1 PENGARUH EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera) TERHADAP

PENGARUH EKSTRAK BIJI ANGGUR (Vitis vinifera)
TERHADAP MORFOLOGI
DAN PROLIFERASI PIG KIDNEY (PK) CELL LINE
Andhista Pramiswari1, Dwi Listyorini2, Abdul Gofur2
1) Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang
2) Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Negeri Malang
Jalan Semarang No.5, Malang, Indonesia
[email protected]
Abstrak: Buah anggur merupakan buah yang kaya senyawa fenolik, yang diperkirakan
sekitar 60 hingga 70% terdapat pada biji anggur. Ekstrak biji anggur menunjukkan efek
penghambatan pada pertumbuhan sel kanker. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui
pengaruh ekstrak biji anggur terhadap sel normal.
Sel PK normal diberi ekstrak sebanyak 0, 25, 50, dan 100 µg/ml diinkubasi selama 24
atau 48 jam. Parameter yang diamati adalah morfologi sel PK berupa bentuk dan ukuran
sel, serta proliferasi sel PK. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak biji anggur
sebanyak 0, 25, 50, dan 100 µg/ml memperbesar sel setelah inkubasi selama 24 jam
namun tidak menjadi lebih besar lagi setelah inkubasi selama 48 jam. Ekstrak biji anggur
sebanyak 0, 25, 50, dan 100 µg/ml meningkatkan proliferasi sel dibandingkan kontrol
setelah inkubasi selama 24 jam dan 48 jam, namun semakin tinggi dosis ekstrak yang
diberikan terhadap sel, dapat menurunkan proliferasi sel. Hal tersebut menunjukkan
bahwa biji anggur bersifat toksik pada sel normal.
Kata Kunci: ekstrak biji anggur, morfologi PK Cell Line, proliferasi PK Cell Line
Seribu spesies anggur terbagi menjadi dua subgenus, yaitu Euvitis dan
Muscadinia. Kebanyakan spesies yang diketahui berasal dari subgenus Euviti.
Terdapat jenis anggur Eropa dan Amerika Selatan, yang kebanyakan sulit dibedakan
sehingga lebih mudah dikatakan jenis anggur terbagi menjadi anggur merah, anggur
hitam (biru kehitaman), dan anggur putih (Tarmizi, 2010).
Flavonoid merupakan senyawa fenolik yang sebagian besar terdapat pada
anggur, yaitu sekitar 65 hingga 76%. Diperkirakan sekitar 60 hingga 70% senyawa
polifenol terdapat pada biji anggur. Antioksidan buah anggur menunjukkan efek
penghambatan pada pertumbuhan sel kanker. GSPs menunjukkan induksi apoptosis
pada sel kanker paru-paru (Zhou & Raffoul, 2012).
Penelitian mengenai aktivitas senyawa fenolik ekstrak biji anggur terhadap sel
kanker memberikan efek penghambatan proliferasi sel sehingga ekstrak biji anggur
dapat digunakan sebagai pengobatan terhadap penderita kanker. Adanya manfaat dari
pemberian ekstrak biji anggur tersebut menjadikan landasan penelitian untuk
mengetahui pengaruh yang ditimbulkan ekstrak biji anggur terhadap sel normal
selama berlangsungnya pengobatan pada sel kanker.
METODE
Peneltian ini dilakukan di Laboratorium Tissue Culture bagian Peningkatan
Mutu dan Pengembangan Produk (PMPP) Pusat Veterinaria Farma (Pusvetma)
Surabaya. Penelitian ini menggunakan Pig Kidney (PK) cell line yang diperoleh dari
1
2
Pusat Veterinaria Farma (Pusvetma), Surabaya. Biji anggur yang digunakan sebagai
ekstrak didapatkan dari buah anggur biru kehitaman yang dibeli di Pasar Besar,
Malang. Jenis penelitian yang dilakukan merupakan penelitian eksperimental. Dipilih
jenis penelitian eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk
mengetahui pengaruh ekstrak biji anggur (Vitis vinifera) terhadap morfologi sel dan
proliferasi cell line Pig Kidney (PK). Prosedur penelitian yang dilaksanakan sebagai
berikut.
Pembuatan Ekstrak Biji Anggur
Membersihkan kemudian mencuci biji anggur di bawah air mengalir hingga
bersih. Menghaluskan biji anggur menggunakan mortal dan pistil. Menimbang
kemudian mencampur dengan methanol hingga didapatkan 30 mg/ml. Membuat stok
ekstrak dengan mencampurkan 30 mg/ml pengenceran methanol dengan 1 ml ethanol
70% kemudian disimpan pada keadaan gelap dalam suhu –20°C. Ekstrak diencerkan
dengan perbandingan 1:300 untuk mendapatkan 100 µg/ml. Dosis yang diberikan
pada kultur sel terbagi menjadi 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml (Dinicola et al.,
2010).
Kultur Sel Line Pig Kidney (PK) dan Plating
Sel line PK dicampur dengan medium kultur sel DMEM dan 5% FBS,
kemudian diinkubasi pada suhu 37°C di inkubator CO2 selama 24 jam sampai 8090% kultur sel line PK confluent. Setelah confluent, dilakukan subkultur dengan cara:
1) membuang medium dari botol kultur, 2) mencuci sel dengan 10 mL PBS, 3)
menambahkan 5 mL tripsin, 4) inkubasi pada suhu ruang, 5) menambah 5 mL PBS,
6) inkubasi pada inkubator CO2 pada suhu 37°C selama beberapa menit, 7)
menambahkan medium DMEM kemudian dihomogenkan, 8) memasukkan
sel+medium sebanyak 100 µl dalam microplate 96 well, 9) inkubasi pada suhu 37°C
di inkubator CO2 selama 24 jam.
Perlakuan
Kontrol negatif, yaitu kultur sel line Pig Kidney (PK) tanpa diberi ekstrak;
kontrol positif yaitu medium DMEM; perlakuan, yaitu memberikan ekstrak biji
anggur pada kultur cell line Pig Kidney (PK) dengan dosis 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan
100 µg/ml, masing-masing 50 µl untuk setiap ulangan. Dilakukan inkubasi selama 24
dan 48 jam untuk masing-masing microplate.
MTT Proliferation Assay
Pemberian reagen MTT untuk perlakuan durasi inkubasi 24 jam dan 48 jam
dilakukan setelah membuang cairan dalam microplate, kemudian masing-masing
ditetesi PBS sebanyak 250 µl. Ditambahkan medium DMEM sebanyak 100 µl, dan
reagen MTT sebanyak 10 µl pada masing-masing ulangan. Inkubasi selama 3 jam.
Cairan dalam microplate dibuang kemudian ditambahkan DMSO sebanyak 50 µl
pada masing-masing ulangan. Dilakukan homogenisasi dengan alat shaker
(Mosmann, 1983).
3
Pengamatan
Pengamatan dilakukan pada kultur sel line Pig Kidney (PK) setelah inkubasi
selama 24 dan 48 jam (kontrol), serta pada kultur sel line Pig Kidney (PK) yang telah
diberi ekstrak biji anggur dengan dosis 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml setelah
inkubasi 24 dan 48 jam (perlakuan), yang telah diberi reagen MTT. Setelah inkubasi
3 jam dan dishaker, dilakukan pengamatan dengan spectrophotometer menggunakan
ELISA reader pada λ 620.
HASIL
Morfologi Sel
Hasil pengamatan morfologi sel PK pada kontrol negatif maupun perlakuan
menunjukkan bahwa morfologi sel PK normal, yaitu berbentuk epiteloid. Pada
kontrol durasi inkubasi 24 dan 48 jam morfologi sel normal dengan diameter ±10 µm
(Gambar 1.A, E). Pada perlakuan, ukuran sel lebih besar dibandingkan kontrol
dengan diameter ±12 hingga 20 µm (Gambar 1.B, C, D, F, G, H).
24 jam
48 jam
E
B
F
C
G
D
H
100 µg/ml
50 µg/ml
25 µg/ml
kontrol
A
Gambar 1. Hasil pengamatan morfologi sel (garis hitam: 20µm)
4
Proliferasi Sel
Hasil MTT Proliferation Assay menunjukkan bahwa rerata nilai absorbansi
setelah diinkubasi selama 24 jam pada kontrol negatif adalah 0,427%, pada sel yang
diberi 25 µg/ml ekstrak adalah 0,558%, sel yang diberi 50 µg/ml ekstrak adalah
0,532%, dan sel yang diberi 100 µg/ml ekstrak adalah 0,504%. Rerata nilai
absorbansi setelah diinkubasi selama 48 jam pada kontrol negatif adalah 0,591%,
pada sel yang diberi 25 µg/ml ekstrak adalah 0,672%, sel yang diberi 50 µg/ml
ekstrak adalah 0,684%, dan sel yang diberi 100 µg/ml ekstrak adalah 0,640%. Rerata
nilai absorbansi pada kontrol positif durasi inkubasi 24 jam yaitu 0,082% dan pada
kontrol positif durasi inkubasi 48 jam yaitu 0,090%.
Nilai absorbansi menunjukkan persentase sel hidup. Semakin tinggi nilai
absorbansi, maka persentase sel hidup juga semakin meningkat. Proliferasi sel yang
diberi ekstrak biji anggur mengalami peningkatan dibandingkan dengan kontrol. Pada
durasi inkubasi 24 jam, persentase sel hidup dengan penambahan ekstrak lebih tinggi
dibandingkan kontrol dengan kecenderungan menurun dari dosis 25, 50, dan 100
µg/ml. Pada durasi inkubasi 48 jam, persentase sel hidup dengan penambahan ekstrak
juga lebih tinggi dibandingkan kontrol dengan kecenderungan meningkat pada dosis
25 dan 50 µg/ml dan cenderung pada dosis 100 µg/ml. Peningkatan dan penurunan
rerata nilai absorbansi disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2. Grafik persentase nilai absorbansi kultur sel PK kontrol dan perlakuan.
Hasil analisis statistik dengan menggunakan Anava Ganda pada taraf
kepercayaan 95% menunjukkan bahwa ekstrak biji anggur maupun durasi inkubasi
secara signifikan (0,000 < 0,05) mempengaruhi persentase sel hidup. Interaksi antara
ekstrak biji anggur dengan durasi inkubasi signifikan (0,007 < 0,05) mempengaruhi
persentase sel hidup. Hasil tersebut menunjukkan bahwa hipotesis penelitian diterima
dan hipotesis nihil ditolak. Hasil uji lanjut BNT ditunjukkan pada Tabel 1.
5
Tabel 1. Uji lanjut BNT interaksi ekstrak biji anggur dengan durasi inkubasi.
Durasi inkubasi (jam)
Ekstrak biji anggur
(µg/ml)
24
Kontrol (-)
Kontrol (+)
48
b
d e
a
a
25
c d
f
50
c d
f
100
c
e f
PEMBAHASAN
Pada kultur PK cell line sebagai kontrol negatif pada durasi inkubasi 48 jam
menunjukkan bahwa sel-selnya normal berbentuk epiteloid dan berukuran lebih kecil
yaitu ±10 µm, daripada sel-sel pada kultur PK cell line yang diberi ekstrak biji anggur
sebanyak 25, 50, dan 100 µg/ml yang diinkubasi selama 48 jam, yaitu ±12 µm.
Durasi inkubasi tidak mempengaruhi morfologi sel pada kontrol maupun perlakuan.
Ekstrak biji anggur memberikan pengaruh peningkatan ukuran sel pada durasi
inkubasi 24 jam maupun 48 jam, dengan artian sel membesar setelah 24 jam tetapi
tidak menjadi lebih besar setelah 48 jam.
Kontrol positif dalam penelitian ini merupakan pembanding untuk kontrol
negatif serta sebagai syarat pengamatan menggunakan MTT Proliferation Assay.
Nilai absorbansi kontrol positif yang hanya berisi medium merupakan batas
pembanding untuk semua perlakuan baik kontrol negatif maupun sel yang diberi
ekstrak biji anggur sebanyak 25, 50, dan 100 µg/ml. Absorbansi kontrol positif tidak
signifikan bermakna dibandingkan dengan absorbansi kontrol negatif maupun
perlakuan. Hal ini berarti bahwa nilai absorbansi kontrol negatif dan perlakuan sudah
terkoreksi, dan perbedaan di antara kontrol negatif dan perlakuan adalah perbedaan
karena perlakuan, bukan karena medium.
Ukuran sel PK yang telah diberi ekstrak biji anggur lebih besar daripada
kontrol negatif, diduga telah mendapatkan nutrisi lebih dari ekstrak biji anggur selain
nutrisi dari medium kultur dan serum berupa FBS. Peningkatan ukuran tersebut
bukan berarti sel PK mengalami pembelahan secara abnormal sehingga dapat
menimbulkan sel kanker, namun sel-sel PK tersebut menunjukkan mampu bertahan
ketika terdapat senyawa yang tidak dikenal memasuki siklus fisiologi sel tersebut
(Tian et al., 2009).
Persentase sel hidup dari nilai absorbansi pada kultur PK cell line yang diberi
ekstrak biji anggur dosis 25, 50, dan 100 µg/ml setelah diinkubasi selama 24 jam
lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol negatif. Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak biji anggur mampu memicu proliferasi sel. Pada durasi inkubasi 24 jam,
semakin tinggi dosis ekstrak menyebabkan penurunan proliferasi sel. Berbeda dengan
perlakuan durasi inkubasi selama 24 jam, inkubasi selama 48 jam menunjukkan
peningkatan persentase sel hidup pada sel PK yang diberi ekstrak sebanyak 50 µg/ml,
namun terjadi penurunan persentase sel hidup yang diberi ekstrak sebanyak 100
6
µg/ml. Dosis ekstrak yang semakin tinggi dapat menurunkan proliferasi sel PK
normal (Schuck et al., 2013).
Ekstrak biji anggur sebanyak 25, 50 dan 100 µg/ml dapat menurunkan
proliferasi sel kanker kolon (CaCo) (Dinicola et al., 2010), sementara itu hasil
penelitian menunjukkan bahwa proliferasi sel meningkat dibandingkan kontrol pada
durasi inkubasi 24 dan 48 jam, namun semakin tinggi dosis ekstrak dapat
menurunkan proliferasi sel. Hal tersebut menunjukkan bahwa biji anggur bersifat
toksik pada dosis yang lebih tinggi. Penelitian juga membuktikan bahwa sitotoksisitas
ekstrak biji anggur terhadap sel normal lebih rendah daripada terhadap sel kanker
seperti dilaporkan oleh Weaver et al. (2009).
SIMPULAN DAN SARAN
Penelitian ini menghasilkan kesimpulan yaitu ekstrak biji anggur dapat
memperbesar ukuran sel dan meningkatkan proliferasi sel PK normal. Berdasarkan
hasil penelitian ini dapat dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh ekstrak
biji anggur terhadap sel normal dengan menggunakan objek pembanding sel kanker
sehingga dapat diketahui perbedaan pengaruh ekstrak tersebut pada pembelahan sel
normal dan sel kanker, khususnya pada proliferasi sel.
DAFTAR RUJUKAN
Dinicola, S., Cucina, A., Pasqualato, A., Proietti, S., D’Anselmi, F., Pasqua, G.,
Santamaria, A. R., Coluccia, P., Laganà, A., Antonacci, D., Giuliani, A., and
Bizzarri, M. 2010. Apoptosis-Inducing Factor and Caspase-Dependent
Apoptotic Pathways Triggered by Different Grape Seed Extracts on Human
Colon Cancer Cell Line Caco-2. British Journal of Nutrition 104: 824-832.
Mosmann, T. 1983. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival:
Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of
Immunological Methods 65: 55-63.
Schuck, A. G., Weisburg, J. H., Greenbaum, R. E., Golfeiz, M. D., Segal, J. R.,
Weiss, R. A., Liebman, E. C., Zuckerbraun, H. L., and Babich, H. 2013.
Selective Cytotoxicity od a Grape Seed Proanthocyanidin Extract to Human
Oral Carcinoma HSC-2 Cells. Cell & Developmental Biology (2): 1-8.
Tarmizi. 2010. Buah Anggur Berpotensi Anti Kanker. (Online)
(http://kimia.unp.ac.id/?p=221), diakses tanggal 1 November 2013.
Tian, T., Lindell, S. L., Henderson, S. C., and Mangino, M. J. 2009. Protective Effect
of Ezrin on Cold Storage Preservation Injury in the Pig Kidney Proximal
Tubular Epithelial Cell Line [LLC-PK1]. Transplantation (10): 1488-1496.
Weaver, J., Briscoe, T., Hou, M., Goodman, C., Kata, S., Ross, H., McDougall, G.,
Stewart, D., and Riches, A. 2009. Strawberry Polyphenols are Equally
Cytotoxic to Tumourigenic and Normal Human Breast and Prostate Cell Line.
International Journal of Oncology (34): 777-786.
Zhou, K. & Raffoul, J. J. 2012. Potential Anticancer Properties of Grape
Antioxidants. Journal of Oncology (2012): 1-8.