Uji sitotoksisitas buah pare - Universitas Muhammadiyah Prof.DR

UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL 70% BUAH
PARE (Momordica charantia L.) TERHADAP SEL HeLa
CYTOTOXICITY ASSAY ETHYL ACETATE FRACTION OF ETHANOL 70%
EXTRACT OF BITTER MELON FRUIT (Momordica charantia L) ON HeLa CELL
Amalia Zahrah, Kusmardi dan Hadi Sunaryo
Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka
Abstract
In previous research ethanol 70% extract of bitter melon fruit against HeLa cells had
LC50 values of 51.56 µg / ml. This research aimed at determining the cytotoxic effect of ethyl
acetate fraction of ethanol 70% extract of bitter melon fruit the HeLa cells. In vitro
cytotoxicity assay performed by viable cell count. Fraction of ethyl acetate made of ethanol
70% extract of bitter melon fruit Five concentrations for the assay solution was 72,91; 51,56;
36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Cells mix to Cisplatin as a positive control with five concentration
was 3; 2;, 1; 0.5; and 0.25 µg / ml. And then the test was performed of HeLa cells with an
incubation period of 24 and 48 hours. Results obtained LC50 Cisplatin 24 hour incubation at
0.4075 µg / ml, the ethyl acetate fraction LC50 of ethanol 70% extract of 24 and 48 hour
incubation at 34.9221 and 22,1871 µg / ml. It can be concluded that ethyl acetate fraction of
ethanol 70% extract bitter melon fruit (Momordica charantia L.) have cytotoxic effect of
HeLa cells are included in the range are extremely toxic 5-50 µg/ml and has the potential for
anticancer drug.
Keywords: Momordica charantia L., Cytotoxicity, HeLa cell
Abstrak
Pada penelitian sebelumnya dengan menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare
terhadap sel HeLa memiliki nilai LC50 51,56 μg/ml. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan
penelitian ini yang bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi etil asetat dari ekstrak
etanol 70% buah pare terhadap sel HeLa sehingga diketahui nilai LC50. Uji sitotoksisitas
dilakukan secara in vitro dengan metode perhitungan langsung. Fraksi etil asetat dari ekstrak
etanol 70% sebagai larutan uji dibuat 5 konsentrasi yaitu 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23
μg/ml. Sel ditambah Cisplatin sebagai kontrol positif dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2; 1; 0,5;
dan 0,25 µg/ml. Kemudian dilakukan pengujian terhadap sel HeLa dengan masa inkubasi
dilakukan dalam waktu 24 jam dan 48 jam. Hasil didapatkan LC50 Cisplatin inkubasi 24 jam
sebesar 0,4075 µg/ml, LC50 Fraksi etil asetat dari ekstrak etanol 70% inkubasi 24 dan 48 jam
sebesar 34,9221 dan 22,1871 µg/ml. Dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak
etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.) memiliki sifat sitotoksik terhadap sel HeLa
yang masuk dalam rentang amat sangat toksik yaitu 5-50 µg/ml dan memiliki potensi untuk
obat antikanker.
Kata kunci : Momordica charantia L., Sitotoksisitas, Sel HeLa
PENDAHULUAN
Kanker adalah pertumbuhan sel yang tidak normal atau terus menerus dan tidak
terkendali, dapat merusak jaringan disekitarnya serta dapat menjalar ketempat yang jauh dari
asalnya. Suatu komplek sel yang mendadak menjadi liar dan memperbanyak diri secara pesat
dan terus menerus (proliferasi). Akibatnya terjadi pembengkakan yang disebut tumor atau
neoplasma (neo: baru, plasma : bentukan). Sel-sel kanker ini menginfiltrasi ke dalam jaringan
– jaringan yang ada disekitarnya dan memusnahkannya sehingga dapat menyebabkan
kematian (Indrawati, 2009). Sel kanker bersifat ganas dan dapat menyebabkan kematian,
dapat berasal atau tumbuh dari setiap sel tubuh manusia,salah satunya kanker serviks .
Ada berbagai faktor pemicu kanker, baik dari dalam tubuh sendiri maupun dari luar.
Faktor luar pemicu kanker antara lain adalah lingkungan, zat karsinogenik, infeksi dan
radikal bebas (E. Greer, 2010).
Pengobatan penyakit kanker sering dilakukan dengan cara operasi atau pembedahan,
penyinaran atau radiasi dan kemoterapi, yang sekarang berkembang menjadi imunoterapi.
Pengobatan ini ditujukan untuk membunuh sel-sel kanker sehingga tidak dapat berkembang
dan membahayakan bagi tubuh (Diyah, 2000). Pengobatan secara modern ini memerlukan
biaya yang tinggi dan hasilnya seringkali tidak memuaskan sehingga pengobatan tradisional
dengan menggunakan tanaman obat menjadi salah satu alternatif pengobatan penyakit
kanker.
Dalam pengobatan tradisional, tanaman pare (Momordica charantia L.) memberikan
andil yang cukup besar bagi masyarakat. Selain kandungan gizinya yang tinggi, tanaman pare
juga mengandung khasiat sebagai obat. Tanaman pare banyak dimanfaatkan untuk mengobati
beberapa penyakit, seperti obat batuk, radang tenggorokan, sakit mata merah, demam,
malaria, menambah nafsu makan, kencing manis, rhematik, sariawan, abses, sakit lever,
sembelit, cacingan Buah pare mengandung alkaloid, flavonoid, dan saponin (Tati, S 2004).
Pada penelitian sebelumnya ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica charantia L.)
mengunakan sel HeLa dengan nilai LC50 51,56 µg/ml (Martini, 2005). Penelitian ini
menunjukan bahwa senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki
toksisitas dan dapat diartikan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut
memiliki potensi sangat sitotoksik (Priyanto, 2009).
Gambar 1. Tanaman buah pare
Untuk mengetahui adanya efek sitotoksik yang terkandung dalam buah pare maka
perlu dilakukan uji sitotoksik fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare (Momordica
charantia L.) terhadap sel HeLa.Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur sel HeLa semakin
disenangi karena berbagai alasan, diantaranya mampu menurunkan biaya percobaan yang
mahal karena menggunakan hewan, waktu yang diperlukan lebih cepat. Pengembangan
metode in vitro sebagai alternatif pengganti uji dengan menggunakan hewan uji mempunyai
relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi suatu obat pada manusia.
METODOLOGI PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah simplisia kering buah pare (Momordica
Charantia) yang telah dideterminasi di Herbarium Bogoriensis, Bogor. Beberapa bahan kimia
yang dipakai untuk mengidentifikasi bahan kimianya (alkaloid, saponin, flavonoid,
triterpenoid dan steroid). Bahan-bahan lainnya adalah etanol 70% (C2H5OH), etil asetat,
dimetil sulfoksida (DMSO), medium kultur Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)1640,
HEPES, Fetal Bovine Serum (FBS), penisilin-streptomisin, fungizon, natrium bikarbonat,
dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, natrium klorida (NaCl), biru tripan,
akuabidest, cisplatin.
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan ekstrak etanol 70% dan fraksi etanol terdiri dari
toples kaca, timbangan analitik, gelas ukur, vakum uap (rotary evaporator), lemari es, oven,
mesin penggiling, corong buchner, cawan porselen, penangas air dan corong pisah.
Alat untuk uji sitotoksisitas terdiri dari gelas ukur, gelas beker, blue tip, yellow tip, tabung
conical steril ukuran 15 dan 45 ml, tissue culture flask ukuran 25 dan 75 cm (TCF), tabung
eppendrof, pH meter, timbangan analitik, autoklaf, sentrifuse, inkubator CO2, laminar air
flow biological safety cabinet, mikroskop, pipet mikro, microplate 96 sumuran,
hemositometer, cell counter, tangki nitrogen cair, membran filter steril berdiameter 0,2 µm,
lemari es, kamera digital.
Prosedur
1. Pembuatan ekstrak etanol 70% buah pare.
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan memasukkan 1,1 kg serbuk
kering simplisia kedalam botol bermulut (maserator) kemudian ditambahkan 10 bagian etanol
70%. Rendam selama 6 jam pertama sambil sesekali diaduk agar zat aktif yang terdapat pada
simpisia terlarut, kemudian didiamkan selama 18 jam. Dipisahkan maserat dengan
menggunakan kertas saring, diulangi proses penyarian sekurang-kurangnya dua kali dengan
jenis dan jumlah pelarut yang sama. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan vakum rotary
evaporator pada suhu 50 °C hingga kental tetapi masih bisa dituang. Kemudian dikeringkan
di dalam oven pada suhu 40 °C hingga diperoleh bobot tetap (Depkes, RI, 2008).
2. Fraksinasi etil asetat ekstrak etanol 70 % buah pare (Momordica charantia L.)
Ekstrak etanol 70% dimasukkan ke dalam corong pisah. Kemudian di fraksinasi
dengan pelarut n-Heksan dengan perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah
didiamkan beberapa lama terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-Heksan dengan lapisan etanol
70%. Lapisan n-Heksan ( bagian atas ) dipisahkan dengan membuka kran (corong) pisah
sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan n-Heksan kemudian dipisahkan sebagai fraksi nheksan. Lapisan etanol kemudian difraksinasi kembali dengan pelarut etil asetat dengan
perbandingan (1:1), kocok selama ± 15 menit. Setelah didiamkan beberapa lama terbentuk 2
lapisan, yaitu lapisan etil asetat dan lapisan etanol 70%. Lapisan etil asetat ( bagian atas)
dipisahkan dengan membuka kran corong pisah sampai lapisan etanol habis. Diambil lapisan
etil asetat kemudian dipisahkan sebagai fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat diuapkan dengan
vacum rotary evaporator pada suhu 50 ºC hingga kental tapi masih bisa dituang. Kemudian
fraksi tersebut dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC hingga diperoleh bobot tetap.
3. Identifikasi golongan kimia
Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan
alkaloid, saponin, flavonoid, dan triterpenoid.
4. Pembuatan larutan uji fraksi etil asetat dari ekstrak buah pare
Fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare ditimbang sebanyak 50 mg dan
dilarutkan dalam labu 10 ml sehingga konsentrasi larutan induk 5000 μg/ml. Dari larutan
induk dipipet sebanyak 100 μl dan ditambahkan pelarut 900 μl sehingga diperoleh
konsentrasi sebesar 500 μg/ml. Dari larutan ini dibuat pengenceran dengan konsentrasi 72,91;
51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml untuk fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare.
Semua larutan uji dibuat dengan pengenceran bertingkat. Pembuatan larutan uji dilakukan
secara aseptis di dalam LAF.
Tabel I. Persentase kematian sel HeLa pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare
inkubasi 24 jam.
Tabel II. Persentase kematian sel HeLa
pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70%
buah pare inkubasi 48 jam.
Konsentr
asi
(µg/ml)
72,91
Log
%
konsentr Kemati
asi (X)
an
1,8628
81,4
Probit
(Y)
5,9827
51,56
1,7123
68,3
5,4761
36,46
1,5618
51,7
5,0426
25,78
1,4112
32,4
4,5435
18,23
1,2608
24,2
4,3001
Y= 2,7359 + 0,7781X
r = 0,9956
LC50 = 34,9221 µg/ml
Konsentr
Log
asi
konsent
(µg/ml)
rasi (X)
72,91
1,8628
51,56
1,7123
36,46
1,5618
25,78
1,4112
18,23
1,2608
Y= 3,0995 + 0,8279X
r = 0,9934
LC50 = 22,1871 µg/ml
%
Kematian
Probit
(Y)
95,6
84,5
73,4
59,2
40,7
6,7060
6,0152
5,6250
5,2327
4,7647
Pembuatan larutan pembanding cisplatin
Sebagai kontrol positif sel ditambah cisplatin dibuat dengan membuat larutan induk
cisplatin sebanyak 0,2 ml injeksi cisplatin dengan sediaan 0,5 mg/ml dan ditambahkan pelarut
9,8 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10 μg/ml. Kemudian dibuat 5 konsentrasi yaitu 3; 2:
1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Pembuatan larutan kontrol positiif dilakukan secara aseptis di dalam
LAF.
5. Kepadatan sel
20 μl suspensi sel HeLa dengan 180 μl biru tripan di bawah mikroskop. Sebanyak 10
μl campuran dipipet ditaruh pada permukaan kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca
penutup. Biarkan kamar hitung terisi larutan perlahan-lahan sampai penuh. Sel diamati
dengan pembesaran 100 kali. Jumlah Sel dihitung dengan rumus
n
Kepadatan sel/ml =
   10 4 sel/ml
25
Keterangan:
n
: jumlah sel dalam 25 bilik
4
: jumlah bilik hemositometer
yang dihitung
P
: faktor pengenceran
104
: 10.000 sel/ml
6. Uji Sitotoksisitas metode perhitungan langsung (viable cell count).
Metode penghitungan langsung dilakukan dengan cara pengecatan yang
menggunakan larutan biru tripan. Biru tripan akan berikatan dengan protein sel yang keluar
dan membran sel yang mengalami kerusakan. Sel yang mati akan menyerap warna biru tripan
sedangkan sel yang hidup tidak menyerap warna biru tripan karena tidak mengalami
kerusakan pada membran sel (Khotimah, K, 2004).
Persentase kematian sel dengan metode perhitungan langsung (viable cell count)
dihitung dengan menggunakan rumus .
jumlahsel yang hidup
viabilitas
100%.......................................(3)
total jumlahsel
% kematian  100%  % viabilitas....................................................(4)
Pada penelitian ini dibagi dalam 4 kelompok pengujian yaitu media ditambah sel sebagai
kontrol negatif, sel ditambah pelarut DMSO sebagai kontrol pelarut, sel ditambah cisplatin
sebagai kontrol positif dibuat sebanyak 5 konsentrasi yaitu 3; 2: 1; 0,5; dan 0,25 μg/ml. Dan
pengujian larutan sampel uji fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare dibuat sebanyak
5 konsentrasi sebagai berikut: 72,91; 51,56; 36,46; 25,78; 18,23 μg/ml. Masing-masing
dimasukan ke dalam mikroplate 96 sumuran sebanyak 100 μl kemudian ditambah suspensi
sel sebanyak 100 μl ke dalam tiap sumuran, sehingga tiap sumuran berisi 200 μl larutan. Seri
kadar dilakukan tiga kali replikasi (triplo) untuk mendapatkan hasil yang lebih valid.
Selanjutnya kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Untuk menghitung jumlah
sel tiap sumuran diambil medianya sebanyak 50 μl kemudian ditambahkan 50 μl larutan biru
tripan. Setelah kurang lebih
3 menit diresuspensi diambil 10 μl untuk dihitung jumlah
selnya menggunakan hemositometer.
Persen kematian yang diperoleh masing-masing konsentrasi diubah ke dalam angka
probit dengan menggunakan tabel probit, Dari data ini dibuat persamaan regresi linier untuk
melihat hubungan antar perlakuan dengan persen kematian sel. Perhitungan dengan cara
probit ini dilakukan dengan memasukan 5 angka sebagai probit ke dalam persamaan regresi
linier, kemudian hasil disubstitusi dan diganti logaritma sehingga diperoleh nilai LC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Buah pare diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70%.
Pemilihan metode pengekstrakan dengan cara maserasi karena sederhana dan mudah dalam
pelaksanaannya. Sedangkan penggunaan etanol 70% sebagai pelarut karena ekstrak yang
didapat menjadi tidak mudah ditumbuhi kapang dan lebih mudah menguap sehingga waktu
yang dibutuhkan untuk pemekatan dan pengeringan menjadi lebih singkat.
Dari hasil identifikasi senyawa kimia ekstrak etanol 70% didapat beberapa golongan
senyawa seperti, alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid dan steroid. Pada fraksi etil asetat
ekstrak etanol 70% terdapat senyawa alkaloid, flavonoid, saponin dan steroid.
% kematian
Pada penelitian sebelumnya menggunakan ekstrak etanol 70% buah pare terhadap sel
HeLa memiliki nilai LC50 51,56 μg/ml. Penelitian ini menunjukan bahwa senyawa kimia
yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki range toksik, dapat diartikan pula bahwa
senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut memiliki potensi sitotoksik. Maka
dilakukan penelitian lanjutan dengan uji sitotoksisitas dengan menggunakan pelarut fraksi
yang sama. Dan diharapkan dapat lebih banyak menarik zat yang berpotensi sebagai anti
kanker.
Untuk uji sitotoksisitas penggunaan kultur sel semakin disenangi karena berbagai
alasan, diantaranya mampu menurunkan biaya percobaan yang mahal karena menggunakan
hewan, waktu yang diperlukan lebih cepat.
Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti uji dengan menggunakan
hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi
suatu obat pada manusia.
Uji sitotoksisitas ini menggunakan sel HeLa karena tujuan dari penelitian ini untuk
mencari obat untuk kanker serviks yang berasal dari bahan alam. Penggunaan sel HeLa ini
juga karena sel HeLa merupakan turunan dari sel epitel kanker leher rahim atau serviks
manusia dan sel HeLa cukup aman dan sering digunakan untuk kepentingan kultur sel.
Uji sitotoksisitas dengan metode perhitungan langsung dilakukan dengan
menggunakan hemositometer dengan pewarna biru tripan. Sel yang mati akan menyerap
warna biru tripan karena adanya kerusakan pada membran selnya, sedangkan pada sel yang
hidup biru tripan tidak dapat terserap karena membran sel masih dalam keadaan utuh. Sel
yang mati akan berbentuk bulat dan berwarna keruh dan sel yang hidup berbentuk bulat
panjang dan terlihat bening.
Cisplatin digunakan sebagai kontrol positif karena telah banyak digunakan sebagai
obat kanker leher rahim. Sitotoksisitas pemberiannya dapat terjadi pada setiap siklus sel
khususnya pada fase G1 dan S. Cisplatin yang masuk akan terikat pada N7 guanin DNA
membentuk hubungan melintang dan saling mengikat antara rantai – rantai DNA didalam inti
sel sehingga terjadi kerusakan DNA dan RNA sel. Kerusakan ini akan menyebabkan
penggandaan DNA terganggu dan proses proliferase akan terhambat.
Penelitian dilakukan dengan lama waktu inkubasi 24 jam dan 48 jam karena pada
inkubasi 24 jam akan diperoleh nilai LC50nya. Sedangkan pada pengujian dengan inkubasi 48
jam untuk mengetahui efektifitasnya sebagai senyawa sitotoksik.
120
100
80
60
40
20
0
y = 0,9398x + 32,158
r = 0,9074
y = 1,075x + 7,5399
r = 0,9605
0
20
40
60
80
konsentrasi (µg/ml)
Inkubasi 24 jam
Inkubasi 48 jam
Linear (Inkubasi 24 jam )
Linear (Inkubasi 48 jam )
Gambar 2. Grafik hubungan konsentrasi (µg/ml) dengan persen kematian
KESIMPULAN
Pada penelitian ini didapat LC50 pada fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% sebesar
34,9221 µg/ml . Berdasarkan nilai LC50 yang diperoleh dari kedua fraksi diketahui bahwa
buah pare memiliki sifat sitotoksisitas. Pada penelitian lanjutan dengan inkubasi 48 jam nilai
LC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% adalah 22,1871 µg/ml. Hasil penelitian
menunjukan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol 70% buah pare memiliki efek sitotoksik
terhadap sel HeLa dan memiliki potensi amat sangat toksik sehingga dapat dikembangkan
sebagai obat antikanker.
DAFTAR PUSTAKA
Departemen Kesehatan RI, 2008. Farmakope Herbal Indonesia Edisi 1. Departemen
Kesehatan RI, Jakarta. Hal 174-175
Diyah, Nurul W, dan Sukohardjono. 2000. Antikanker, dalam: Kimia Medisinal, ed. Kedua,
Airlangga University Press, Surabaya.
Direktorat Pengendalian Penyakit Tidak Menular. 2009. Buku Saku Pencegahan Kanker
Leher Rahim dan Kanker Payudara. Bakti Husada, Jakarta.Hal 1, 4-5.
E. Greer ,Benjamin,dkk. Cervical Cancer.2010. Journal Of The National Comprehensive
Cancer Network. Hal 1388,1408-1420.
Indrawati. 2009. Bahaya Kanker Bagi Wanita dan Pria Pengenalan, Penanganan, dan
Pencegahan Terhadap Kanker.AV Publisher, Jakarta Hal. 1-7, 164-180.
Khotimah, K.2004. Uji Sitotoksisitas dan Antiproliferasi Fraksi Petroleum Eter dan
Fraksi Etanol Kulit Batang Kamboja (Plumeria acuminate Ait) Terhadap Sel HeLa.
Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan.Yogyakarta. Hal.21.
Priyanto. 2009. Toksikologi Mekanisme, Terapi Antidotum, dan Penilaian Resiko.
Lembaga Studi dan Konsultasi Farmakologi, Jawa Barat. Hal.152.
Tati, S dan S. Subahar. 2004. Khasiat dan Manfaat Pare si Pahit Pembasmi Penyakit.
Agromedia Pustaka. Jakarta.