kromatografi-pndhluan

Adalah suatu teknik pemisahan atas dasar
perbedaan sifat fisik dan kimiawi dari zat
penyusun suatu campuran
Adanya tendensi molekul suatu zat untuk :
- larut dalam suatu cairan
- teradsorpsi pd butir zat padat yg halus dg
permukaan yg luas
- masuk ke fase uap atau menguap
JENIS KROMATOGRAFI
 Kromatografi Lapis Tipis
 Kromatografi kolom :




Kromatografi adsorbsi
Kromatografi partisi cair-cair
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi filtrasi gel
 Kromatografi Gas Cairan
POLARITAS
Adanya pemisahan kutub muatan positif
dan negatif dr suatu molekul sbg akibat
terbentuknya konfigurasi tertentu dr atomatom penyusunnya.
Dg dmkn molekul tsb dpt tertarik oleh
molekul yg lain yg jg mempunyai polaritas.
Tingkat pemisahan dr muatan tsb
menentukan derajat polaritasnya, dmkn jg
daya tariknya.
Sifat polaritas, khususnya digunakan sbg
petunjuk sifat zat pelarut, adsorben dan
senyawa-senyawa yg dipisahkan (solute).
Air termasuk zat pelarut & mempunyai
polaritas terbsr krn konfigurasi elektron
dan geometri molekulnya dpt
menghasilkan dipol permanen yang
sangat kuat.
ADSORBEN & PELARUT
Dpt bersifat polar atau non polar
Adsorben polar = silika & alumina, dpt
mengadsorp solut yg bersifat polar.
Adsorben non polar = arang (charcoal)
POLARITAS RELATIF
BERBAGAI ZAT PELARUT
Konstanta dielektrik
1,890
2,023
2,238
2,284
4,806
4,340
6,020
20,700
24,300
33,620
80,370
Nama zat Pelarut
Petroleum eter, heksan, heptan
Sikloheksan
Karbon tetraklorida, Trikloroetilen, Toluen
Benzen, diklorometan,
Kloroform
Etil eter
Etil asetat
Asdeton, n-propanol
Etanol
Metanol
Air
ADSORBSI & PARTISI
Keduanya dipengaruhi oleh perbedaan
polaritas solute yang dipisahkan
Polaritas mrpkn faktor yg
menentukan daya larut dan
terjadinya adsorbsi solute
NO
KROMATOGRAFI
ADSORBSI
1
Sangat peka thd bntk
stereometrik suatu
senyawa.
2
Adsorben mempunyai
polaritas konstan &
pelarut dpt diatur
polaritasnya sesuai
kebutuhan
U/pemisahan dlm
kuantitas lbh besar
3
4
U/ pemisahan senyawa
kurang polar
(hidrokarbon)
KROMATOGRAFI
PARTISI
Sangat trgantung pd daya
larut (BM) senyawa dlm suatu
pelarut.
Kedua fasenya lbh sulit u/
diatur polaritasnya.
Baik u/pemisahan solut yg
sangat serupa sifatnya, bersft
kualitatif.
U/ pemisahan senyawa yang
lebih polar (karbohidrat &
protein)
ADSORBEN
Silika gel
 bersifat asam dan berfungsi untuk memisahkan
senyawa yang bersifat asam
 digunakan untuk kromatografi lapis tipis (KLT).
Alumina
 bersifat basa dan berfungsi untuk memisahkan
senyawa yang bersifat basa.
 digunakan untuk kromatografi kolom
Mrpkn kromatografi adsorbsi dan
adsorben bertindak sbg fase stasioner.
Dapat digunakan untuk memisahkan :
 ion-ion organik
 komplek senyawa organik dg anorganik
 senyawa organik alami dan sintetis
 Pemisahan lebih sempurna, kepekaan
tinggi dan dpt dilakukan dg cepat
Gambar KLT
ADSORBEN




Silika gel ( asam silikat )
Alumina ( aluminum oxyde )
Kieselguhr (diatomeous earth)
Selulosa
 Silika Gel G
 mengandung 13% Kalsium Sulfat sebagai zat perekat
 biasanya mengandung ion logam (besi) dihilangkan dg
pelarut metanol : asam HCl pekat = 9 : 1
 Silika Gel H
 digunakan untuk pemisahan yang spesifik, terutama
lipida netral.
 dpt memisahkan berbagai digliserida spt 1,2 digliserida
dari 1,3 digliserida; fosfatidil gliserol dari poligliserida
fosfat.
 Silika Gel PF
 senyawa organik yg terikat dpt berfluoresensi.
 Mampu memisahkan bermacam senyawa
terpen, alkaloid, steroid,alisiklik, alifatik
dan aromatik
 Tidak mengandung zat perekat
 Sifat sedikit alkalis
 Dapat digunakan dengan ataupun tanpa
aktivasi
 untuk pemisahan senyawa polar.
PEMBUATAN PLAT
 Untuk KLT Mikro
 Mis. Silika gel G = 35 gram adsorben dilarutkan dalam
100 ml zat pelarut kloroform-metanol (2:1 v/v).
 Plat kaca dicelupkan dalam larutan tsb.
 Diuapkan selama 5-10 mnt u/ mencegah retak pd
lapisan adsorben atau terjadinya case hardening.
 Untuk KLT Makro
 Suspensi adsorben silika gel H dicampur dg air = 30 g
/ 60-70 ml air
 Plat berukuran 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, dan 20 x 20 cm.
 Keuntungannya : adsorben dapat melekat lebih baik,
dpt dibuat lebih tebal u/ kepentingan tertentu, dapat
dilaksanakan pada tempat yg lebih luas
Kerugiannya : pembuatan lebih sukar & perlu aktivasi
plat dg pemanasan 110oC selama 1 jam.
Cara pembuatan plat yg besar :
 plat kaca dicuci dg detergen, dibilas dg
aquades & dikeringkan.
 Suspensi adsorben yg telah dibuat dilapiskan
pd permukaan plat kaca menggunakan
aplikator (Stahl Desaga).
 Tebal lapisan antara 250 mm – 2mm
 Plat yg sudah terlapis sebelum di aktifkan
harus didiamkan dulu pada suhu kamar selama
+ 30 menit.
MENETESKAN SAMPEL
 Gunakan luas plat sesuai kebutuhan
 Buat garis dg jarak 8 – 10 mm (u/ plat mikro) dan 1,5 – 2,0
cm (u/ plat makro) dar dasar plat.
 Sampel dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap
(ttk didihnya 50 – 100oC)
 Larutan sampel diteteskan pada plat menggunakan pipet
mikro atau syringe dan dibiarkan mengering sebelum
tetesan berikutnya dikerjakan.
 Jumlah sampel yang diteteskan dpt berkisar antara 5100mg dari larutan 0,1 %
 Pengeringan tetesan sampel menggunakan gas N2 untuk
mencegah terjadinya kerusakan sampel karena oksidasi.
PENGEMBANGAN
 Menggunakan wadah tertutup yg berisi
senyawa pelarut.
 Mencelupkan dasar plat yg telah ditetesi
sampel dalam sistem pelarut.
 Pemilihan sistem pelarut atas dasar like
dissolves like, misalnya untuk memisahkan
lipida digunakan sistem pelarut heksan : eter :
asam asetat = 80 : 20 : 1
 Pengembangan di akhiri bila ujung zat pelarut
pada plat telah mencapai + ¾ tinggi adsorben
(15 – 16 cm)
 Pengeringan plat dg aliran gas N2
METODE PENGEMBANGAN
 Pengembangan satu dimensi
 Berjalan 1 arah dg 1 macam sistem pelarut
 Pengembangan dua dimensi
 Dikerjakan 2 arah
 Sampel di teteskan di pojok kanan bawah ( 2 cm
dari kanan & bawah) untuk plat 20 x 20 cm
 Setelah pengembangan I selesai, plat dikeringkan
dg gas N2
 Setelah kering, plat dikembangkan lagi dg
menggunakan sistem pelarut yang ke II dg
memeutar plat 90o.
Pengembangan ganda
 Dikerjakan searah (1 dimensi) dan
dilaksanakan beberapa tahap (umumnya 2
tahap)
 Sistem pelarut yg digunakan berbeda
 Masing-masing tahap pengembangan di akhiri
dg pengeringan sblm dilakukan pengembangan
berikutnya.
 Mis. Pemisahan lipida netral dan lipida polar .
Pengembang I = kloroform : metanol : aquades
= 60 : 25 : 4, dihentikan setelah permukaan
pelarut mencapai 10 cm. Setelah pengeringan,
dikembangkan lagi dg sistem pelarut Heksan :
Eter = 4 : 1.
VISUALISASI DAN IDENTIFIKASI
 Untuk melihat komponen penyusun yg sudah
terpisah setelah proses pengembangan
 Bersifat destruktif dan non destruktif
o destruktif akan merusak sampel secara irreversible (u/
pengukuran kuanti & kualitatif)
o nondestruktif baik u/KLT preparatif & pengukuran
kuantitatif
 Bersifat umum dan spesifik
 Identifikasi
o membandingkan posisi spot dg senyawa standar
o visualisasi khusus (mis. Dg ninhidrin, senyawa yg
mengandung gugus amino akan menunjukkan spot
kuning jingga)
 Uap iodium
 Spot akan berwarna coklat dg dasar putih
 Tidak merusak komponen yg telah terpisah
 Dpt digunakan u/semua senyawa organik yg tidak
jenuh (dg ikatan rangkap)
 Sinar UV
 memberikan fluoresensi pd plat yg mengandung unsur
fosfor
 sifatnya non destruktif
 Charring
 penyemprotan plat dg lar H2SO4/K2Cr2O7 kmdn
dipanaskan pd suhu 125oC
 Zat organik akan mengalami oksidasi menjadi karbon
yang berwarna hitam
Reagensia umum
(terbatas u/ senyawa organik yg non volatil)
 H2SO4 pekat
 senyawa organik akan mjd spot hitam
 H2SO4 - Na2Cr2O7
 senyawa organik akan mjd spot hitam
 H2SO4 - K2Cr2O7
 senyawa organik akan mjd spot hitam
 H2SO4 – HNO3
 senyawa organik akan mjd spot hitam
 HClO4
 senyawa organik akan mjd spot hitam
 Iodium
 senyawa organik akan mjd spot coklat
Reagen Spesifik
 Untuk mendeteksi secara kualitatif &
mengenal adanya gugus tertentu dalam
senyawa yg dipisahkan.
 Reagensia ini bersifat destruktif
 Anilin pthalat
• Spot yg terdiri dari gula-gula reduksi akan
memberikan berbagai warna
 Anisaldehid dlm H2SO4 dan HOAc
• Senyawa ini untuk menunjukkan adanya karbohidrat.
• Karbohidrat menunjukkan warna biru
 Antimon triklorida dalam CHCl3
• Senyawa ini mendeteksi adanya senyawa steroid,
steroid glikosida,lipida alifatik,dan vit A.
• Zat tsb dg UV akan menunjukkan berbagai warna
tertentu
 Bromokresol jambon
• Untuk pengenalan ion-ion halogen kec. F & asam
dikarboksilat
• Senyawa tsb akan menunjukkan warna kunin atau
jingga
 Bromokresol hijau
• Pengenal asam karboksilat
• Senyawa tersebut akan memberikan warna
kuning/jingga
 2,4 Dinitrofenilhidrazin (2,4 DPNH)
• Pengenal aldehid dan keton yg akan membentuk
warna kuning sampai kemerahan.
 Reagensia Dragendorf
• Pengenal berbagai alkaloid dan basa organik
(mberikan warna orange)
 Feri Klorida
• Senyawa fenol & menunjukkan berbagai warna.
Fluorescein-Br2
• Pengenal senyawa organik tidak jenuh ( Dg UV
akan menunjukkan warna tertentu)
8-Hidroksiquinolin-NH3
• Pengenal kation anorganik (dg UV akan terlihat
berbagai warna)
Ninhidrin
• Gugus amino akan berwarna biru.
Profil KLT fraksi aktif
ekstrak daun pecut kuda (S. jamaicensis)
Fase gerak : CHCi3 : MeOH : EtOAc (9:3:5) ;
Fase diam = Silika Gel F254;
H fraksi heksan, C fraksi kloroform, E fraksi etil
Reagen fosfomolibdat u/ deteksi senyawa
terpenoid dan warna yg dihasilkan adlh
hijau kebiruan.
Reagen H2SO4 u/ deteksi senyawa
terpenoid yg akn mnghslkn warna spot
coklat, hijau, kuning, merah atau biru. Pd
perlakuan H2SO4 50% kmdn dipanaskan
suhu 100-110oC selama 5 mnt,mnghslkn
spot coklat
JENIS KLT
A. KLT Preparatif
 Tebal adsorben 1 – 1,5 mm (makin tebal,
pemisahannya makin sulit)
 Pengeringan adsorben harus optimal u/mencegah
case hardening dan retak.
 2 ml sampel (50-250 mg) diaplikasikan dg cara
menggariskan setebal 5-8 mm pada garis dasar
(tidak smp merusak adsorben)
 Cara visualisasi yg dipakai dg non destruktif,
terutama dg UV, penyemprotan dg air atau uap
iodium.
 Komponen terpisah dikerok, diletakkan dlm corong
dg kertas filter
 Diekstrak dg pelarut yang polaritasnya sesuai.
B. KLT Kuantitatif, dilakukan pendekatan dg :
 Analisa langsung pada plat, dengan :
 Charring secara standar, kmd digunakan
densitometer untuk menentukan kuantitasnya
 Pengukuran radioaktivitasnya, khususnya
senyawa yg ditandai dg radioaktif
 Dengan neutron activation analysis

Gravimetri : masing2 komponen diisolasi, diekstrak,
diuapkan dan ditimbang.

Menganalisis elemen-elemen spesifik atau gugus
fungsional dengan spektrofotometer.
C. KLT dengan argentasi
 U/ pemisahan senyawa yang mempunyai jumlah ikatan
rangkap yang berbeda & isomer cis dan trans dr asam
lemak.
 Plat adsorben mengandung AgNO3 :
 Mencelup plat KLT ke dalam larutan AgNO3 1012%,atau
 Menambahkan larutan AgNO3 dlm pembuatan
larutan adsorben
 Sistem pelarut campuran heksan eter dg proporsi yg
bervariasi tergantung jumlah ketidak jenuhan
senyawanya
 u/ memisahkan monoenoat (ik. Rangkap 1) = 93 : 7
 u/ dienoat (ik. Rangkap 2) = 83 : 17
 u/ monoena, diena, triena, tetraena, pentaena,
heksaena dari metil esternya = 60 : 40.
Komponen lipida polar kacang tanah yg
dipisahkan dg TLC dua dimensi
I. Kloroform : Metanol : 28% amonia = 65 : 25 : 5 (v/v)
II. Kloroform : Aceton : Metanol : HAc : Air = 3 : 4 : 1 : 1 : 0,5 (v/v)
X1, X2, X3, X4, tidak diketahui; PE = Fosfatidil etanolamin, PI =
Fosfatidil Inositol, PS = Fosfatidil Serin, LPE = Lisofosfatidil
Etanolamin, LPC = Lisofosfatidil Kolin dan PA = Asam fosfatidat
Contoh hasil pengembangan ganda