3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni 2009 hingga Januari 2010
bertempat di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Laboratorium Karakteristik
Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, dan Balai Penelitian Tanah.
3.2 Bahan dan Alat
Sumber sedimen laut yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari
perairan Teluk Jakarta (Lampiran 1) yang diambil pada bulan Juni. Tempat
pengambilan sedimen laut dilakukan menggunakan Ekman grab yang telah diikat
dengan tali tambang berskala, pada jarak 200 m dari garis pantai dan kedalaman
±4 m. Sedimen kemudian dikemas dengan kantong plastik dan diikat. Selain itu
juga dilakukan pengambilan air laut pada lokasi yang sama (Holmes et al. 2004).
Semua sampel sedimen dan air laut yang telah diambil disimpan pada cool box
dengan suhu 5-10 °C.
Bahan-bahan yang digunakan untuk pretreatment terhadap elektroda
adalah HCl 1 N, NaOH 1 N, dan akuades. Bahan-bahan yang digunakan untuk
penyusunan SMFC adalah air laut yang diperoleh dari lokasi yang sama dengan
pengambilan sampel sedimen dan air deionisasi. Bahan-bahan yang digunakan
untuk karakterisasi sedimen laut dan substrat SMFC meliputi akuades, air bebas
ion, air bebas ion yang bebas CO2, NaCl, KCl, HCl, larutan ekstraksi Olsen,
karbon hitam, amonium asetat, kalium dikromat, larutan standar 5000 ppm C,
etanol 96 %, pasir kuarsa bersih, filter pulp. Bahan-bahan yang digunakan untuk
isolasi bakteri pada anoda adalah media Alkaline Peptone Water (APW) yang
terdiri dari NaCl, KCl, NH4Cl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaHCO3, MgCl2.6H2O,
FeCl2.2H2O, gas murni N2, NaOH 5 M, media TrypticaseTM Soy Agar (TSA), dan
agar murni. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis secara biokimiawi ialah
kristal ungu, garam fisiologis, alkohol 95%, spirtus, safranin, akuades, dan larutan
iodium. Bahan yang dibutuhkan untuk uji katalase adalah hidrogen peroksida 3%.
Bahan yang digunakan untuk identifikasi bakteri adalah isolat bakteri murni pada
12
agar miring, garam fisiologis, minyak mineral, reagen VP I, reagen VP II, reagen
nitrate A, reagen nitrate B, reagen TDA, dan reagen Kovac’s.
Alat-alat yang digunakan untuk mengambil sedimen dan air laut ialah
botol tempat sampel air laut, tali, Ekman grab, cool box, kertas label, kantong
plastik, dan kamera. Alat-alat yang digunakan untuk membuat rangkaian SMFC
ialah gelas piala 1000 ml, timbangan digital (ketelitian 0,0001), multitester
(Masda DT830D), elektroda karbon, solder, resistor tetap 820±5% Ω, dan kabel.
Alat-alat yang digunakan untuk karakterisasi sedimen laut dan substrat SMFC
ialah neraca analitik, pH meter, gelas piala, Bausch & Lomb Spectronic 70
Electrophtometric 70, shaker, erlenmeyer, labu ukur, gelas ukur, labu semprot,
konduktometer dengan sel platina, kertas saring, tabung perkolasi, flamefotometer,
dan atomic absorption spectrofotometer (AAS). Alat-alat yang digunakan untuk
mengisolasi bakteri ialah botol bersumbat karet, tabung reaksi bersumbat karet,
cawan petri, sudip, jarum ose, syiringe, hot plate, kapas, platik wrapping, gelas
ukur, gelas erlenmeyer, pipet volumetrik, bunsen, jar anaerobik dan autoklaf. Alat
yang dibutuhkan untuk pewarnaan gram ialah kaca objek, jarum ose, bunsen, dan
mikroskop (Olympus CX21FS1). Pengujian oksidase dilakukan dengan
menggunakan Oxidase Test Strip. Alat untuk uji katalase ialah kaca objek. Alatalat yang digunakan untuk identifikasi bakteri ialah MicrogenTM GN-ID
Identification, tabung reaksi, pipet mikro, vortex, bunsen, ruang inkubator, tabel
warna untuk membaca hasil, dan Microbact 2000.
3.3 Metode Penelitian
Pelaksanaan penelitian ini dilakukan dalam tujuh tahapan, yaitu:
(1) karakterisasi sedimen laut Teluk Jakarta, (2) pembuatan rangkaian SMFC
yang mengacu pada penelitian Holmes et al. (2004), (3) pengukuran arus listrik
dengan multitester, (4) karakterisasi substrat SMFC, (5) isolasi bakteri pada anoda
SMFC, (6) karakterisasi bakteri pada anoda SMFC, dan (7) identifikasi bakteri
pada anoda SMFC.
3.3.1 Karakterisasi Sedimen Laut Teluk Jakarta
Karakterisasi sedimen laut dilakukan terhadap tekstur tanah, pH (H2O dan
KCl), daya hantar listrik (DHL), jumlah karbon organik, jumlah nitrogen total,
13
fosfor tersedia, dan kapasitas tukar kation (KTK). Parameter yang diuji pada
karakterisasi sedimen laut Teluk Jakarta ini mengacu pada penelitian
Hong et al. (2009c).
3.3.2 Pembuatan Rangkaian SMFC
Elektroda yang digunakan untuk penyusunan SMFC adalah karbon
berbentuk silinder dengan dimensi 39 x 7 mm yang diperoleh dari baterai.
Penentuan jenis elektroda ini mengacu dari hasil penelitian Logan (2008), dimana
karbon cocok untuk pertumbuhan bakteri, mudah dihubungkan dengan kabel dan
harganya yang relatif murah. Sebelum digunakan, elektroda karbon dinetralkan
(Holmes et al. 2004) dengan perlakuan:
1)
elektroda direndam dengan 1N HCl selama 1 hari kemudian dibilas dengan
akuades.
2)
elektroda direndam dengan 1N NaOH selama 1 hari kemudian dibilas dengan
akuades.
3)
elektroda direndam dengan akuades hingga saat akan digunakan.
Masing-masing elektroda yang telah diberi perlakuan, dililit dengan kabel
yang telah dibuka isolatornya dan ditutup dengan karet. Penutupan kabel dan
elektroda disempurnakan dengan menggunakan silicone rubber hingga kedap air.
Pengujian hasil perangkaian elektroda dan kabel dilihat dari adanya resistansi
menggunakan multitester.
Kegiatan pembuatan rangkaian SMFC (Gambar 3) mengacu pada
penelitian Holmes et al. (2004), dimana sedimen laut Teluk Jakarta dimasukkan
ke dalam gelas piala hingga ketinggian 3 cm, kemudian sebuah elektroda yang
terbuat dari karbon berbentuk silinder dengan dimensi 39 x 7 mm (anoda) ditutup
dengan sedimen laut setinggi 2 cm. Selanjutnya air laut sebanyak 400 ml
dimasukkan ke dalam gelas ukur dan didiamkan selama 24 jam untuk membuat
kondisi yang mengendapkan partikel-partikel sedimen laut. Pada hari berikutnya,
sebuah elektroda yang juga terbuat dari karbon berbentuk silinder dengan dimensi
39 x 7 mm (katoda) ditempatkan 1 cm di atas permukaan sedimen laut. Kabel dari
anoda dan katoda dihubungkan dengan resistor (820 Ω ± 5 %) membentuk
rangkaian tertutup. SMFC dioperasikan pada kondisi gelap (tanpa pencahayaan)
14
dan suhu ruang (± 27 °C). Air yang hilang karena penguapan selama masa
pengukuran arus listrik diganti dengan akuades demineralisasi.
820±5% Ω
Kanoda
1 cm
2 cm
Anoda
3 cm
Gambar 3 Susunan SMFC.
3.3.3 Pengukuran Arus Listrik dengan Multitester
Pengukuran arus listrik dilakukan menggunakan multitester dan hasilnya
dikonversi menjadi current density dengan lama pengukuran 40 hari. Penentuan
lamanya pengukuran arus listrik didasarkan pada pola kecenderungan perubahan
arus listrik oleh kandungan organik pada sedimen dan mikroorganisme, dimana
dalam pengukuran diperoleh puncak produksi arus listrik dan penurunan arus
listrik hingga hari akhir pengukuran (Holmes et al. 2004). Konversi current
density diperhitungkan dengan membagi jumlah arus yang dihasilkan dengan luas
permukaan anoda.
3.3.4 Karakterisasi Substrat SMFC
Analisis karakteristik substrat SMFC yang dilakukan bertujuan untuk
melihat perubahan kandungan bahan organik pada sedimen laut yang digunakan
akibat proses dalam SMFC. Jenis analisis yang digunakan sama dengan analisis
karakterisasi sedimen laut yang berasal dari Teluk Jakarta yang meliputi analisis
kandungan karbon organik, nitrogen, dan fosfat, pengukuran pH, daya hantar
listrik (DHL), serta kapasitas tukar kation (KTK). Analisis parameter ini mengacu
pada penelitian Hong et al. (2009c).
15
3.3.5 Pengisolasian Bakteri pada Anoda SMFC
Tahapan isolasi bakteri terdiri dari beberapa langkah, yaitu persiapan
media cair, persiapan media padat, inokulasi bakteri, dan isolasi bakteri.
3.3.5.1 Persiapan Media
Media kultur pengkayaan (enrichment) yang digunakan adalah media
APW yang telah dimodifikasi (Holmes et al. 2004). Tiap liter media APW
modifikasi mengandung 20 g NaCl; 0,77 g KCl; 0,25 g NH4Cl; 0,1 g KH2PO4;
0,2 g MgSO4.7H2O, dan 2,0 g NaHCO3. Sebelum NaHCO3 ditambahkan, pH
diatur menjadi 7 dengan 5 N NaOH. Media kultur kemudian dituang pada tabung
bersumbat karet dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu
121 °C. Media kemudian ditambahkan dengan 1 mM FeCl2 (dari 0,1 M FeCl2)
steril. Selanjutnya media cair dialiri dengan perbandingan gas N2 (99,999 %)
selama 15 menit untuk menghilangkan oksigen yang terlarut.
3.3.5.2 Persiapan Media Padat
Media
isolasi
bakteri
menggunakan
media
APW
modifikasi
(Holmes et al. 2004) yang ditambahkan agar murni (2%, b/v). Media kemudian
dididihkan dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 °C.
Media kemudian ditambahkan dengan 1 mM FeCl2 (dari 0,1 M FeCl2) steril.
3.3.5.3 Inokulasi Bakteri
Inokulasi bakteri pada SMFC dilakukan dengan cara memasukkan
elektroda pada media cair. Media yang telah diinokulasikan kemudian segera
dialiri gas N2 selama 30 menit. Setelah itu dilakukan inkubasi bakteri selama
3 hari pada suhu ruang dalam kondisi gelap. Bakteri yang telah tumbuh pada
media cair selanjutnya diencerkan pada media yang sama dengan menggunakan
syringe steril secara aseptik.
Bakteri tunggal diperoleh dengan cara menumbuhkan bakteri pada media
padat dengan menggunakan metode cawan tuang. Masing-masing pengenceran
bakteri diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan syringe steril secara aseptik.
Kemudian dipindahkan ke dalam cawan petri steril. Setiap pengenceran
dipindahkan ke dalam 2 cawan petri steril (duplo). Selanjutnya ditambahkan
15 ml media agar APW yang telah dicairkan. Cawan petri digoyangkan secara
16
perlahan membentuk angka delapan supaya bakteri dan media menyebar merata.
Setelah agar membeku sempurna, cawan petri disimpan dengan posisi terbalik
pada anaerob jar. Kondisi anaerob dicapai dengan cara memasukkan Gas Pak ke
dalam anaerob jar. Media diinkubasi pada suhu ruang pada kondisi gelap selama
48 jam.
3.3.5.4 Isolasi Bakteri
Bakteri diisolasi dengan menggunakan metode kuadran atau streak plate
(Gambar 4). Bakteri yang terpilih diambil secara aseptik dengan mengunakan
jarum ose dan digoreskan pada media agar APW steril.
Setiap koloni murni pada cawan ditumbuhkan (disegarkan) pada media
agar-agar APW miring pada tabung reaksi dengan metode gores. Hal ini bertujuan
untuk menghindarkan isolat dari kontaminasi bakteri yang masih terdapat pada
media cawan petri dan juga menyegarkan bakteri agar selalu mendapatkan nutrisi
yang cukup sehingga tidak cepat mati. Setiap akan memindahkan bakteri
sebaiknya dilakukan pengujian pewarnaan Gram bakteri untuk mendapatkan
informasi yang sama seperti sebelumnya, apabila data yang didapatkan berubah
maka bakteri yang diisolasi terdahulu mungkin saja telah terkontaminasi. Kolonikoloni terpisah yang telah murni ditumbuhkan ke dalam agar miring sebagai stok
dan disimpan dalam referigator (suhu 0-(-4) °C).
Gambar 4 Isolasi dengan metode cawan gores (Benson 2001)
Setiap isolat murni yang didapat, dipindahkan pada agar miring yang
dipergunakan sebagai stok bakteri dan disegarkan setiap 1 minggu sekali untuk
mensuplai kebutuhan nutrien dalam media dan diharapkan berfungsi untuk
mengurangi terjadinya kontaminasi.
17
3.3.6 Karakterisasi Bakteri pada Anoda SMFC
Karakterisasi terhadap isolat bakteri bertujuan untuk mengetahui sifat
morfologi dan fisiologinya. Sifat morfologi yang diamati meliputi morfologi
koloni dan morfologi sel. Morfologi koloni terdiri atas bentuk atas, bentuk pinggir,
bentuk penonjolan, dan warna koloni. Morfologi sel terdiri atas bentuk sel,
pewarnaan Gram, endospora, dan motilitas. Pengamatan fisiologis meliputi
katalase dan oksidase. Media yang digunakan pada karakterisasi bakteri ialah
media APW yang ditambahkan dengan TSA sebanyak 4 g/liter.
3.3.7 Identifikasi Bakteri pada Anoda SMFC
Identifikasi bakteri ialah membandingkan bakteri yang telah teridentifikasi
dengan bakteri yang belum diketahui. Identifikasi sendiri merupakan proses
pencarian kekerabatan suatu organisme agar mempermudah dalam proses
pemberian tata nama (Manclark & Pickett 1961 dalam Cowan & Steel’s 1993).
Buku manual yang digunakan ialah Bergey’s Manual of Determinative
Bacteriology 9th Ed. (Holt et al. 1994). Penggunaan buku manual tersebut dapat
menelaah sistem identifikasi hingga tingkat genus. Identifikasi bakteri hingga
tingkat spesies memerlukan uji lanjutan. Salah satu metode identifikasi lanjutan
ialah MicrogenTM GN-ID Identification.
MicrogenTM GN-ID Identification adalah alat pengidentifikasian yang
dapat digunakan untuk mengetahui reaksi biokimia bakteri. Alat ini cukup praktis
digunakan dan dapat meminimalkan waktu identifikasi. Alat ini juga sangat
mudah digunakan dan terdiri well (sumur tempat mengkultur isolat) dan reagen
(cairan kimia) yang mewakili uji pada identifikasi yang telah tersedia.
Hasil
identifikasi
selanjutnya
diolah
dengan
menggunakan
Software
Microbact 2000.
3.4 Prosedur Pengujian
Pengujian yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengujian
karakteristik sedimen laut Teluk Jakarta, karakteristik substrat SMFC,
karakterisasi bakteri pada anoda, dan identifikasi bakteri. Pengujian karakteristik
sedimen laut Teluk Jakarta dan karakteristik substrat SMFC meliputi penentuan
tekstur tanah dengan metode pipet, pengukuran pH, penentuan daya hantar listrik,
18
penetapan C-organik metode Walkey & Black, penetapan jumlah N total metode
Kjeldhal, penetapan P-tersedia metode Olsen, dan penetapan kapasitas tukar
kation. Karakterisasi bakteri yang dilakukan ialah pewarnaan Gram, uji oksidase,
uji katalase dan uji motilitas. Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan
MicrogenTM GN-ID Identification.
3.4.1 Penentuan Tekstur Tanah dengan Metode Pipet (Sudjadi et al. 1971)
Contoh tanah ukuran <2 mm ditimbang sebanyak 10 g dan dimasukkan ke
dalam piala gelas 800 ml, kemudian ditambah 50 ml H2O2 10% dan dibiarkan
semalam. Keesokan harinya campuran tersebut ditambah 25 ml H2O2 30% dan
dipanaskan sampai tidak berbusa. Selanjutnya ditambahkan 180 ml air bebas ion
dan 20 ml HCl 2 N kemudian dididihkan di atas pemanas listrik selama lebih
kurang 10 menit. Setelah diangkat dan agak dingin, campuran tersebut diencerkan
dengan air bebas ion menjadi 700 ml dan dicuci dengan air bebas ion
menggunakan penyaring Berkefield sampai bebas asam. Kemudian ditambah
10 ml larutan peptisator Na4P2O7 4 %. Pemisahan pasir dilakukan dengan
pengayakan suspensi tanah yang telah diberi peptisator dengan ayakan 50 mikron
sambil dicuci dengan air bebas ion. Filtrat ditampung dalam silinder 500 ml untuk
pemisahan debu dan liat. Butiran yang tertahan ayakan dipindahkan ke dalam
pinggan aluminium yang telah diketahui bobotnya dengan air bebas ion
menggunakan botol semprot. Selanjutnya dilakukan pengeringan (hingga bebas
air) dalam oven pada suhu 105 °C, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang
(berat pasir = A g). Pemisahan debu dan liat dilakukan dengan pengenceran filtrat
dalam silinder menjadi 500 ml dan diaduk selama 1 menit. Setelah itu, filtrat
segera dipipet sebanyak 20 ml ke dalam pinggan aluminium. Kemudian filtrat
dikeringkan pada suhu 105 °C selama semalam, didinginkan dalam desikator, dan
ditimbang (berat debu + liat + peptisator = B g). Pemisahan liat dilakukan dengan
pengadukan lagi selama 1 menit lalu dibiarkan selama 3 jam 30 menit pada suhu
kamar. Suspensi liat dipipet sebanyak 20 ml pada kedalaman 5,2 cm dari
permukaan cairan dan dimasukkan ke dalam pinggan aluminium. Suspensi liat
dikeringkan dalam oven pada suhu 105 °C, didinginkan dalam desikator, dan
ditimbang (berat liat + peptisator = C g). Penentuan jumlah pasir, debu, dan liat
dilakukan berdasarkan perhitungan berikut:
19
fraksi pasir = A g
fraksi debu = 25 (B - C) g
fraksi liat = 25 (C - 0,0095) g
Jumlah fraksi = A + 25 (B - 0,0095) g
Pasir (%) = A / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100
Debu (%) = {25(B - C)} / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100
Liat (%) = {25 (C - 0,0095)} / {A + 25 (B - 0,0095)} x 100
Keterangan:
A: berat pasir
B: berat debu + liat + peptisator
C: berat liat + peptisator
3.4.2 Pengukuran pH (Rayment & Hingginson 1992)
Pengukuran pH tanah dalam KCl dilakukan dengan penimbangan 20 g
tanah yang dimasukkan pada gelas piala. Kemudian ditambahkan 20 ml 1 N KCl
dan didiamkan selama 30 menit sambil diaduk beberapa kali. Penentuan pH
dengan menggunakan pH meter.
Pengukuran pH tanah dalam H2O dilakukan dengan penimbangan 20 g
tanah kering yang dimasukkan pada gelas piala.berukuran 50 ml. Kemudian
ditambahkan 20 ml akuades dan didiamkan selama 30 menit sambil diaduk
beberapa kali. Pengukuran pH tanah dengan menggunakan pH meter.
3.4.3 Pengukuran Daya Hantar Listrik (Rayment & Hingginson 1992)
contoh tanah ditimbangan sebanyak 10 g ke dalam botol kocok dan
tambahkan 50 ml air bebas ion. Kemudian botol dikocok dengan mesin pengocok
selama 30 menit. pengukuran DHL suspensi tanah dilakukan dengan
konduktometer yang telah dikalibrasi menggunakan larutan baku NaCl dan dibaca
setelah angka mantap (konstan). Nilai DHL dilaporkan dalam satuan dS m-1.
3.4.4 Penetapan C-organik metode Walkey & Black (Rayment &
Hingginson 1992)
Tanah ukuran <0,5 mm ditimbangan sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke
dalam labu ukur 100 ml. Kemudian ditambahkan 5 ml K2Cr2O7 1 N dan dikocok.
Selanjutnya ditambahkan 7,5 ml H2SO4 pekat dan dikocok lalu didiamkan selama
30 menit. Larutan tersebut kemudian diencerkan dengan air bebas ion lalu
dibiarkan dingin dan diimpitkan. Keesokan harinya dilakukan pengukuran
20
absorbansi larutan jernih dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
561 nm. Sebagai pembanding dibuat standar 0 dan 250 ppm, dengan memipet 0
dan 5 ml larutan standar 5.000 ppm ke dalam labu ukur 100 ml dengan perlakuan
yang sama dengan pengerjaan sampel. Penetapan C-organik dilakukan
berdasarkan perhitungan dibawah ini.
C-organik (%) = ppm kurva x ml ekstrak 1.000 ml-1 x 100 mg contoh-1 x fk
= ppm kurva x 100 1.000-1 x 100 500-1 x fk
= ppm kurva x 10 500-1 x fk
Keterangan
ppm kurva : kadar contoh yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret
standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi blanko.
100
: konversi ke %
Fk
: faktor koreksi kadar air = 100/(100 – % kadar air)
3.4.5 Penetapan N metode Kjeldhal (Burt 2004)
Tanah ditimbangan sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam labu
Kjeldhal 25 ml. Selanjutnya ditambahkan 1,9 g campuran Se, CuSO4, dan NaSO4.
Kemudian ditambahkan 5 ml H2SO4 pekat ke dalam labu dan digoyangkan
perlahan agar semua tanah terbasahi oleh H2SO4. Campuran tersebut lalu ditetesi
dengan parafin cair sebanyak 5 tetes. Labu Kjeldhal dipanaskan dengan api kecil
kemudian secara bertahap api dibesarkan hingga diperoleh cairan yang bewarna
terang (hijau-biru). Labu Kjeldhal tetap dipanaskan hingga 15 menit kemudian
didinginkan. Selanjutnya ditambahkan air sebanyak 50 ml dan dihomogenkan
dengan cara digoyangkan. Setelah itu, ditambahkan 5 ml NaOH 50 %. Proses
destilasi dimulai dan hasil destilat ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang
berisi campuran 10 ml H3BO4 4% dan 5 tetes indikator Conway. Destilasi
dilakukan sampai isi destilasi mencapai 1000 ml. Hasil destilasi dititrasi dengan
HCl yang telah dibakukan sampai terjadi perubahan warna, dari hijau ke merah.
Lakukan juga penetapan blanko. Penetapan N ditentukan berdasarkan perhitungan
di bawah ini.
Kadar N (%) = isi HCl (contoh-blanko) x N HCl x 14 x 100
BKM
21
3.4.6 Penetapan P-tersedia metode Olsen (Watanabe & Olsen 1965)
Tanah ukuran <0,2 mm ditimbangan sebanyak 1 g dan dimasukkan ke
dalam botol kocok. Kemudian ditambahkan 20 ml pengekstrak Olsen dan dikocok
selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan kertas saring.
Apabila larutan keruh maka dilakukan penyaringan kembali. Ekstrak yang didapat,
dipipet sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi. Selanjutnya bersama deret standar
ditambahkan 10 ml pereaksi pewarna fosfat dan dikocok hingga homogen.
Larutan tersebut dibiarkan selama 30 menit. Absorbansi larutan diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 693 nm. Penetapan P-tersedia
ditentukan berdasarkan perhitungan di bawah ini:
Kadar P2O5 tersedia (ppm)
= ppm kurva x ml ekstrak/1.000 ml x 1.000 g/g contoh x fp x 142/90 x fk
= ppm kurva x 20/1.000 x 1.000/1 x 142/90 x fk
= ppm kurva x 20 x 142/90 x fk
Keterangan:
ppm kurva
fp
142/190
fk
: kadar contoh yang didapat dari kurva hubungan antara kadar
deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi blanko.
: faktor pengenceran (bila ada)
: faktor konversi bentuk PO4 menjadi P2O5
: faktor koreksi kadar air = 100/(100 – % kadar air)
3.4.7 Penetapan Kapasitas Tukar Kation (Burt 2004)
Tanah kering yang telah diayak ditimbangan sebanyak 2,5 g dan
dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 15 ml. Kemudian ditambahkan 1 ml
larutan NH4OAc pH 7. Campuran dikocok sampai merata dan dibiarkan selama
semalam. Selanjutnya campuran dikocok kembali lalu disentrifuse selama
10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Ekstrak NH4OAc didekantasi, disaring
dengan saringan, dan filtrat ditampung dalam labu takar 100 ml. Penambahan
NH4OAc diulangi sampai 3 kali. Setiap kali penambahan diaduk merata,
disentifuse dan ekstraksinya didekantasi ke dalam labu ukur 100 ml. Setelah itu
filtrat ditambahkan larutan NH4OAc sampai tanda tera. Ekstrasi ini digunakan
dalam penetapan kadar K, Na, Ca, dan Mg yang dapat dipertukarkan serta untuk
penetapan kejenuhan basa. Pencucian kelebihan NH4+ dilakukan dengan
penambahkan 10 ml alkohol 80 % ke dalam tabung sentrifuse yang berisi residu
tanah tersebut. Campuran tersebut diaduk sampai merata, disentrifuse, dekantasi,
22
dan filtratnya dibuang. Pencucian kelebihan NH4 dengan alkohol ini dilakukan
sampai tanah dalam tabung sentrifuse bebas NH4. Hal ini dapat diketahui dengan
menambahkan beberapa tetes pereaksi Nessier pada filtrat tersebut. Apabila
terdapat endapan kuning berarti masih terdapat ion NH4+. Setelah bebas dari NH4+,
tanah dipindahkan secara kuantitatif dari tabung sentifuse ke dalam labu didih.
Kemudian air ditambahkan sebanyak 450 ml ke dalam labu didih. Labu didih
ditambahkan beberapa butir batu didih, 5-6 tetes paraffin cair, dan 20 ml
NaOH 50 %, kemudian didestilasi. Destilat ditampung dalam erlenmeyer 250 ml
yang berisi 25 ml H2SO4 0,4 N dan 5-6 tetes indikator Conway. Destilasi
dihentikan jika destilat yang ditampung mencapai 150 ml. Kelebihan asam
dititrasi dengan NaOH 0,1 N. Titik akhir titrasi dicapai bila warna berubah
menjadi hijau. Destilasi tanpa tanah digunakan sebagai blanko. Penetapan nilai
KTK dihitung berdasarkan rumus.
KTK
(ml blanko-ml contoh)x N NaOH
me
=
X100
bobot contoh tanah 105 °C
100g
3.4.8 Pewarnaan Gram (Harley & Prescott 2002)
Pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui morfologi sel bakteri dan
untuk mengetahui kelompok bakteri berdasarkan Gram positif atau Gram negatif.
Kaca objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol diolesi
inokulum secukupnya kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek
diletakkan pada rak dan digenangi dengan larutan kristal violet dan didiamkan
selama satu menit. Larutan kristal violet dibuang dengan memiringkan kaca objek
dan dibilas dengan akuades dan dikeringkan dengan tisu. Selanjutnya kaca objek
digenangi dengan larutan iodin selama dua menit dan dibilas dengan alkohol 95 %.
Tahap akhir kaca objek digenangi dengan larutan safranin selama 30 detik dan
dibilas dengan akuades serta dikeringkan dengan kertas tisu. Saat pemeriksaan
dengan mikroskop, ditetesi dengan minyak imersi. Pengamatan dengan mikroskop
dilakukan dengan perbesaran 100 kali pada lensa objek dan perbesaran 10 kali
pada lensa okuler.
3.4.9 Pewarnaan Endospora (Harley & Prescott 2002)
Kaca objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol diolesi
inokulum secukupnya kemudian difiksasi di atas api hingga kering. Kaca objek
23
diletakkan pada rak dan digenangi dengan larutan malacite green dan dipanaskan
selama lima menit. Kaca objek ditambahkan larutan malacite green jika larutan
tersebut menguap. Selanjutnya kaca objek didinginkan dengan mengalirkan
akuades selama 30 detik. Tahap akhir kaca objek digenangi dengan larutan
safranin selama 90 detik dan dibilas dengan akuades serta dikeringkan dengan
kertas tisu. Saat pemeriksaan dengan mikroskop, ditetesi dengan minyak imersi.
Pengamatan dengan mikroskop dilakukan dengan perbesaran 100 kali pada lensa
objek dan perbesaran 10 kali pada lensa okuler.
3.4.10 Uji Oksidase (Harley & Prescott 2002)
Sebanyak 1 ose koloni bakteri diambil dari media padat kemudian
digoreskan pada kertas Oxidase Test Strip. Perubahan warna yang terjadi pada tes
strip tadi diamati setelah didiamkan selama 20-60 detik. Apabila terjadi perubahan
warna manjadi biru violet maka uji oksidase dinyatakan positif dan menandakan
bahwa bakteri tersebut adalah bakteri non-enterik. Sedangkan bila tidak terjadi
perubahan warna maka uji oksidase dinyatakan negatif dan menandakan bakteri
tersebut adalah bakteri enterik.
3.4.11 Uji Katalase (Harley & Prescott 2002)
Koloni bakteri dari media padat diambil sebanyak 1 ose, kemudian
digoreskan di atas kaca objek yang kering. Hidrogen peroksida 3% diteteskan
sebanyak 2-3 tetes pada usapan bakteri tadi. Apabila terbentuk gelembung udara
maka uji katalase dinyatakan positif. Baktei aerob memberikan reaksi yang positif
terhadap uji katalase sedangkan anaerob tidak menunjukkan reaksi yang positif.
3.4.12 Uji Motilitas (Harley & Prescott 2002)
Uji motilitas dilakukan dengan membuat preparat basah dan mengamati
gerak bakteri di bawah mikroskop. Kaca objek yang telah dibersihkan dengan
menggunakan alkohol ditambahkan biakan bakteri murni dari media cair.
Kemudian preparat ditutup dengan kaca penutup. Motilitas bakteri diamati
menggunakan miroskop dengan perbesaran 10 x 100.
3.4.13 Uji MicrogenTM GN-ID Identification
Uji bakteri dengan MicrogenTM GN-ID Identification memiliki tahapan
dalam menguji sebagai berikut:
24
1) Bakteri yang akan di uji pada MicrogenTM GN-ID Identification sebaiknya
disegarkan terlebih dahulu selama 18-24 jam dalam keadaan steril dan murni
koloninya.
2) Bakteri kemudian dilarutkan dalam garam fisiologis (0,85 %) sebanyak 6 ml
dan dihomogenisasi. Jumlah bakteri harus dalam keadaan cukup banyak
untuk diidentifikasi (> 2 x 109).
3) Penutup MicrogenTM GN-ID Identification dibuka secara hati-hati. Kemudian
suspensi bakteri dipipet dengan pipet mikro steril sebanyak ± 200 µl dan
dimasukkan ke setiap sumur MicrogenTM GN-ID Identification. Sumur-sumur
tersebut terdiri dari 24 lubang atau 24 tes.
4) Setelah inokulasi ditambahkan minyak mineral sebanyak 3-4 tetes pada
sumur lysine, ornithine, H2S, arabinose, dan arginine. Jika isolat bersifat
oksidase positif maka tidak ditambahkan minyak mineral pada sumur
arabinose.
5) MicrogenTM GN-ID Identification ditutup kembali kemudian dilakukan
inkubasi pada suhu 35-37 °C.
6) Hasil dibaca setelah 18-24 jam untuk Enterobacteriaceae dan setelah 48 jam
untuk isolat yang bersifat oksidase positif.
7) Setelah inkubasi dapat dilihat perubahan warna pada setiap sumur. Reagen
VP1 dan VP2 diteteskan pada sumur VP kemudian hasil dibaca setelah 15-30
menit. Reagen Kovac’s ditambahkan sebanyak 2 tetes pada sumur indole dan
dibaca setelah 2 menit. Reagen TDA ditambahkan sebanyak 1 tetes pada
sumur TDA dan hasil dibaca segera. Setelah pembacaan reaksi ONPG
(sumur ke-7) telah dilakukan, pembacaan reduksi nitrat dilakukan pada sumur
yang sama dengan menambahakan reagen Nitrate A dan Nitrate B.
8) Hasil perubahan warna dituliskan pada kertas hasil dan dimasukkan pada
software Microbact 2000. Kemungkinan spesies isolat akan ditampilkan
sebagai hasil.