Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif Transgenik Padi Gen

Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif Transgenik
Padi Gen CryIA Generasi T0, T1, T2, dan T3
Tri J. Santoso, Aniversari Apriana, A. Dinar Ambarwati, Iswari S. Dewi, dan
Ida H. Somantri
Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian
ABSTRAK
Analisis molekuler pada tanaman transgenik merupakan analisis yang dilakukan pada
tingkat gen maupun ekspresinya. Usaha tersebut salah satunya bertujuan untuk
mengkonfirmasi integrasi gen yang diintroduksi. Identifikasi dari jaringan tanaman
yang tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik di antaranya adalah
penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Pada penelitian tahun 2002
dilakukan analisis PCR lanjutan untuk mengidentifikasi keberadaan gen cryIAb pada
tanaman putatif transgenik cv. Taipei-309. Analisis dilakukan pada 44 tanaman putatif
transgenik generasi T0 (PCR VI dan VIII) dan 21 tanaman generasi T1, T2, dan T3
(PCR VII). Hasil analisis menunjukkan bahwa pada PCR VI tidak ada tanaman yang
mengandung gen cryIAb semen-tara pada PCR VII diperoleh 3 tanaman yang
mengandung gen cryIAb. Pada amplifikasi PCR VII diperoleh 10 tanaman (2 generasi
T1, 7 generasi T2, dan 1 generasi T3) cv. Taipei-309 yang positif mengandung gen
cryIAb. Kesepuluh tanaman tersebut pada bioasai menunjukkan reaksi agak tahan
sampai sangat tahan terhadap hama penggerek batang.
Kata kunci: Padi (Oryza sativa), gen cryIA, Polymerase Chain Reaction (PCR)
ABSTRACT
Molecular analysis of transgenic plants is to identify the transgene and its expression.
The experiment reported here is intended to confirm the integrity of cryIAb gene. The
identification of the transgene can be carried out through a number of molecular
techniques. One of the techniques is Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis. In
2002, the continuation of PCR analysis was conducted in the putative transgenic rice
cv. Taipei-309. The PCR analysis VI and VIII were conducted for 44 plants (T0)
generation while the PCR analysis VII was conducted for 21 plants (T1, T2, and T3
generation). The result showed that PCR VI did not identify and plants carrying cryIAb
gene while PCR VIII found 3 plants containing the transgene. On the other hand, PCR
VII identify 10 plants that contained the transgene and showed moderate to extremely
high levels of resistance to stem borer.
Key words: Rice (Oryza sativa), cryIAb gene, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PENDAHULUAN
Kehilangan hasil padi yang nyata tiap tahun disebabkan oleh faktor biotik
dan abiotik. Salah satu kendala biotik utama dalam budi daya padi dan pengembangan varietas unggul selain hama wereng coklat (Hanarida dan Soewito, 1993)
adalah hama penggerek batang. Perakitan varietas unggul yang tahan merupakan
pilihan yang murah dan aman untuk pengendalian hama tersebut. Teknik pemuliaan konvensional masih menghadapi kendala untuk usaha tersebut karena belum
ada varietas padi dengan tingkat ketahanan yang cukup untuk dikembangkan atau
disilangkan. Pendekatan bioteknologi atau rekayasa genetik seperti teknik
152
Santoso et al.: Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif
transfor-masi dapat dikembangkan untuk membantu program pemuliaan
konvensional.
Rekayasa genetik akan memberikan perbaikan dari karakter-karakter penting seperti sifat ketahanan tanaman terhadap serangga (Bennet, 1993). Teknologi
transformasi juga akan memberikan wahana bagi pemulia tanaman untuk memperoleh gen atau kelompok gen baru yang lebih luas. Suatu gen yang tidak terdapat
pada suatu spesies tanaman tertentu dimungkinkan untuk dapat diperoleh dari
organisme lain seperti bakteri, virus, binatang, dan tanaman lain (Herman, 1996).
Bacillus thuringiensis (Bt) diketahui menghasilkan suatu kristal protein
yang bersifat toksin terhadap hama. Bt toksin yang dikode oleh gen cryIA(b) telah
ter-bukti efektif terhadap hama dari golongan lepidoptera, sehingga dapat
digunakan untuk mengendalikan hama penggerek batang. Peneliti Maqbool et al.
(1998) menggunakan gen cry2A untuk merakit tanaman padi transgenik tahan
hama penggerek batang kuning dan hama penggulung daun padi. Introduksi gen
cryIAb dalam genom padi merupakan alternatif untuk membentuk varietas padi
tahan hama penggerek batang.
Teknik transformasi di dalam usaha memperoleh tanaman padi transgenik
telah dilakukan dengan menggunakan beberapa metode yang ada, seperti melalui
vektor Agrobacterium tumefaciens (Hiei et al., 1994; Abedinia et al., 1997; Khanna
dan Raina, 1999) atau dengan penembakan partikel (Sudhakar et al., 1998;
Maqbool et al., 1998; Hanarida et al., 1998).
Untuk menghasilkan tanaman transgenik melibatkan beberapa tahap dalam
teknik biologi molekuler atau seluler, salah satunya adalah tahap karakterisasi
atau identifikasi gen yang telah diintroduksi ke dalam jaringan tanaman (Bennet,
1993). Keberhasilan teknik transformasi ditandai dengan keberhasilan
menyisipkan rang-kaian gen yang diintroduksi ke dalam genom tanaman, dapat
diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel
berikutnya. Oleh karena itu, diperlukan usaha untuk mengkonfirmasi integrasi gen
yang diintroduksi dan menentukan jumlah kopinya di dalam genom tanaman, serta
menentukan apakah gen tersebut dapat berfungsi dengan benar atau salah.
Analisis molekuler pada tanaman transgenik merupakan analisis yang dilakukan pada tingkat gen maupun ekspresinya. Identifikasi gen dari jaringan tanaman yang tertransformasi dapat dilakukan dengan sejumlah teknik di antaranya
adalah penggunaan teknik Polymerase Chain Reaction/PCR (Chee et al., 1991).
Teknik PCR merupakan teknik deteksi transgen yang memungkinkan analisis
sam-pel dalam jumlah yang relatif banyak tetapi memerlukan waktu yang singkat.
Kelemahan dari teknik ini adalah tidak dapat digunakan untuk mengetahui
jumlah kopi dari transgen yang diintroduksikan dan juga tidak dapat membedakan
integra-si ekstra-kromosomal dan kromosomal pada generasi T0.
Pada penelitian ini dilakukan analisis PCR lanjutan (PCR VII) untuk mengkonfirmasi keberadaan gen cryIAb pada tanaman padi putatif transgenik generasi
lanjutan.
Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman
153
BAHAN DAN METODE
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Penelitian
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (Balitbiogen) dan dilaksanakan
pada Januari-November 2002.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman padi generasi
T0 (44 tanaman), T1 (4 tanaman), T2 (13 tanaman) dan T3 (4 tanaman) putatif
transgenik cv. Taipei-309 hasil transformasi menggunakan penembakan partikel
dengan plasmid pUBB yang mengandung gen cryIAb.
DNA total genomik diekstraksi dari tanaman padi kontrol dan transgenik
mengikuti prosedur dari Dellaporta et al. (1983) yang dimodifikasi.
Pengujian PCR dilakukan dengan total volume reaksi 25 µl mengandung 100
ng DNA genomik sebagai cetakan, 10 µM masing-masing dNTPs, 1unit enzim Taq
DNA Polimerase dalam larutan bufer dan 0,2 µM masing-masing dari 2 primer
spesifik untuk gen cryIA(b). Sintesis urutan basa dari primer-primer tersebut
adalah 5’-CGA CAT CTC CTT GTC CTT GAC AC-3’ dan 5’-ACA CCC TGA CCT
AGT TGA GCA AC-3’. Reaksi amplifikasi dilakukan berdasarkan metode Wang et
al. (1993) yang dimodifikasi dengan menggunakan mesin PCR MJ Research PCT100. Program PCR terdiri dari inkubasi awal pada suhu 94oC selama 5 menit
dilanjutkan dengan 35 siklus pada 94oC selama 1 menit, 45oC selama 1 menit dan
72oC selama 2 menit. Siklus terakhir untuk pemanjangan akhir pada 72oC selama 5
menit. Sebanyak 10 µl produk PCR digunakan untuk elektrophoresis pada 1% gel
agarose.
Pada penelitian ini dilakukan tiga kali PCR (PCR VI, VII, dan VIII) sesuai
ke-tersediaan sampel saat dilakukan analisis PCR tersebut. PCR VI dilakukan
pada 12 tanaman putatif transgenik padi cv. Taipei-309 generasi T0. PCR VII
dilakukan pada 4 tanaman T1, 13 tanaman T2, dan 4 tanaman T3 putatif
transgenik padi cv. Taipei-309. PCR VIII dilakukan pada 32 tanaman putatif
transgenik padi cv. Taipei-309 generasi T0.
Hasil-hasil analisis PCR tersebut kemudian dibandingkan dengan data bioasai yang dilakukan oleh Dewi et al. (2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis PCR merupakan metode deteksi secara cepat untuk mengetahui
keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman transgenik putatif. Dalam metode
ini, dua primer nukleotida spesifik digunakan untuk mengamplifikasi daerah spesifik dari gen cryIAb. Fragmen DNA yang dihasilkan dari amplifikasi gen tersebut
akan mempunyai ukuran 1000 pasangan basa (1 Kb). Hasil analisis PCR pada penelitian tahun-tahun sebelumnya disajikan pada Tabel 1 (Ambarwati et al., 2001).
Analisis PCR VI dilakukan pada 12 sampel tanaman padi generasi T0. Hasil
analisis menunjukkan bahwa dari 12 sampel tersebut tidak ada yang mengandung
gen cryIAb. Dengan hasil ini, tanaman-tanaman tersebut tidak digunakan untuk
pengujian berikutnya.
154
Santoso et al.: Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif
Tabel 1. Pengujian keberadaan gen cryIAb pada putatif transgenik padi cv. T-309
Analisis
Jumlah sampel
Generasi
Tahun
PCR I
PCR II
PCR III
PCR IV
PCR V
24
14
19
9
29
T1
T1
T1
T0
T0
2000
2000
2001
2001
2001
Hasil
Southern Blot
6(+)
10(+)
Tidak ada yang (+) DNA rusak
Tidak ada yang (+)
11 (+)
Telah dilakukan
Belum dilakukan
Tidak dilakukan
Tidak dilakukan
Belum dilakukan
Untuk mengetahui kestabilan keberadaan gen cryIAb dari generasi ke generasi maka pada kegiatan analisis PCR VII dilakukan pengujian tanaman generasi
ke T1, T2, dan T3. Berbeda dengan penelitian sebelumnya, kegiatan pengujian PCR
pada tahun ini diarahkan pada tanaman yang telah menunjukkan kategori tahan
atau sangat tahan terhadap hama penggerek batang pada tahap pengujian bioasai
yang dilakukan oleh Dewi et al. (2002). Hal ini dimaksudkan untuk menyeleksi tanaman yang mempunyai kategori tahan atau sangat tahan terhadap hama penggerek batang pada bioasai juga menunjukkan hasil positif pada analisis PCR.
Dengan demikian, sifat ketahanan dari tanaman yang diperoleh pada kegiatan
bioasai diharapkan merupakan hasil ekspresi gen cryIAb yang telah terintroduksi.
Dari 90 tanaman yang dibioasai pada tahun 2002 diperoleh 21 tanaman yang
menunjukkan kategori tahan dan sangat tahan. Dua puluh satu tanaman tersebut
kemudian dianalisis PCR (PCR VII) untuk melihat keberadaan transgen. Hasil
anali-sis PCR ditampilkan pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat bahwa 10
sam-pel, yaitu No. 5, 11, 13, 23, 28, 51, 53, 58, 60, dan 81 positif mengandung gen
cryIAb.
Hasil uji PCR dan bioasai disajikan pada Tabel 2. Dari tabel tersebut terlihat
bahwa 10 tanaman yang menunjukkan kategori tahan atau sangat tahan pada
bioasai, juga menunjukkan hasil PCR yang positif. Tanaman tersebut adalah 5H-51, 5H-7, B5-2, B5-2B, B5-4, B5-5, B24-2, B24-3B, B24-6, dan A2-1B. Dengan
demikian, dapat diduga bahwa sifat ketahanan pada tanaman padi transgenik
putatif tersebut berasal dari ekspresi gen cryIAb yang berhasil terintegrasi ke
dalam genom tanam-an tersebut. Sedangkan tanaman padi lain yang juga
termasuk kategori tahan atau sangat tahan tetapi tidak positif pada analisis PCR
mungkin disebabkan ada faktor lain yang perlu penelitian lebih lanjut.
Pada analisis PCR VIII yang dilakukan pada 32 tanaman transgenik putatif
generasi T0 diperoleh 3 tanaman mengandung gen cryIAb (Gambar 2). Tanaman
yang mengandung gen cryIAb tersebut adalah tanaman dengan nomor 88, 89, dan
95. Dengan demikian, tanaman tersebut akan dilanjutkan untuk pengujian
berikut-nya.
Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman
155
M
2
5
6 11 13 15 17 23 28 49 51 53 54 58 59 60
+
M 68 69 78 81 84 - A
+
1000 bp
M = 1 Kb ladder, + = kontrol positif, - = kontrol negatif, A = air
Gambar 1. Hasil analisis PCR VII pada tanaman putatif transgenik padi cv. T-309
Tabel 2. Hasil analisis PCR VII dan bioasai tanaman putatif transgenik padi cv. T-309
Asal tanaman
Generasi
T-5B
T-5H
T1
B5
T2
B24
A1
A2
5B-2
5H-5-1
5H-5-1B
5H-7
B5-2
B5-2B
B5-4
B5-5
B24-2
B24-3
B24-3B
B24-4
B24-4
B24-4B
B24-5
B24-6
B24-7
A1-3B
A2-1B
A2-5
A3-7
Nomor DNA
2
78
28
11
51
5
13
58
59
53
23
15
69
84
68
60
49
54
81
6
17
Ketahanan pada fase
Sundep
Beluk
T
T
T
AT
ST
ST
T
ST
ST
ST
ST
ST
ST
ST
ST
ST
AP
T
AT
AT
AT
ST
ST
ST
ST
AT
AT
T
ST
ST
ST
ST
ST
ST
ST
ST
AT
ST
ST
ST
AP
T
Hasil PCR
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
M
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
+
M
103
104
105
106
109
110
111
113
115
116
117
118
119
120
A
+
A3
T3
Nomor tanaman
2,0 kb
1,5 kb
0,6 kb
M = 100 bp ladder, + = kontrol positif, - = kontrol negatif, A = air
Gambar 2. Hasil analisis PCR VIII tanaman putatif transgenik padi cv. T-309
156
Santoso et al.: Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif
KESIMPULAN
Pada penelitian tahun 2002 telah dilakukan identifikasi gen cryIAb menggunakan amplifikasi PCR sebanyak 12 tanaman padi hasil transformasi cv. T-309
generasi T0 dan 21 tanaman generasi T1, T2, dan T3 (tanaman terpilih dari hasil
bioasai). Hasil analisis PCR VI (12 tanaman T0) tidak menunjukkan tanaman yang
positif mengandung gen cryIAb. Pada analisis PCR VII diperoleh 10 tanaman yang
positif mengandung gen cryIAb dari 21 tanaman T1, T2, dan T3. Kesepuluh tanaman tersebut pada kegiatan bioasai mempunyai kategori agak tahan sampai sangat
tahan. Hasil analisis PCR VIII pada 32 tanaman transgenik putatif T0
menunjukkan 3 tanaman mengandung gen cryIAb.
DAFTAR PUSTAKA
Ambarwati, A.D., I. Hanarida, T.J. Santoso, I.S. Dewi, dan A. Apriana. 2001.
Perakitan tanaman pangan transgenik tahan hama dan penyakit tumbuhan.
Laporan Hasil Penelitian TA 2001.
Abedinia, M., R.J. Henry, A.B. Blakeney, and L. Lewin. 1997. An efficient
transformation system for the Australian rice cultivar, Jarrah. Australian
Journal Plant Physiology 24:133-141.
Bennet, J. 1993. Genes for crop improvements. Genetic Engineering 16:93-113.
Chee, P.P., R.F. Drong, and J.L. Slightom. 1991. Using polymerase chain reaction
to identify transgenic plants. Plant Mol. Biol. Manual C3:1-28.
Dellaporta, S.T., J. Wood, and J.B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation:
Versi II. Plant Mol. Biol. Rep. 14:19-21.
Dewi I.S., T.J. Santoso, I. Hanarida, D. Damayanti, dan A. Apriana. 2002. Bioasai
lanjutan tanaman putatif transgenik padi cryIA generasi T1, T2, dan T3.
Laporan Hasil Penelitian, ROPP No. 3. TA 2002.
Hanarida, I. dan T. Soewito. 1993. Peningkatan ketahanan varietas padi terhadap
wereng coklat (Nilaparvata ligens Stal.). Buletin Penelitian 6:1-24.
Hanarida, I., A.D. Ambarwati, T.J. Santoso, I.S. Dewi, A. Apriana, dan D.
Damayanti. 1998. Evaluasi tanaman padi transgenik tahan hama penggerek
batang. Laporan Hasil Penelitian TA 1999/2000. 81 hlm.
Herman, M. 1996. Rekayasa genetika untuk perbaikan tanaman. Buletin Agrobio
1(1):24-34.
Hiei, Y., S. Ohta, T. Komari, and T. Kumashiro. 1994. Efficient transformation of
rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6(2):271-282.
Khanna, H.K. and S.K. Raina. 1999. Agrobacterium-mediated transformation of
indica rice cultivars using binary and superbinary vectors. Australia Journal
Plant Physiology 26:311-324.
Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman
157
Maqbool, S.B., T. Husnain, S. Riazuddin, L. Masson, and P. Christou. 1998.
Effective control of yellow stem borer and rice leaf folder in transgenic rice
indica varieties Basmati 370 and M7 using the novel δ-endotoxin cry2A Bacillus
thuringiensis gene. Molecular Breeding 00:1-7.
Sudhakar, D.G., L.T. Duc, B.B. Bong, P. Tinjuangjun, S.B. Maqbool, M. Valdez, R.
Jefferson, and P. Christou. 1998. An efficient rice transformation system
utilizing mature seed-derived explants and a portable, inexpensive particle
bombardment device. Transgenic Research 7:1-6.
158
Santoso et al.: Analisis Molekuler Lanjutan Tanaman Putatif