sampai kurang lebih 750 bp.
Hasil elektroforesis ditransformasikan sebagai
dasar dendrogram dimana hasil dendrogram
menunjukkan hubungan kekerabatan 80% pada isolat B,
dan C sedangkan isolat A dengan isolat B, dan C berada
pada satu garis lurus (0%) sehingga isolat A tidak ada
hubungan kekerabatan dengan isolat B, dan C dengan
pengujian enzim Bsrd I. Nilai koefisien 80% pada isolat B
memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan isolat
C. Kemampuan enzim Bsrd I mampu membedakan isolat
A dengan isolat B, dan C dimana mampu membedakan
pada tingkat spesies dan forma spesialis.
Kekerabatan Antarisolat Mikoriza Rhizoctonia dari Vanili Berdasarkan
Analisis PCR- RLFP ................................ (Haryuni, et al.)
35
membedakan antara isolat A dengan isolat B, dan C
dimana mampu membedakan pada tingkat spesies dan
2. ITS-RFLP dengan Enzim Msp I dan Hinf I
forma spesialis. Isolat A dengan isolat B, dan C berada
pada satu garis lurus (0%) sehingga dapat diartikan
bahwa isolat A tidak ada hubungan kekerabatan dengan
isolat B, dan C dengan n enzim Msp I
Enzim Hinf I
Hasil dendrogram menunjukkan bahwa isolat A
tidak ada hubungan kekerabatan dengan isolat B dan C,
sedangkan isolat B dan C mempunyai hubungan
kekerabatan 63 %. Fragmen DNA (Gambar 2) berukuran
kurang lebih 100 bp sampai kurang lebih 325 bp.
Gambar 2: Elektroforesis ITS-RFLP dengan enzim Msp
I (isolat A, B, dan C) dan enzim Hinf I ( isolatA, B,
dan C) pada gel agarose 3%, M=Marker
berukuran 1 Kb. Isolat A dan A1= SR-8; B dan
B1= SR-9; C dan C1=TMG-2
Analisis Hubungan Kekerabatan Isolat Rhizoctonia
spp.
Hubungan kekerabatan berdasarkan hasil ITS-
Enzim Msp I
Elektroforesis hasil RFLP-PCR-ITS dengan
menggunakan enzim Msp I menunjukan bahwa restriksi
produk PCR-ITS menghasilkan satu atau 2 fragmen DNA
pada masing - masing isolat (Gambar 2). Fragmen DNA
yang dihasilkan berukuran kurang lebih 50 bp sampai
kurang lebih 740 bp.
Hasil elektroforesis ditransformasikan dan
digunakan sebagai dasar data dendogram dimana hasil
dendogram menunjukkan hubungan kekerabatan 67%
pada isolat B, dan C. Kemampuan enzim Msp I mampu
RFLP. dendrogram gabungan berdasarkan hasil analisa
NTSYS elektroforesis restriksi daerah ITS dengan 4 enzim
Hae III, Bsrd I, Msp I, dan Hinf I dapat dibedakan menjadi
dua kelompok (Gambar 3). Kelompok I yaitu isolat A yang
memiliki koefisien hubungan kekerabatan 10% dengan
isolat B dan C. Kelompok II isolat B, dan C memiliki
koefisien kekerabatan sebesar 63%, sehingga antara
kelompok I dan kelompok II mempunyai hubungan
kekerabatan yang jauh. Nilai koefisien lebih besar dari
95% menunjukkan bahwa isolat tersebut identik,
sedangkan nilai koefisien 63-95% menunjukkan tingkat
kesamaan yang tinggi atau mirip (Kim et al., 2004).
A
B
C
0,41
0,10
0,20
Koefisien
Kesamaan
0,52
0,63
Gambar 3. Dendrogram-UPGMA hubungan kekerabatan tiga isolat mikoriza Rhizoctonia berdasarkan pola fragmen
DNA hasil PCR-RFLP dengan enzim Hae III, Bsrd I, Msp I, dan Hinf I
36
Agrosains 12(2): 34-38, 2010
Nilai koefisien kesamaan menunjukkan hubungan
kelompok yang memiliki karakterisasi struktur genetik
dengan pola fragmen DNA sebagai kontribusi terhadap
evolusi adaptasi, bilogi, biokimia, studi ekologi, dan
diversifikasi genetik (Cai et al., 2006; Wallace, 2006).
Karakterisasi struktur genetik juga telah dilakukan pada
galur Ceratorhiza, Ceratobasidium, Thanatephorus, dan
Tulasnella yang berperan sebagai mikoriza (Taylor, 2008).
Kelompok yang sama menunjukkan hubungan
kekerabatan dalam suatu populasi Rhizoctonia spp. yang
heterogen dari suatu lahan melalui identifikasi dan
pemantauan galur spesifik (Borges et al., 2002). Metode
ini sebagai dasar pengelompokan dan diferensiasi interatau intrakelompok spesies (Toda et al, 1998).
UNGKAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan bagian dari Disertasi dan
didanai oleh Anggaran DIPA UGM Hibah untuk
Mahasiswa Doktor Tahun Anggaran 2009 No. Kontrak:
LPPM-UGM/1107/2009 Tanggal 19 Mei 2009. Ucapan
terima kasih disampaikan juga kepada Pusat Penelitian
dan Pengembangan (Puslitbang) Perhutani Cepu yang
memberikan kesempatan kepada penulis untuk
menambah pengetahuan di Laboratorium Bioteknologi
Puslitbang Perhutani Cepu.
KESIMPULAN
dept/Measure-DNA.htm.. Diakses tanggal 16
Pebruari 2009).
_______, 2007. Mikoriza pada Tanaman Kehutanan.
Ringkasan Materi Workshop Hasil-Hasil
Penelitian dan Pengembangan. Pusat Penelitian
dan Pengembangan Perum Perhutani Cepu,
Desember : 17-19.
Borges AC, EG Barros, EA Gomes, MC Kasuya, 2002.
Polymorphism in the internal transcribed spacer
(ITS) of the ribosomal DNA of 26 isolats of
ectomycorrhizal fungi. Gen Molec. Biol.
25(24):477-483.
Cai L, R Jeewon, KD Hyde. 2006. Phylogenetic investigations of Sordariaceae based on multiple gene
sequences and morphology. Mycolog, Res.
110(2):137-150
Hadisutrisno B. 2005. Budidaya Vanili Tahan Busuk
Batang. Penebar Swadaya. Jakarta. 83 p.
Hyakumachi M. 2004. Plant-growth-promoting fungi
from turfgrass rhizospere with potential for
diasease supressions. Soil Microorganisms 44 :
53-68.
Kim HG, Nagarajan G, Nam M.H, Song JY, Yoo SJ. 2004.
Genetic variation in Fusarium oxysporum f.sp.
fragariae population based on RAPD and rDNA
RFLP analyeses. Plant Pathol J. 20:264-270.
Berdasarkan analisis PCR-RFLP dengn enzim
restriksi Hae III, Bsrd I, Msp I, dan Hinf I, Rhizoctonia
mikoriza isolat SR-8 tidak memiliki hubungan kekerabatan
dengan isolat SR-9 dan TMG-2, sedangkan kedua isolat
Nusantara AD. 2007 Baku mutu inokulum cendawan
mikoriza arbuskula. In: Pros.Kongres Nasional
Mikoriza Indonesia II 2007. Bogor. 11-12 Juli
terakhir berkerabat dekat.
Priyatmojo A, Y Yotani, K Hattori, K Kageyama, M
Hyakumachi. 2001. Charcterization of Rhizoctonia sp. causing root rot and stem rot of miniature rose. Plant Dis. 85: 1200-1205.
DAFTAR PUSTAKA
Alexopoulus CJ, CW Mims, Blackwell. 1996. Introduc-
:1-21 pp.
tory Mycology. 4th ed. John Wiley & Sons, Inc.
New York. 869 p.
Sen R, AM Hietala, C Zelmer. 1999. Common anastomosis and internal transcribed pacer RFLP group-
Andersen TF, HN Rasmussen. 1996. The Mycorrhizal
spesies of Rhizoctonia. 379-390 pp. in: Sneh B,
SJ.Hare, Neate, G Dijst. Eds. Rhizoctonia species : Taxonomy, Moleculer Biology, Ecology,
ing in binukleate Rhizoctonia isolats representing root endophytes of Pinus sylvestris,
Ceratorhiza spp. from orchid mycorrhizal and
a phytophatogenic anastomosis group. New
Phythol. 144:331-341.
Pathology, and Disease Control. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht, The Netherlands.
Anonim. 1999. Measuring DNA Concentration. Universitas Sumatra Utara http://www.msu.ac.th/bio-
Sneh, B., L., Burpee, & A. Ogoshi. 1991. Identification
of Rhizoctonia sp. APS Press.Inc., St. Paul. Minnesota.
Kekerabatan Antarisolat Mikoriza Rhizoctonia dari Vanili Berdasarkan
Analisis PCR- RLFP ................................ (Haryuni, et al.)
37
Taylor.D,L., & T.D.Bruns. 2004. Evidence for mycorrhizal
races in a cheating orchid. Sci. Horticult. 271:
35-43.
Toda T, H Nasu, K Kageyama, M Hyakumachi. 1998.
Genetic identification of web-blight fungus
(Rhizoctonia solani AG 1) obtained from European pear using RFLP of rDNA-ITS and RAPD
anlyses.Res. Bull. Fac. Agric. Gifu Univ. 63: 1-9
38
Wallace LE. 2006. Spatial genetic structure and frequency of interspecific hybridization in
Platanthera aquilonis and P. dilatata
(Orchidaceae) occurring in sympatry. American
J. Botany. ;93:1001-1009.
Agrosains 12(2): 34-38, 2010