2.2 Penggunaan A. tumefaciens untuk memodifikasi sel tanaman

MANIPULASI GEN PADA TUMBUHAN
# Lab. FKM – JBUB, Desember 2015 #
Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi para ilmuwan semakin tertantang
untuk memahami bagaimana gen dapat diubah dan ditransfer dari satu organisme ke organisme
lain. Setelah mempelajari dan mengetahui manipulasi gen tanaman diharapkan :
1) dapat memahami perkembangan modifikasi genetik pada organisme khususnya
bagaimana transfer gen pada tumbuhan dapat terjadi.
2) mengetahui potensi manfaat/keuntungan yang dapat diperoleh dengan melakukan transfer
gen
Modifikasi genetik tanaman diawali dengan introduksi karakter toleran herbisida dan tahan
serangan insekta. Selanjutnya sifat-sifat lain menjadi menarik untuk diintroduksikan pada skala
komersial, seperti sifat tahan terhadap infeksi fungi, bakteri dan virus; toleran stress (contoh
kadar garam tinggi pada tanah), perubahan pigmen bunga dan modifikasi kandungan nutrisi
tanaman. Proses transformasi gen pada tanaman sangat dibantu oleh bakteri tanah yaitu
Agrobacterium tumefaciens.
2.1 Penyakit crown gall : rekayasa genetik secara alami
Agrobacterium tumefaciens menyebabkan penyakit crown gall pada banyak tanaman dikotil.
Infeksi umumnya terjadi pada bagian tanaman yang mengalami pelukaan. Nama penyakit ini
didasarkan pada terbentuknya gall di batang, cabang atau akar yang membengkak seperti tumor.
Selama proses infeksi bakteri mentransfer sebagian DNAnya ke dalam sel-sel tanaman. DNA
terintegrasi ke dalam genom tanaman dan menyebabkan produksi gall serta perubahan
metabolisme sel. A. tumefciens dapat dimodifikasi membawa gen asing yang akan disisipkan ke
sel tanaman.
Proses infeksi alami adalah sebagai berikut:
Sebagian besar gen yang terlibat dalam penyakit crown gall tidak muncul pada kromosom A
tumefaciens tetapi terdapat pada plasmidnya, yaitu Ti (tumour-inducing) plasmid. Plasmid ini
adalah DNA berbentuk lingkaran, berukuran besar (200 – 800 kb) yang terpisah dari
kromosom, mampu bereplikasi di sel secara independen dan dapat ditransfer dari satu bakteri ke
yang lain. Selama proses infeksi berlangsung, sebagian kecil (12-24 kb) daerah Ti yang
dinamakan transfer DNA (T-DNA) ditransfer ke kromosom tanaman inang. T-DNA
mengandung gen yang mengkode pembentukan gall dan sintesis opine (Gambar 3 dan 4).
Gambar 3. Transformasi genetik tumbuhan oleh A. tumefaciens. A. tumefaciens memiliki satu (1)
tumour-inducing (Ti) plasmid, yang mengandung kedua gen virulen (vir) dan satu region (daerah)
transfer-DNA (T-DNA). Bakteri menempel pada sel tumbuhan, T-DNA dan protein-protein Vir ditransfer
ke tumbuhan melalui sebuah transport channel. Di dalam sel tumbuhan, protein-protein Vir mendorong
terjadinya integrasi T-DNA ke dalam genom tumbuhan.
Opine adalah asam amino yang disintesis tanaman di dalam crown gall dan berperan sebagai
sumber C (kadang sumber N) bagi A. tumefaciens tetapi tidak dapat dimanfatkan oleh tumbuhan
itu sendiri. Dalam hal ini, bakteri menggunakan perangkat biokimia sel tumbuhan untuk
menghasilkan sumber makanan yang hanya dapat dimanfaatkan sendiri oleh bakteri. Selain itu
terdapat gen yang mengkode enzim katabolisme opine (Gambar 4) yang juga terdapat di Tiplasmid tetapi di luar daerah T-DNA. Gen yang bertanggungjawab mentransfer T-DNA ke
dalam tanaman inang juga berada di luar region T-DNA. Gen-gen ini terdapat pada virulence
region dan mengkode protein yang memfasilitasi transfer T-DNA dan integrasinya ke dalam
genom sel tanaman.
Gambar 4. Perbesaran skema Ti plasmid. Daerah T-DNA memiliki batas kanan-kiri dan mengandung
gen-gen yang menghasilkan tumor dan opin. Sebelah luar T-DNA adalah daerah virulen. Ini merupakan
cluster gen-gen pengkode protein yang memfasilitasi transfer T-DNA ke tumbuhan inang. Daerah origin
of DNA replication (ORI) adalah sekuens spesifik pada A. tumefaciens tempat penggandaan DNA plasmid
digandakan dalam bakteri.
2.2 Penggunaan A. tumefaciens untuk memodifikasi sel tanaman secara genetik
Rekaya genetik menunjukkan bahwa selama proses infeksi bagian DNA dari Ti plasmid A.
tumefaciens diintegrasikan ke genom tumbuhan. Ti plasmids dapat diisolasi dan bila gen asing
disisipkan pada posisi yang tepat maka transfer gen baru ke dalam tanaman dapat terjadi.
Latihan (1) : Pada Gambar 4, tiga posisi pada Ti plasmid ditandai dengan huruf A, B dan C.
Mana yang menjadi tempat paling baik untuk menginsersikan gen asing?
Prinsip penggunaan Ti plasmid sebagai vektor proses transformasi pada tumbuhan adalah
bahwa gen apapun yang berada pada sekuen antara border kiri dan kanan (i.e. di antara daerah TDNA, Gambar 4) akan ditransfer ke dalam sel tumbuhan yang terinfeksi. Karena ukuran Ti
plasmid cukup besar maka sulit dimanipulasi. Prosedur khusus yang disebut sistem vektor biner
dirancang agar dapat menggunakan Ti plasmid artifisial yang berukuran lebih kecil.
Pada Ti plasmid artifisial (Gambar 5a) daerah T-DNAnya (di antara border kanan dan kiri)
mengandung dua gen, yaitu gen yang akan ditransfer dan gen penanda untuk seleksi tanaman
(seperti gen resistensi terhadap antibiotik kanamisin). Kanamisin yang disisipkan membantu
mendeteksi apakah sel tumbuhan sudah tersisipi gen asing.
The commonly accepted definition of an antibiotic is that it is a chemical which kills or inhibits
the growth of bacteria. You are probably familiar with the use of antibiotics to treat bacterial
infections. A more precise definition would be that antibiotics are substances produced naturally
by various organisms (usually bacteria, fungi or plants) in order to limit the growth of, or kill
other organisms. The organisms affected are usually, but not always, bacteria. Some antibiotics,
like kanamycin, are toxic to plant cells; other antibiotics, like streptomycin are not. In fact
streptomycin is used to minimise losses from certain bacterial diseases of apples and pears.
Gambar 5. Produksi tanaman transgenik menggunakan A. tumefaciens. (a) Ti plasmid artifisial. Daerah
T-DNA yang mengandung gen asing dan gen penanda seleksi tanaman akan ditransfer ke dalam sel
tumbuhan. (b) Ti plasmid artifisial dibentuk dalam E. coli, dan ditransfer ke A. tumefaciens yang
mengandung vektor helper. Plasmid ini mengandung daerah vir yang mengkode protein untuk
memfasilitasi transfer DNA dari bakteri ke sel tanaman. (c) Potongan T-DNA dari A. tumefaciens yang
sudah dimodifikasi ditransfer ke dalam genom sel tumbuhan.
Hal yang penting adalah Ti plasmid artifisial mengandung origins of replication sehingga dapat
digandakan di dalam A. tumefaciens maupun E. coli. Sebagian besar manipulasi yang dibutuhkan
untuk memodifikasi Ti plasmid terjadi di E. coli (Gambar 5).
Latihan (2) :Ciri-ciri apa saja yang dimiliki Ti plasmid normal (Gambar4) tetapi menjadi hilang
pada Ti plasmid artifisial (Gambar 5a)?
Latihan (3) : Ciri-ciri apa saja yang esensial untuk mentransfer dan mengintegrasikan gen-gen ke
daerah T-DNA ?
Bila Ti plasmid artifisial sudah tersedia, selanjutnya dibutuhkan teknik yang dapat membawa
daerah virulen di A. tumefaciens. Sistem vektor biner memberikan solusi dalam menyisipkan
virulence region (vir) di plasmid kedua ini yaitu dengan menggunakan disarmed Ti plasmid
(Gambar 5b) karena seluruh T-region telah dihilangkan. Sistem vektor ini sering disebut helper
vector. Ti plasmid artificial ditransfer dari E. coli ke A. tumefaciens yang mengandung helper
vector (Gambar 5b) melalui proses conjugation – istilah ini digunkan untuk menggambarkan
bahwa transfer materi genetik dari satu bakteri ke lainnya terjadi secara langsung. A. tumefaciens
yang telah mengandung Ti plasmid artifisial dan helper vector kemudian digunakan untuk
menginfeksi sel-sel tumbuhan target. Selama infeksi gen virulen diaktifkan dan DNA yang
berada di antara border kanan – kiri Ti plasmid artifisial ditranfer ke kromosom tumbuhan
(Gambar 5).
2.3 Dari sel terinfeksi ke tanaman transgenik
Berbeda denga proses infek si secara alami, dimana hanya sel-sel pada bagian crown gall saja
yang dipengaruhi oleh T-DNA yang disisipkan, para ilmuwan menginginkan dapat mensisipkan
gen baru ke dalam semua sel-sel tumbuhan. Hal ini didukung oleh sifat totipoten yang dimiliki
sebagian besar sel-sel tumbuhan Fortunately, most plant cells are totipotent, yang artinya bahwa
sel apapun dan dari bagian tumbuhan manapun mampu membelah menjadi sel-sel yang dapat
membentuk jaringan tumbuhan. Hal ini berarti bahwa dengan menggunakan hormon
pertumbuhan yang sesuai dan teknik kultur jaringan maka sel tunggal tumbuhan yang terinfeksi
dapat diinduksi untuk membelah dan membentuk tanaman utuh baru yang fertil.
Agar menghasilkan tumbuhan yang secara genetik dimodifikasi, , A. tumefaciens carrying the
artificial Ti plasmid dan helper vector diinkubasi bersama potongan tumbuhan (eksplan) selama
48 jam. Jenis eksplan dapat berupa potongan daun, kotiledon atau akar yang memiliki
permukaan bekas potongan dan sel-sel yang terluka merupakan tenpat DNA ditransfer dari A.
tumefaciens. Eksplan kemudian diletakkan di medium kultur yang mengandung nutrisi,
kanamisin dan regulator pertumbuhan untuk menstimulir pembelahan sel-sel dan selanjutnya
menghasilkan tanaman baru.
Latihan (4) : Apa tujuan penggunaan kanamisin?
Ingat, bahwa sel –sel tanaman yang dimodifikasi secara genetik mengandung gen resisten
kanamisin dari gen penan da seleksi tanaman yang ditambahkan/disisipkan (Sub 2.2 Gambar 5a).
Hal ini berarti bahwa sel-sel tumbuhan tersebut dapat menghasilkan enzim yang membreakdown senyawa2 toksik, kecuali kanamisin. Sel-sel yang tidak tertransformasi tidak
menghasilkan enzim tersebut sehingga akan mati.
Jaringan baru akan berkembang pada sisi perlukaan eksplan. Tunas baru yang berkembang dari
jaringan ini dipisahkan dari jaringan eksplan dan dilakukan induksi akar. Selanjutnya, planlet
yang tumbuh perlu diuji terhadap fenotip yang sesuai. Jika hasilnya positif maka planlet akan
berkembang menjadi tumbuhan dewasa. Tanaman hasil modifikasi yang pertama kali dihasilkan
disilangkan dengan varietas yang berproduksi tinggi enggunakan metode persilangan
konvensional. Anakannya disilangkan beberapa kali dengan varietas yang sudah stabil sampai
tanaman yang menunjukkan karakter transgenik benar-benar diperoleh.
Jawaban Latihan (1) :
Posisi A menunjukkan bahwa walaupun gen di daerah ini memfasilitasi transfer gen tetapi gen
pada posisi A itu sendiri tidak ditransfer. Posisi B tidak mungkin terlibat karena bagian plasmid
ini tidak ditrasnfer selama proses infeksi. Pada posisi C hanya T-DNA yang diintegrasikan ke
dalam genom tanaman, sehingga gen akan disisipkan pada suatu tempat di daerah ini.
Jawab (Latihan 2) :
Gen penghasil tumor, daerah virulen dan gen-gen pengkode sintesis opin dan katabolisme.
Jawaban Latihan (3):
Only the virulence region is necessary. The tumour-producing genes and the genes related to
opine synthesis and catabolism are not required. We do not want the modified plants to produce
galls, or for the transgenic plants to synthesise opines – it would utilise valuable resources.
Jawab Latihan (4) : Kanamisin digunakan secara selektif untuk membunuh sel-sel tanaman yang
belum tertansformasi.
Sumber : Gene Manipulation in Plants (http://www.open.edu/openlearn/science-mathstechnology/science/biology/gene-manipulation-plants/content-section-0)