UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL 70

UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL 70% BUAH
PARE (Momordica charantia L.) TERHADAP SEL HeLa
Cytotoxicity assay ethyl acetate fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit
(Momordica charantia L) on HeLa cell
Amalia Zahrah, Kusmardi dan Hadi Sunaryo
Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Abstract
In previous research ethanol 70% extract of bitter melon fruit against HeLa cells had LC50
values of 51.56 µg / ml. This research aimed at determining the cytotoxic effect of ethyl
acetate fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit the HeLa cells. In vitro
cytotoxicity assay performed by viable cell count. Fraction of ethyl acetate made of ethanol
70% extract of bitter melon fruit Five concentrations for the assay solution was 72,91; 51,56;
36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Cells mix to Cisplatin as a positive control with five concentration
was 3; 2;, 1; 0.5; and 0.25 µg / ml. And then the test was performed of HeLa cells with an
incubation period of 24 and 48 hours. Results obtained LC50 Cisplatin 24 hour incubation at
0.4075 µg / ml, the ethyl acetate fraction LC50 of ethanol 70% extract of 24 and 48 hour
incubation at 34.9221 and 22,1871 µg / ml. It can be concluded that ethyl acetate fraction of
ethanol 70% extract bitter melon fruit (Momordica charantia L.) have cytotoxic effect of
HeLa cells are included in the range are extremely toxic 5-50 µg/ml and has the potential for
anticancer drug.
Keywords: Momordica charantia L., Cytotoxicity, HeLa cell
Abstrak
Pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel
HeLa memiliki nilai LC50 51,56 μg/ml. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penelitian
ini yang bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70%
buah pare terhadap sel HeLa sehingga diketahui nilai LC50. Uji sitotoksisitas dilakukan secara
in vitro dengan metode perhitungan langsung. Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70%
sebagai larutan uji dibuat 5 konsentrasi yaitu 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Sel
ditambah Cisplatin sebagai kontrol positif dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2; 1; 0,5; dan 0,25
µg/ml. Kemudian dilakukan pengujian terhadap sel HeLa dengan masa inkubasi dilakukan
dalam waktu 24 jam dan 48 jam. Hasil didapatkan LC50 Cisplatin inkubasi 24 jam sebesar
0,4075 µg/ml, LC50 Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% inkubasi 24 dan 48 jam sebesar
34,9221 dan 22,1871 µg/ml. Dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak etanol
70% buah pare (Momordica charantia L.) memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa yang
masuk dalam rentang amat sangat toksik yaitu 5-50 µg/ml dan memiliki potensi untuk obat
antikanker.
Kata kunci : Momordica charantia L., Sitotoksisitas, Sel HeLa
PENDAHULUAN
Kanker adalah pertumbuhan sel
yang tidak normal atau terus menerus dan
tidak terkendali, dapat merusak jaringan
disekitarnya serta dapat menjalar ketempat
yang jauh dari asalnya. Suatu komplek sel
yang mendadak menjadi liar dan
memperbanyak diri secara pesat dan terus
menerus (proliferasi). Akibatnya terjadi
pembengkakan yang disebut tumor atau
neoplasma (neo: baru, plasma : bentukan).
Sel-sel kanker ini menginfiltrasi ke dalam
jaringan – jaringan yang ada disekitarnya
dan memusnahkannya sehingga dapat
menyebabkan kematian (Indrawati, 2009).
Sel kanker bersifat ganas dan dapat
menyebabkan kematian, dapat berasal atau
tumbuh dari setiap sel tubuh manusia,salah
satunya kanker serviks .
Ada berbagai faktor pemicu
kanker, baik dari dalam tubuh sendiri
maupun dari luar. Faktor luar pemicu
kanker antara lain adalah lingkungan, zat
karsinogenik, infeksi dan radikal bebas (E.
Greer, 2010).
Pengobatan penyakit kanker sering
dilakukan dengan cara operasi atau
pembedahan, penyinaran atau radiasi dan
kemoterapi, yang sekarang berkembang
menjadi imunoterapi. Pengobatan ini
ditujukan untuk membunuh sel-sel kanker
sehingga tidak dapat berkembang dan
membahayakan bagi tubuh (Diyah, 2000).
Pengobatan secara modern ini memerlukan
biaya yang tinggi dan hasilnya seringkali
tidak memuaskan sehingga pengobatan
tradisional dengan menggunakan tanaman
obat menjadi salah satu alternatif
pengobatan penyakit kanker.
Dalam pengobatan tradisional,
tanaman pare (Momordica charantia L.)
memberikan andil yang cukup besar bagi
masyarakat. Selain kandungan gizinya
yang tinggi, tanaman pare juga
mengandung khasiat sebagai obat.
Tanaman pare banyak dimanfaatkan untuk
mengobati beberapa penyakit, seperti obat
batuk, radang tenggorokan, sakit mata
merah, demam, malaria, menambah nafsu
makan, kencing manis, rhematik, sariawan,
abses, sakit lever, sembelit, cacingan Buah
pare mengandung alkaloid, flavonoid, dan
saponin (Tati, S 2004).
Pada penelitian sebelumnya ekstrak
etanol 70% buah pare (Momordica
charantia L.) mengunakan sel HeLa
dengan nilai LC50 51,56 µg/ml (Martini,
2005). Penelitian ini menunjukan bahwa
senyawa kimia yang terkandung dalam
ekstrak tersebut memiliki toksisitas dan
dapat diartikan bahwa senyawa yang
terkandung dalam ekstrak tersebut
memiliki potensi sangat sitotoksik
(Priyanto, 2009). Untuk mengetahui
adanya efek sitotoksik yang terkandung
dalam buah pare maka perlu dilakukan uji
sitotoksik fraksi etil asetat ekstrak etanol
70% buah pare (Momordica charantia L.)
terhadap sel HeLa.
Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur
sel HeLa semakin disenangi karena
berbagai alasan, diantaranya mampu
menurunkan biaya percobaan yang mahal
karena menggunakan hewan, waktu yang
diperlukan lebih cepat. Pengembangan
metode in vitro sebagai alternatif
pengganti uji dengan menggunakan hewan
uji mempunyai relevansi yang cukup baik
yang bertujuan untuk mendeteksi potensi
suatu obat pada manusia.
Gambar I. Tanaman buah pare
METODOLOGI PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah simplisia kering buah pare
(Momordica Charantia) yang telah
dideterminasi di Herbarium Bogoriensis,
Bogor. Beberapa bahan kimia yang dipakai
untuk mengidentifikasi bahan kimianya
(alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid
dan steroid). Bahan-bahan lainnya adalah
etanol 70% (C2H5OH), etil asetat, dimetil
sulfoksida (DMSO), medium kultur
Rosewell
Park
Memorial
Institute
(RPMI)1640, HEPES, Fetal Bovine Serum
(FBS), penisilin-streptomisin, fungizon,
natrium bikarbonat, dinatrium hidrogen
fosfat, kalium dihidrogen fosfat, natrium
klorida (NaCl), biru tripan, akuabidest,
cisplatin.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan
ekstrak etanol 70% dan fraksi etanol terdiri
dari toples kaca, timbangan analitik, gelas
ukur, vakum uap (rotary evaporator),
lemari es, oven, mesin penggiling, corong
buchner, cawan porselen, penangas air dan
corong pisah.
Alat untuk uji sitotoksisitas terdiri dari
gelas ukur, gelas beker, blue tip, yellow
tip, tabung conical steril ukuran 15 dan 45
ml, tissue culture flask ukuran 25 dan 75
cm (TCF), tabung eppendrof, pH meter,
timbangan analitik, autoklaf, sentrifuse,
inkubator CO2, laminar air flow biological
safety cabinet, mikroskop, pipet mikro,
microplate 96 sumuran, hemositometer,
cell counter, tangki nitrogen cair,
membran filter steril berdiameter 0,2 µm,
lemari es, kamera digital.
Prosedur
1. Pembuatan ekstrak etanol 70% buah
pare.
Ekstraksi dilakukan dengan cara
maserasi yaitu dengan memasukkan 1,1 kg
serbuk kering simplisia kedalam botol
bermulut
(maserator)
kemudian
ditambahkan 10 bagian etanol 70%.
Rendam selama 6 jam pertama sambil
sesekali diaduk agar zat aktif yang terdapat
pada
simpisia
terlarut,
kemudian
didiamkan selama 18 jam. Dipisahkan
maserat dengan menggunakan kertas
saring,
diulangi
proses
penyarian
sekurang-kurangnya dua kali dengan jenis
dan jumlah pelarut yang sama. Maserat
yang diperoleh dipekatkan dengan vakum
rotary evaporator pada suhu 50 °C hingga
kental tetapi masih bisa dituang. Kemudian
dikeringkan di dalam oven pada suhu 40
°C hingga diperoleh bobot tetap (Depkes,
RI, 2008).
2. Fraksinasi etil asetat ekstrak etanol 70
% buah pare (Momordica charantia L.)
Ekstrak etanol 70% dimasukkan ke
dalam corong pisah. Kemudian di
fraksinasi dengan pelarut n-Heksan dengan
perbandingan (1:1), kocok selama ± 15
menit. Setelah didiamkan beberapa lama
terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-Heksan
dengan lapisan etanol 70%. Lapisan nHeksan ( bagian atas ) dipisahkan dengan
membuka kran (corong) pisah sampai
lapisan etanol habis. Diambil lapisan nHeksan kemudian dipisahkan sebagai
fraksi n-heksan. Lapisan etanol kemudian
difraksinasi kembali dengan pelarut etil
asetat dengan perbandingan (1:1), kocok
selama ± 15 menit. Setelah didiamkan
beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu
lapisan etil asetat dan lapisan etanol 70%.
Lapisan etil asetat ( bagian atas)
dipisahkan dengan membuka kran corong
pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil
lapisan etil asetat kemudian dipisahkan
sebagai fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat
diuapkan dengan vacum rotary evaporator
pada suhu 50 ºC hingga kental tapi masih
bisa dituang. Kemudian fraksi tersebut
dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC
hingga diperoleh bobot tetap.
3. Identifikasi golongan kimia
Uji penapisan fitokimia dilakukan
untuk mengetahui ada tidaknya kandungan
alkaloid,
saponin,
flavonoid,
dan
triterpenoid.
4. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat
dari ekstrak buah pare
Fraksi etil asetat ekstrak etanol
70% buah pare ditimbang sebanyak 50 mg
dan dilarutkan dalam labu 10 ml sehingga
konsentrasi larutan induk 5000 μg/ml. Dari
larutan induk dipipet sebanyak 100 μl dan
ditambahkan pelarut 900 μl sehingga
diperoleh konsentrasi sebesar 500 μg/ml.
Dari larutan ini dibuat pengenceran dengan
konsentrasi 72,91; 51,56; 36,46; 25,78;
18,23 μg/ml untuk fraksi etil asetat ekstrak
etanol 70% buah pare. Semua larutan uji
dibuat dengan pengenceran bertingkat.
Pembuatan larutan uji dilakukan secara
aseptis di dalam LAF.
Tabel I. Persentase kematian sel HeLa
pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70%
buah pare inkubasi 24 jam.
Konsentr
asi
(µg/ml)
72,91
Log
%
konsentr Kemati
asi (X)
an
1,8628
81,4
Probit
(Y)
5,9827
51,56
1,7123
68,3
5,4761
36,46
1,5618
51,7
5,0426
25,78
1,4112
32,4
4,5435
18,23
1,2608
24,2
4,3001
Y= 2,7359 + 0,7781X
r = 0,9956
LC50 = 34,9221 µg/ml
Tabel II. Persentase kematian sel HeLa
pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70%
buah pare inkubasi 48 jam.
5. Pembuatan
larutan
pembanding
cisplatin
Sebagai
kontrol
positif
sel
ditambah cisplatin dibuat dengan membuat
larutan induk cisplatin sebanyak 0,2 ml
Konsentr
Log
%
Probit
asi
konsent Kematian
(Y)
(µg/ml)
rasi (X)
72,91
1,8628
95,6
6,7060
51,56
1,7123
84,5
6,0152
36,46
1,5618
73,4
5,6250
25,78
1,4112
59,2
5,2327
18,23
1,2608
40,7
4,7647
Y= 3,0995 + 0,8279X
r = 0,9934
LC50 = 22,1871 µg/ml
injeksi cisplatin dengan sediaan 0,5 mg/ml
dan ditambahkan pelarut 9,8 ml sehingga
diperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Kemudian
dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan
0,25 μg/ml. Pembuatan larutan kontrol
positiif dilakukan secara aseptis di dalam
LAF.
6. Kepadatan sel
20 μl suspensi sel HeLa dengan
180 μl biru tripan di bawah mikroskop.
Sebanyak 10 μl campuran dipipet ditaruh
pada permukaan kamar hitung dengan
menyinggung pinggir kaca penutup.
Biarkan kamar hitung terisi larutan
perlahan-lahan sampai penuh. Sel diamati
dengan pembesaran 100 kali. Jumlah Sel
dihitung dengan rumus
n
Kepadatan sel/ml =
   10 4 sel/ml
25
Keterangan:
n
: jumlah sel dalam 25 bilik
4
: jumlah bilik hemositometer
yang dihitung
P
: faktor pengenceran
: 10.000 sel/ml
104
7. Uji Sitotoksisitas metode perhitungan
langsung (viable cell count).
Metode penghitungan langsung
dilakukan dengan cara pengecatan yang
menggunakan larutan biru tripan. Biru
tripan akan berikatan dengan protein sel
yang keluar dan membran sel yang
mengalami kerusakan. Sel yang mati akan
menyerap warna biru tripan sedangkan sel
yang hidup tidak menyerap warna biru
tripan karena tidak mengalami kerusakan
pada membran sel (Khotimah, K, 2004).
Persentase kematian sel dengan
metode perhitungan langsung (viable cell
count) dihitung dengan menggunakan
rumus .
jumlah sel yang hidup
viabilitas
100%..............................
total jumlah sel
% kematian  100%  % viabilitas....................................
Pada penelitian ini dibagi dalam 4
kelompok pengujian yaitu media ditambah
sel sebagai kontrol negatif, sel ditambah
pelarut DMSO sebagai kontrol pelarut, sel
ditambah cisplatin sebagai kontrol positif
dibuat sebanyak 5 konsentrasi yaitu 3; 2:
1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Dan pengujian
larutan sampel uji fraksi etil asetat ekstrak
etanol 70% buah pare dibuat sebanyak 5
konsentrasi sebagai berikut: 72,91; 51,56;
36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Masing-masing
dimasukan ke dalam mikroplate 96
sumuran sebanyak
100 μl kemudian
ditambah suspensi sel sebanyak 100 μl ke
dalam tiap sumuran, sehingga tiap
sumuran berisi 200 μl larutan. Seri kadar
dilakukan tiga kali replikasi (triplo) untuk
mendapatkan hasil yang lebih valid.
Selanjutnya kultur diinkubasi selama
24 jam pada suhu 370C. Untuk menghitung
jumlah sel tiap sumuran diambil medianya
sebanyak 50 μl kemudian ditambahkan 50
μl larutan biru tripan. Setelah kurang lebih
3 menit diresuspensi diambil 10 μl untuk
dihitung jumlah selnya menggunakan
hemositometer.
Persen kematian yang diperoleh
masing-masing konsentrasi diubah ke
dalam angka probit dengan menggunakan
tabel probit, Dari data ini dibuat
persamaan regresi linier untuk melihat
hubungan antar perlakuan dengan persen
kematian sel. Perhitungan dengan cara
probit ini dilakukan dengan memasukan 5
angka sebagai probit ke dalam persamaan
regresi linier, kemudian hasil disubstitusi
dan diganti logaritma sehingga diperoleh
nilai LC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Buah pare diekstraksi dengan cara
maserasi dengan menggunakan pelarut
etanol
70%.
Pemilihan
metode
pengekstrakan dengan cara maserasi
karena sederhana dan mudah dalam
pelaksanaannya. Sedangkan penggunaan
etanol 70% sebagai pelarut karena ekstrak
yang didapat menjadi tidak mudah
ditumbuhi kapang dan lebih mudah
menguap sehingga waktu yang dibutuhkan
untuk pemekatan dan pengeringan
menjadi lebih singkat.
Dari hasil identifikasi senyawa
kimia ekstrak etanol 70% didapat beberapa
golongan senyawa seperti, alkaloid,
flavonoid, saponin, triterpenoid dan
steroid. Pada fraksi etil asetat ekstrak
etanol 70% terdapat senyawa alkaloid,
flavonoid, saponin dan steroid.
Pada
penelitian
sebelumnya
menggunakan ekstrak etanol 70% buah
pare terhadap sel HeLa memiliki nilai LC50
51,56 μg/ml. Penelitian ini menunjukan
bahwa senyawa kimia yang terkandung
dalam ekstrak tersebut memiliki range
toksik, dapat diartikan pula bahwa
senyawa yang terkandung dalam ekstrak
tersebut memiliki potensi sitotoksik. Maka
dilakukan penelitian lanjutan dengan uji
sitotoksisitas dengan menggunakan pelarut
fraksi yang sama. Dan diharapkan dapat
lebih banyak menarik zat yang berpotensi
sebagai anti kanker.
Untuk uji sitotoksisitas penggunaan
kultur sel semakin disenangi karena
berbagai alasan, diantaranya mampu
menurunkan biaya percobaan yang mahal
karena menggunakan hewan, waktu yang
diperlukan lebih cepat.
Pengembangan metode in vitro
sebagai alternatif pengganti uji dengan
menggunakan hewan uji mempunyai
relevansi yang cukup baik yang bertujuan
untuk mendeteksi potensi suatu obat pada
manusia.
Uji sitotoksisitas ini menggunakan
sel HeLa karena tujuan dari penelitian ini
untuk mencari obat untuk kanker serviks
yang berasal dari bahan alam. Penggunaan
sel HeLa ini juga karena sel HeLa
merupakan turunan dari sel epitel kanker
leher rahim atau serviks manusia dan sel
HeLa cukup aman dan sering digunakan
untuk kepentingan kultur sel.
Uji sitotoksisitas dengan metode
perhitungan langsung dilakukan dengan
menggunakan hemositometer dengan
pewarna biru tripan. Sel yang mati akan
menyerap warna biru tripan karena adanya
kerusakan
pada
membran
selnya,
sedangkan pada sel yang hidup biru tripan
tidak dapat terserap karena membran sel
masih dalam keadaan utuh. Sel yang mati
akan berbentuk bulat dan berwarna keruh
dan sel yang hidup berbentuk bulat
panjang dan terlihat bening.
Cisplatin
digunakan
sebagai
kontrol positif karena telah banyak
digunakan sebagai obat kanker leher
rahim. Sitotoksisitas pemberiannya dapat
terjadi pada setiap siklus sel khususnya
pada fase G1 dan S. Cisplatin yang masuk
akan terikat pada N7 guanin DNA
membentuk hubungan melintang dan
saling mengikat antara rantai – rantai DNA
didalam inti sel sehingga terjadi kerusakan
DNA dan RNA sel. Kerusakan ini akan
menyebabkan
penggandaan
DNA
terganggu dan proses proliferase akan
terhambat.
Penelitian dilakukan dengan lama
waktu inkubasi 24 jam dan 48 jam karena
pada inkubasi 24 jam akan diperoleh nilai
LC50nya. Sedangkan pada pengujian
dengan inkubasi 48 jam untuk mengetahui
efektifitasnya sebagai senyawa sitotoksik.
% kematian
Grafik hubungan konsentrasi (µg/ml)
dengan persen kematian
120
100
80
60
40
20
0
y = 0,9398x + 32,158
r = 0,9074
y = 1,075x + 7,5399
r = 0,9605
0
20
40
60
80
konsentrasi (µg/ml)
Inkubasi 24 jam
Inkubasi 48 jam
Linear (Inkubasi 24 jam )
Linear (Inkubasi 48 jam )
KESIMPULAN
Pada penelitian ini didapat LC50
pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70%
sebesar 34,9221 µg/ml . Berdasarkan nilai
LC50 yang diperoleh dari kedua fraksi
diketahui bahwa buah pare memiliki sifat
sitotoksisitas. Pada penelitian lanjutan
dengan inkubasi 48 jam nilai LC50 fraksi
etil asetat ekstrak etanol 70% adalah
22,1871
µg/ml.
Hasil
penelitian
menunjukan bahwa fraksi etil asetat
ekstrak etanol 70% buah pare memiliki
efek sitotoksik terhadap sel HeLa dan
memiliki potensi amat sangat toksik
sehingga dapat dikembangkan sebagai obat
antikanker.
DAFTAR PUSTAKA
Departemen
Kesehatan
RI,
2008.
Farmakope Herbal Indonesia Edisi
1. Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Hal 174-175
Diyah, Nurul W, dan Sukohardjono. 2000.
Antikanker, dalam: Kimia Medisinal,
ed. Kedua, Airlangga University
Press, Surabaya.
Direktorat Pengendalian Penyakit Tidak
Buku
Saku
Menular.
2009.
Pencegahan Kanker Leher Rahim
dan Kanker Payudara. Bakti
Husada, Jakarta.Hal 1, 4-5.
E.
Greer
,Benjamin,dkk.
Cervical
Cancer.2010. Journal Of The
National Comprehensive Cancer
Network. Hal 1388,1408-1420.
Indrawati. 2009. Bahaya Kanker Bagi
Pengenalan,
Wanita
dan
Pria
Penanganan,
dan
Pencegahan
Terhadap Kanker.AV Publisher,
Jakarta Hal. 1-7, 164-180.
Khotimah, K.2004. Uji Sitotoksisitas dan
Antiproliferasi Fraksi Petroleum
Eter dan Fraksi Etanol Kulit
Batang
Kamboja
(Plumeria
acuminate Ait) Terhadap Sel HeLa.
Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas
Ahmad Dahlan.Yogyakarta. Hal.21.
Priyanto. 2009. Toksikologi Mekanisme,
Terapi Antidotum, dan Penilaian
Lembaga
Studi
dan
Resiko.
Konsultasi Farmakologi, Jawa Barat.
Hal.152.
Tati, S dan S. Subahar. 2004. Khasiat dan
Manfaat Pare si Pahit Pembasmi
Penyakit.
Agromedia
Pustaka.
Jakarta.