iNOS - Jurnal Online UM - Universitas Negeri Malang

PENGARUH PEMBERIAN PERASAN BUAH LABU SIAM
(Sechium edule (Jacq.) Sw.) TERHADAP EKSPRESI INDUCIBLE
NITRIC OXIDE SYNTHASE (iNOS) PADA MENCIT (Mus musculus)
HASIL INDUKSI STREPTOZOTOCIN (STZ)
Fadilatus Shoimah, Betty Lukiati, dan Nugrahaningsih
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Negeri Malang
Email: [email protected]
ABSTRAK: Diabetes Melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang ditandai
dengan peningkatan kadar glukosa darah (hiperglikemia) akibat defisiensi
insulin, penurunan sensitivitas jaringan terhadap insulin atau keduanya. Salah
satu indikator diabetes yaitu kerusakan sel beta pankreas yang diikuti dengan
peningkatan ekspresi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS). Labu siam
merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki potensi sebagai obat herbal
antidiabetes. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh perasan buah
labu siam terhadap ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit hasil induksi
Multiple Low Doze Streptozotocin (MLD-STZ). Dua puluh empat ekor mencit
berumur 8 minggu, berat 20±2 g dibagi menjadi 6 perlakuan dan 4 ulangan.
Kelompok mencit kontrol (tanpa induksi MLD-STZ), kelompok mencit hasil
induksi MLD-STZ tanpa diberi perasan buah labu siam, kelompok mencit hasil
induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dengan dosis 121 mg/20
gBB, 242 mg/20 gBB, 363 mg/20 gBB, dan 484 mg/20 gBB. Mencit diabetes
diperoleh dengan menginjeksikan MLD-STZ secara intraperitoneal selama 10
hari berturut-turut. Perasan buah labu siam diberikan secara oral selama 14 hari.
Ekspresi iNOS diamati menggunakan teknik imunohistokimia. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa perasan buah labu siam memiliki kecenderungan untuk
menurunkan ekspresi iNOS pada sel beta pankreas, namun tidak signifikan.
Kata kunci: diabetes melitus, perasan buah labu siam, inducible nitric oxide
synthase (iNOS), streptozotocin, mencit (Mus musculus).
ABSTRAK: Diabetes Mellitus (DM) characterized by increasing blood glucosa
levels (hyperglicemia) due insulin deficiency, decreased sensitivity insulin in
tissue or both. Indicator of diabetes such as pancreatic beta cell damage,
followed by increased of inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) expression.
Chayote is one of the plants that have potential as a herbal medicine of
antidiabetic. The aims of the study is determine the effect of the chayote fruit
juice in iNOS expression in pancreatic beta cells mice induced by Multiple Low
Doze Streptozotocin (MLD-STZ). Chayote fruit juice dose 121, 242, 363, and
484 mg/20 gBW by oral administration for 14 consecutive days. The result
showed that chayote fruit juice has no effect againts of iNOS expression in
pancreatic beta cells, however have tendency to decrease of iNOS expression in
pancreatic beta cells.
Kata kunci: diabetes mellitus, chayote fruit juice, inducible nitric oxide synthase
(iNOS), streptozotocin, mice (Mus musculus).
Diabetes Melitus (DM) adalah penyakit yang ditandai dengan
meningkatnya kadar glukosa darah di atas batas normal (hiperglikemia) akibat
berkurangnya sekresi insulin, resistensi insulin atau keduanya (American Diabetes
Assosiation, 2004). World Health Organization (WHO) menggolongkan penyakit
DM sebagai penyakit kronik yang umum hampir terjadi di setiap negara dan
selalu mengalami peningkatan setiap tahun (Whiting et al., 2011; Canadian
Diabetes Assosiation, 2013). Indonesia menempati urutan ke 4 dunia dengan
jumlah penderita diabetes sebesar 8,4 juta pada tahun 2000 dan diperkirakan
meningkat pada tahun 2030 sebesar 21,3 juta (Wild et al., 2014).
Dua tipe utama DM yaitu DM tipe 1 dan DM tipe 2. Diabetes tipe 1
disebabkan berkurangnya sekresi insulin akibat kerusakan sel beta pankreas yang
didasari oleh proses autoimun (Whiting et al., 2011). Nugroho (2006)
menjelaskan bahwa kerusakan sel beta pankreas dapat disebabkan oleh infeksi
virus, pemberian senyawa toksin, diabetagonik (streptozotocin, aloksan), atau
secara genetik. Diabetes tipe 2 merupakan diabetes yang disebabkan oleh
resistensi insulin yaitu turunnya kemampuan insulin untuk merangsang
pengambilan glukosa oleh jaringan perifer (Ndraha, 2014). Pengobatan oral
dengan berbagai macam obat sintetis dapat diandalkan untuk penderita DM
(Bastaki, 2005). Cara ini dapat menimbulkan efek samping jika digunakan dalam
jangka waktu panjang yaitu dapat menyebabkan kerusakan organ lainnya. Back to
nature merupakan alternatif yang dapat dikembangkan dengan memanfaatkan
senyawa bioaktif dalam tumbuhan.
Labu siam merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki potensi sebagai
obat antidiabetes. Penelitian Maity et al. (2013) pemberian ekstrak etanol buah
Sechium edule secara signifikan dapat menurunkan kadar glukosa darah pada
tikus diabetes yang diinduksi aloksan. Aini et al. (2014) menyatakan bahwa
ekstrak etanol labu siam memiliki aktivitas antioksidan, serta memiliki kandungan
total fenol sebesar 0,78%. Mukminin (2016) menjelaskan bahwa perasan buah
labu siam dapat menurunkan kadar glukosa darah mencit hasil induksi STZ.
Penelitian tersebut juga menjelaskan bahwa perasan buah labu siam (Sechium
edule (Jacq.) Sw.) memiliki aktivitas antioksidan sangat kuat, dengan IC50
34,35567 µg/ml, serta terdeteksi mengandung senyawa polifenol dan flavonoid.
Penelitian bertujuan untuk mengeksplor potensi perasan buah labu siam (Sechium
edule (Jacq.) Sw.) terhadap ekspresi iNOS pada sel beta pankreas mencit hasil
induksi Multiple Low Dose Streptozotocin (MLD-STZ).
METODE
Penelitian yang akan dilakukan ini merupakan penelitian eksperimental.
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Rancangan Acak
Lengkap (RAL) yang terdiri dari enam perlakuan dan empat ulangan. Penelitian
ini dilakukan pada bulan Oktober 2015 sampai Mei 2016. Penelitian dilakukan di
pemeliharaan hewan coba Jurusan Biologi FMIPA Universitas Negeri Malang,
Laboratorium Biosciense Universitas Brawijaya.
Persiapan Hewan Uji
Sebanyak 24 ekor mencit (Mus musculus) jantan galur Balb/c dalam
keadaan sehat, berat 20±2 gram, umur 8-10 minggu. Mencit terlebih dahulu
diaklimatisasi selama satu minggu, diberi pakan pellet susu A, dan diberi air
minum secara ad libitum.
Persiapan Pembuatan Perasan Buah Labu Siam
Buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) yang digunakan yaitu yang
muda (siap panen). Pembuatan perasan buah labu siam dilakukan dengan cara
buah dikupas kulitnya dan diambil daging buahnya, kemudian ditimbang,
dipotong-potong dan diparut kemudian disaring dengan kertas saring.
Preparasi Mencit DM
Mencit DM diperoleh dengan cara injeksi MLD-STZ dosis 20 mg/kgBB
secara intraperitoneal selama 10 hari berturut-turut. Mencit dikatakan DM jika
kadar glukosa darah puasa melebihi 126 mg/dl.
Perlakuan Hewan Uji
Hewan uji dibagi menjadi 6 kelompok, masing-masing kelompok 6
ulangan. Kelompok mencit sehat (tanpa injeksi MLD-STZ), kelompok mencit
hasil induksi MLD-STZ tanpa diberi perasan buah labu siam, kelompok mencit
hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 121 mg/20
gBB, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi perasan buah labu
siam dosis 242 mg/20 gBB, kelompok mencit hasil induksi MLD-STZ yang diberi
perasan buah labu siam dosis 363 mg/20 gBB, dan kelompok mencit hasil induksi
MLD-STZ yang diberi perasan buah labu siam dosis 484 mg/20 gBB.
Pemberian perasan buah labu siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) dilakukan
secara oral. Kadar glukosa darah mencit diukur sebelum perlakuan pada hari
kelima dan kesepuluh menggunakan glukometer. Mencit diberi perlakuan selama
14 hari setelah mencit mengalami DM. Glukosa darah mencit diukur kembali
pada hari kelimabelas dari awal pemberian perlakuan. Pada akhir perlakuan/hari
kelimabelas mencit didislokasi dan dibedah untuk diambil organ pankreas.
Selanjutnya, pankreas dibuat preparat dan dilakukan pewarnaan imunohistokimia
untuk mengamati ekspresi iNOS.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) sel beta pankreas mencit
hasil induksi STZ diamati pada jaringan pankreas dengan teknik
immunohistokimia, yang ditunjukkan dengan warna kecoklatan. Hasil
pengamatan ekspresi iNOS sel beta pankreas seperti pada Gambar 1.
A
B
C
D
E
F
Gambar 1. Distribusi iNOS Sel Beta Pankreas Mencit metode imunohistokimia perbesaran
400x (
: sel beta yang mengekspresikan iNOS,
: sel beta yang tidak
mengekspresikan iNOS)
Keterangan:
A = Sel beta pankreas mencit kontrol (tanpa STZ)
B = Sel beta pankreas mencit diabetes (Pemberian MLD-STZ)
C = Sel beta pankreas mencit perlakuan 1 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah
labu siam dosis 121 mg/20gBB)
D = Sel beta pankreas mencit perlakuan 2 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah
labu siam dosis 242 mg/20gBB)
E = Sel beta pankreas mencit perlakuan 3 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah
labu siam dosis 363 mg/20gBB)
F = Sel beta pankreas mencit perlakuan 4 (Pemberian MLD-STZ + perasan buah
labu siam dosis 484 mg/20gBB)
Jumlah sel beta yang mengekspresikan iNOS pada mencit hasil induksi
MLD-STZ menunjukkan peningkatan dibandingkan dengan mencit kontrol. Sel
beta pankreas mencit yang tidak diinduksi MLD-STZ (kontrol) menunjukkan
warna coklat dalam jumlah sedikit, sedangkan warna coklat semakin bertambah
pada sel beta pankreas mencit yang diinduksi MLD-STZ. Sel beta pankreas
mencit yang telah diberi perasan buah labu siam dengan variasi dosis
menunjukkan warna coklat semakin berkurang.
Presentase ekspresi iNOS diperoleh dengan cara menghitung jumlah sel
beta yang berwarna coklat dibandingkan dengan jumlah keseluruhan sel beta
pada 3 bidang pandang. Rerata presentase ekspresi iNOS disajikan dalam bentuk
diagram batang (Gambar 2.).
Gambar 2. Diagram Batang Rerata presentase Ekspresi iNOS Sel Beta Pankreas Mencit
Setelah Pemberian Perasan Buah Labu Siam
Diagram tersebut menunjukkan bahwa rerata persentase ekspresi iNOS
pada mencit hasil induksi STZ lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol (tanpa
pemberian STZ). Mencit hasil induksi STZ yang telah diberi perasan buah labu
siam pada dosis 121 mg/20 gBB, 242 mg/20 gBB, 363 mg/20 gBB, dan 484
mg/20 gBB menunjukkan penurunan ekspresi iNOS pada sel beta pankreas
dibandingkan dengan mencit yang tidak diberi perasan buah labu siam. Pemberian
perasan buah labu siam dengan dosis 121 mg/20 gBB mampu menurunkan
ekspresi iNOS sel beta pankreas mendekati mencit kontrol.
Hasil analisis Anova menunjukkan nilai F sebesar 2,232 > 2,77 (Ftabel)
dengan signifikasi 0,096 (p>0,05). Hasil tersebut menunjukkan bahwa pemberian
perasan buah labu siam tidak berpengaruh secara signifikan terhadap penurunan
ekspresi iNOS sel beta pulau langerhans pankreas mencit hasil induksi STZ,
sehingga tidak dilakukan uji lanjut.
Pembahasan
Hasil penelitian menunjukkan rerata presentase ekspresi iNOS pada sel
beta pankreas mencit yang diinduksi STZ lebih tinggi dibandingkan ekspresi
iNOS pada sel beta pankreas mencit kontrol. Peningkatan ekspresi iNOS pada
mencit yang diinduksi STZ disebabkan STZ memicu pembentukan radikal bebas
yang dapat menginduksi sintesis iNOS. Lenzen (2008) menjelaskan bahwa STZ
merupakan penyumbang radikal bebas yang dapat merusak biomakromolekul
seperti lipid, fosfolipid, dan karbohidrat serta DNA yang berada di dalam inti sel.
Streptozotocin dapat masuk sel beta pankreas melalui transporter glukosa 2
(GLUT 2) karena struktur kimianya mirip dengan glukosa.
Peningkatan ekspresi iNOS sel beta pankreas dapat dikaitkan dengan
adanya peningkatan radikal bebas yang dapat memicu respon imun. Reuter (2010)
menyatakan bahwa stres oksidatif dapat mengaktifkan beberapa faktor transkripsi,
diantaranya Nuclear Factor Kappa B (NFkB). Aktivasi faktor transkripsi tersebut
dapat memicu ekspresi beberapa gen berbeda seperti growth factors, sitokin,
kemokin, dan molekul anti inflamasi. Nuclear Factor Kappa B dalam bentuk
tidak aktif di sitosol berikatan dengan Inhibitor Kappa B (IkB) membentuk
kompleks IkB-NFkB. Stres oksidatif akan mendegradasi IkB-NFkB, akibatnya
NFkB bebas ditransfer ke nukleus dan dapat menginduksi ekspresi iNOS (Aktan,
2003).
Kleinert et al. (2003) menjelaskan bahwa sitokin seperti interferon-γ (IFNγ), interleukin 1β (IL-1β), interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF- α)
juga dapat menginduksi iNOS. Sitokin akan melakukan respon imun dengan
mengaktifkan iNOS dan membentuk NO dalam jumlah banyak pada tingkat
transkripsi melalui aktivasi faktor transkripsi NFkB (Aktan, 2003). Keterkaitan
antara kerusakan sel beta pankreas akibat induksi STZ dengan meningkatnya
ekspresi iNOS dapat digambarkan pada Gambar 3.
Gambar 3. Keterkaitan Kerusakan Sel Beta Pankreas Mencit akibat Induksi STZ dengan
Peningkatan iNOS serta Mekanisme Perbaikan Sel Beta Pankreas oleh Rutin
(
: meningkatkan;
: menghambat)
Nilai rerata presentase ekspresi iNOS mencit hasil induksi STZ setelah
pemberian perasan buah labu siam menunjukkan adanya penurunan, pada dosis
121 mg/20 gBB penurunan hampir mendekati mencit kontrol. Efek penurunan
ekspresi iNOS dapat disebabkan adanya kandungan senyawa aktif pada buah labu
siam. Kandungan tersebut dapat berperan sebagai antioksidan yang mampu
melawan radikal bebas sehingga mengurangi ekspresi iNOS.
Penelitian sebelumnya oleh Mukminin (2016) menunjukkan perasan buah
labu siam mengandung peonidin yang termasuk senyawa polifenol dan rutin yang
termasuk senyawa flavonoid serta memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi
dengan IC50 sebesar 34,35567 µg/mL. Aktivitas antioksidan yang tinggi ini dapat
dikaitkan dengan struktur kimia flavonoid dan polifenol yang memiliki banyak
gugus hidroksil (OH). Saxena et al. (2012) menjelaskan bahwa flavonoid dan
polifenol memiliki karakteristik struktur kimia dengan cincin aromatik dan
banyak gugus fenol (OH). Senyawa tersebut dapat melawan kerusakan oksidatif
pada penyakit degeneratif seperti diabetes, inflamasi dan kanker. Polifenol dapat
mengurangi ekspresi iNOS dan pelepasan NO melalui penghambatan aktivasi
faktor transkripsi (Vauzour et al., 2010).
Rutin sebagai senyawa golongan flavonoid memiliki kemampuan sebagai
antioksidan untuk melindungi sel dari pengaruh ROS seperti superoksida, radikal
peroksil, radikal hidroksil dan peroksinitrit (Gupta et al., 2014). Penelitian
sebelumnya oleh Korkmaz dan Kolanyaka (2013) menyebutkan bahwa rutin dapat
menghambat aktivitas iNOS pada ginjal tikus yang mengalami iskemia. Aktivitas
antioksidan rutin dapat dikaitkan dengan struktur fenol yang dimiliki rutin.
Senyawa fenol (sistem aromatik dan gugus –OH) serta ikatan rangkap
terkonjugasi merupakan struktur yang diperlukan dalam menangkal radikal bebas.
Gugus OH yang banyak pada rutin memungkinkan rutin dapat mendonorkan atom
hidrogen ke radikal bebas. Gugus hidrogen dari senyawa flavonoid dapat
berikatan dengan radikal bebas dan mengubah radikal bebas yang reaktif menjadi
lebih stabil. Transfer atom hidrogen dapat mengurangi dan mencegah
pembentukan radikal bebas, akibatnya aktivasi faktor transkripsi NFkB dapat
ditekan (Aulanni’am et al.,2012; Gulcin, 2012)
Kim et al. (2013) menjelaskan bahwa rutin dapat menghambat aktivasi
NF-kB dan Activator Protein 1 (AP-1). Penghambatan aktivasi NFkB ini dapat
menghambat ekspresi gen iNOS dan gen sitokin, sehingga ekspresi iNOS juga
akan berkurang dan sel dapat mengalami perbaikan. Rutin memperlihatkan
aktivitas antidiabetik melalui penghambatan sitokin inflamasi (IL-6 dan TNF-α),
meningkatkan antioksidan, dan profil plasma lipid (Niture et al., 2014).
SIMPULAN
Perasan buah labu siam memiliki kecenderungan untuk menurunkan
ekspresi iNOS sel beta pankreas mencit hasil induksi MLD-STZ, namun secara
statistik tidak signifikan.
DAFTAR RUJUKAN
Aini, K., Betty, L. & Balqis. 2014. Skrining Fitokimia dan Penentuan Aktivitas
Antioksidan Serta Kandungan Total Fenol Ekstrak Buah Labu Siam
(Sechium edule (Jacq.) Sw.). Prosiding Seminar dan Workshop Nasional
Biologi/IPA dan Pembelajarannya. 1004-1009. Malang: FMIPA UM.
Aktan, F. 2004. iNOS-Mediated Nitric Oxide Production and Its Regulation. Life
Sciences, 75: 639-653.
American Diabetes Association. 2004. Diagnosis and Classification of Diabetes
Mellitus. Diabetes Care, 27: 6-10.
Aulanni’am, A., Roosdiana & Rahmah, N.L. 2012. The Potency of Sargassum
duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus
norvegicus. Journal of Sciences, 6: 144-154.
Bastaki, S. 2005. Diabetes Mellitus and its Treatment. International Journal
Diabetes & Metabolism, 13: 111-134.
Canadian Diabetes Association. 2013. Reducing the Risk of Developing Diabetes.
Canadian Journal of Diabetes, 37: S16-S17.
Dewi, D.R., Aulanni’am & Roosdiana, A. 2013. Studi Pemberian Ekstrak Rumput
Laut Coklat (Sargassum prismaticum) terhadap Kadar MDA dan Histologi
Jaringan Pankreas pada Tikus (Rattus norvegicus) Diabetes Melitus Tipe 1
Hasil Induksi MLD-STZ (Multiple Low Dose-Streptozotocin). Kimia
Student Journal, 2 (1): 351-357.
Gulcin, I. 2012. Antioxidanr Activity of Food Constituents: an Overview.
Archieves of Toxicology, 86: 345-391.
Gupta, N., Cahuhan, R.S. & Pradhan. 2014. Rutin: A Bioactive Flavonoid.
Handbook of Medical Plants and Their Bioactive Compounds, 51-57.
Kim, J.H., Kim, B.B., Lee, K.W., & Kang, N.J. 2013. Protective Effect of Rutin
againts Ultraviolet B-induced Cyclooxygenase-2 Expression in Mouse
Epidermal Cells. Food Scence and Biotechnol, 22(5): 1429-1434.
Kleinert, H., Schwarz, P.M., Förstermann, U. 2003. Regulation of the Expression
of Inducible Nitric Oxide Synthase. Biological Chemistry, 384: 1343-1364.
Korkmaz, A. & Kolankaya, D. 2013. Inhibiting Inducible Nitric Oxide Synthase
with Rutin Reduces Renal Ischemia/Reperfusion Injury. Journal of the
Canadian Chiropractic, 56 (1): 6-14.
Lenzen, S. 2008. The Mechanisms of Alloxan and Streptozotocin-Induced
Diabetes. Diabetagonia, 51 (2) :216-226.
Maity, S., Firdous, S.M. & Debnath, R. 2013. Evaluation of Antidiabetic Activity
of Ethanolic Extract of Sechium edule Fruits in Alloxan-Induced Diabetes
Rats. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 2(5): 36123621.
Mukminin, L.H. 2016. Identifikasi Senyawa Bioaktif dan Uji Antioksidan Perasan
Labu Siam (Sechium edule (Jacq). Sw.) untuk Terapi Mencit Balb/C
Diabetes Hasil Induksi Streptozotocin. Skripsi tidak diterbitkan. Malang:
Universitas Negeri Malang.
Ndraha, S. 2014. Diabetes Melitus Tipe 2 dan Tatalaksana Terkini. Medicinus,
27(2): 9-16.
Niture, N.T., Ansari, A.A., & Naik S.R. 2014. Anti-hyperglycemic Activity of
Rutin in Streptozotocin-induced Diabetic Rats: An Effect Mediated through
Cytokines, Antioxidants and Lipid Biomarkers. Indian Journal of
Experimental Biology, 52: 720-727
Nugroho, A.E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Mellitus: Patologi dan
Mekanisme Aksi Diabetagonik. Biodiversitas, 7(4): 378-382.
Reuter, S., Gupta, S.C., Chateurvedi, M.M., & Aggarwal, B.B. 2010. Oxidative
Stress, Inflamation, and Cancer: How are they Linked?. Free Radic Biol
Med, 49 (11): 1603-1616.
Saxena,M., Saxena, J. & Pradhan, A. 2012. Flavonoids and Phenolic Acids as
Antioxidants in Plants and Human Health. International Journal
Pharmacheutical Sciences Review and Research, 16(2): 130-134.
Vauzour, D., Mateos, A.R., Corona, G., Concha, M.J.O., & Spencer, J.P.E. 2010.
Polyphenols and Human Health: Prevention of Disease and Mechanisms of
Action. Nutrients, 2: 1106-1131.
Whiting, D.R., Guariguata, L., Weil, C., & Shaw, J. 2011. IDF Diabetes Atlas:
Global Estimates of the Prevalence of Diabetes for 2011 and 2030. Diabetes
Research and Clinical Practice, 94: 311-321.
Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., & King, H. 2004. Global Prevalence of
Diabetes: Estimates for year 2000 and Projections for 2030. Journal
Diabetes Care, 27 (5): 47-53.