ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DARI BATANG

PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT
DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L.
YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA
TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus
Skripsi
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm. )
Program Studi Farmasi
Oleh :
Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
NIM : 038114064
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2008
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Skripsi
ISOLASI DAN II}ENTTFIKASI BAKTERI ENDOFTT
DALAM BATANG TANAMAN ArtemisiaAnnuaL.
YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA
TERHADLP Eschericia co# DAN Staphylococcusaureils
Iliajukan Oleh :
Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
NIM:038114064
Telahdisetujuioleh:
Pembimbing:
o{ t ^,s
',
i
I('
,'u!L--'
MariaDwibudi Jumpowati,S.Si.
Tanggaf
, ?1 ..fov.*.,.i..*g.o8
(,
III
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Pengesahan
Skripsi
Berjudul:
ISOLASI DA}{ IDENTIFIKASI BAKTERI ENIX}FTT
DALAM BATANG TANAMAN Artemisis Anw* L
YAITG DIUJI POTENSI ANTIBAKTEilNYA
TERAD AP Exhefcia coli DAlt Staphytoeorussursus
OIetr
AntoniusAlfian Yuan Dias Priharta
NIM:038114S64
Dipertahankandi hadapanPanitiaPengujiSlripsi
FakultasFarmasiUniversitasSanataDharma
Padatanggal: 15 Januari3008
Mengetahui
FakultasFarmasi
Dharma
*r.rt.,urt.
Pembimbing:
MariaDwi Budi Jumpowafi,S.Si.
PanitiaPengr$i:
TandaTangan
1. Mari*Dwi Budi Jumpowati,S.Si.
0&v
44,,
2. Y*stina Sri Hartini,M.Si., Apt.
3. Igl Y" Kristio Budiasmoro,M.Si.
1Y
YTw
r
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Skripsi ini dipersembahkan untuk :
Yesus Kristus
Bapak Bernardinos Dias Sidharta
Ibu Caecilia Enita Amarwati
Crezensia Alfiora Dea Dema Dias Oktabenita
Felisita Anesti Kusumastuti
Without Love, I’m Nothing . . . .
v
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
LEMBAR PER}IYATAA}{ PENSETilJUAI{
PUBLIKASI KARYA ILMIAH T]NTUKKEPEI{TINGAI\I AI{ADEMIS
UniversiasSanataDharma:
Yaagbertandatangandi bawahini, sayamahasiswa
: AntoniusAlfian YuanDiashihffa
Nomorlrdahasiswa : 038114064
ilmu pengetahuan,
sayameilbtrikar ke,padaPerpustakaaa
Deui pengembangan
UniversitasSanahDharmakaryailmiah sayayangberjudtl :
"ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAIffSRI ENDOFIT DAI,AM
BATAFIG TANAMAN Artenisin an $til L. YAFIG IIIUJI POTENSI
ANTIBAI(IERIIYYA TERIIADAP Escheria cotri DAF{ Str,phyloeweets
asteuf
besertaperangkatyangdiperlukan(bila ada).Dengandemikiansayamemkrikm
k€padaPerpusakaanUniversitasSanataDharua bak unt* mcnyimparqmedalambsh* pang*alandata
ngnlihkandalambentukmedialain, mengelolanya
di Internetdau media
s€caraterbatas,danmerrpublikasikannya
memdisribusikan
tain untr* kepentinganakademistanpaperlu memintaijin dari $lya malryut
mcrrberikanrcyalti kepadasayaselamat€tapmencatrfimkmnamasayas*agai
pmulis. Derrikianpsmyafaanini yangsayabuatdengrusebenarnya.
Dibnatdi Yoryaka*a
Padatanggal: 30 Jauuari2008
Yrnn Dias Priharta)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan
berkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi yang penulis susun berjudul
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG
TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA
TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus.
Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan
banyak terimakasih kepada :
1. Tuhan Yesus Kristus yang telah memberi rahmat dan berkat-Nya serta
perlindungan dan bimbingan-Nya pada setiap umat-Nya.
2. Bapak, Ibu, dan adik Dhea atas doa, kasih sayang, perhatian, dan
dukungannya baik moril maupun materiil yang selalu diberikan padaku.
3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing utama yang
telah memberikan bimbingan, pengarahan, waktu, kesabaran, dan saran hingga
skripsi ini dapat tersusun.
4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak
memberikan saran dan masukan kepada penulis.
5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen penguji yang telah
banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis.
6. Pihak BPTO Tawangmangu, terutama Bapak Agus. Terimakasih telah
vi
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
membantu dalam pengadaan dan determinasi tanaman Artemisia annua L.
7. Eyang Putri beserta keluarga besar di Klaten, terimakasih atas doa, perhatian,
kasih sayang, nasehat, dan dukungan untukku.
8. Pakdhe dan Budhe beserta keluarga, terutama Budhe Erlin, terimakasih atas
perhatian, nasehat, dan dukungan untukku.
9. Felisita, terimakasih untuk doa, perhatian, cinta, kesabaran, serta dukungan
yang sangat berkesan untukku.
10. Pak Kartatmo, Pak Mukmin, Mas Narto selaku Staff Sekretariat Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, terimakasih telah membantu dalam
memperlancar administrasi hingga tersusunnya skripsi ini.
11. Mas Sarwanto, Mas Sigit, Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi
Farmasi, terimakasih atas semua bantuannya selama ini.
12. Teman-teman kelompok C 2003 : Anien, Siska, Eveline, Hartono, Komang,
Indhu, Devi, Titien, Ratna, Yulia, Madya, Punto, Esti, Tata, Budi, Rosa, Vera,
Ratih, dan Maria. Terimakasih atas kerjasama dan kebersamaannya selama ini.
Che 03 Never Die...
13. Anak-anak kontrakan : Abang Aan, Hengky, Manto, Irwan, Ndaroe, Topan,
dll. Thanks untuk kebersamaaannya. Keep the Spirit..
14. Anak-anak No Label cabang Teknik Sipil Atma Jaya, thanks untuk
kebersamaaannya. Tetap semangat mengejar wanita sampai Nirwana..
15. Teman-teman KKN USD XXXIII Gantiwarno Kelompok 29 : Mbak Non
(PBI), Valent (MIPA), Melinda (Psi), Sandra (S.Ing), Ika (P.Mat), Dika
(IKOM), Punto (PBI), dan Bu Parlan selaku Ibu Pondokan, terimakasih atas
vii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
bantuan, dukungan dan kebersamaannya selama ini.
16. Lukas Eko, teman skripsi Rosa, dan Bayu (PBI), terimakasih atas kerjasama,
bantuan, dan kebersamaannya selama ini.
17. Yoyok, thanks telah membawakan tanaman Artemisia annua L. dari
Tawangmangu sampai ke Jogja.
18. Teman-teman angkatan 2003 yang tidak mungkin saya sebutkan satu persatu,
terimakasih atas kebersamaannya selama ini.
19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis hingga
tersusunnya skripsi ini.
Penulis sangat menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat
kesalahan dan kekurangan, oleh karena itu saran dan kritik yang sifatnya
membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan ini.
Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi
pengembangan ilmu farmasi pada khususnya dan kemajuan ilmu pengetahuan
pada umumnya.
Yogyakarta, 21 November 2007
Hormat penulis
Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
viii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
PER}IYATAAH KEASLIAN PENELITIAI{
Sayamenyatakandengansesuagguhnya
bahwa slcripsiyang sayaftrlis tm
tidak memuatkarya atau bgian karya orang lain, kecuali yarrgtetah disebrskan
dalamdaftarpustakasebgaimanalayaknyakaryailmiah.
Yogyakarfa,21 November2007
Antonius
tx
YuanDiasPrihsrra
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
INTISARI
Tanaman Artemisia annua L. merupakan tanaman yang digunakan sebagai
obat anti malaria. Pada tanaman A.annua L ini diketahui ada mikrobia endofit
yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar
(Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari
tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Mikrobia endofit diketahui dapat
memperbaiki pertumbuhan tanaman karena kemampuannya menekan
pertumbuhan mikrobia-mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan
senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman (Pudaritadesantamaria,
2004).
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya isolat bakteri endofit
dalam batang tanaman A.annua L., menguji potensi antibakteri dari isolat bakteri
endofit tersebut terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus serta
mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat
eksploratif-deskriptif. Isolasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L.
dilakukan dengan metode streak plate, potensi antibakteri diuji dengan metode
paper disc. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan pengamatan morfologi
koloni, morfologi sel, dan uji biokimia.
Hasil dari penelitian ini adalah senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri
endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua L. mempunyai potensi antibakteri
terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, serta diketahui
identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut adalah genus
Amphibacillus.
Kata kunci :
Bakteri endofit, zona hambat, Artemisia annua L., Eschericia coli,
Staphylococcus aureus, Amphibacillus.
x
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
ABSTRACT
Artemisia annua. L. is a plant which is used as antimalaria. At this
A.annua. L. is known that is endophytic mikrobia forming colony in tissue at stem
area until root (Simanjuntak et al, 2004). Endophytic mikrobia grew in vascular
tissue from the plant (Stone et al, 2000). Endophytic microbia can fix up the
development of the plant because its ability to suppress the pathogenic
development in survival way, producing antibiotic compounds, or inducting the
vurnability of the plant (Pudaritadesantamaria, 2004).
The purpose of this research was to find the endophytic bacteria isolate
toward Eschericia coli and Staphylococcus aureus, and to find the identity of the
endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds.
This result was pure experimental research and it was an explorative
descriptive research. The endophytic bacteria isolation from A.annua. L.’s stem
was used streak plate method, the antibacterial potential was tested using paper
disc method. The identification of endophytic bacteria was using colony
morphology observation, cell morphology, and biochemical test.
The result of this research were an antibacterial compounds which was
produced by endophytic bacteria was isolated from A.annua. L, had the potential
antibacteria to E.coli and S.aureus, and it was known that the identity of the
endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds was
Amphibacillus.
Key words :
endophytic bacteria, inhibition zone, Artemisia annua L.,
Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.
xi
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
DAFTAR ISI
Halaman Judul..................................................................................................... ii
Halaman Persetujuan Pembimbing...................................................................... iii
Halaman Pengesahan........................................................................................... iv
Halaman Persembahan........................................................................................
v
Prakata................................................................................................................. vi
Pernyataan Keaslian Karya................................................................................. ix
Intisari.................................................................................................................
x
Abstract............................................................................................................... xi
Daftar Isi............................................................................................................. xii
Daftar Tabel....................................................................................................... xvi
Daftar Gambar................................................................................................... xvii
Daftar Lampiran................................................................................................ xviii
BAB I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang.................................................................................. 1
1. Permasalahan.............................................................................. 3
2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3
3. Manfaat Penelitian...................................................................... 4
B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
A. Antibiotik......................................................................................... 5
B. Mikrobia Endofit............................................................................. 7
xii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
C. Artemisia annua L. ......................................................................... 10
D. Rekombinasi Genetik..................................................................... 12
E. Bakteri Uji...................................................................................... 14
F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia........................ 16
G. Identifikasi Mikrobia...................................................................... 18
H. Keterangan Empiris....................................................................... 21
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian..................................................... 23
B. Variabel dan Definisi Operasional................................................. 23
C. Bahan dan Alat Penelitian.............................................................. 25
D. Tahapan Penelitian........................................................................ 28
1. Determinasi tanaman Artemisia annua L. ................................ 28
2. Pengumpulan batang Artemisia annua L. ................................. 28
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).............. 28
4. Disinfeksi Batang Artemisia annua L. ..................................
31
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium...... 31
6. Isolasi
Bakteri
Endofit
dengan
Metode
Streak
Plate........................................................................................... 32
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit
Terhadap
E.coli
dan
S.aureus
Secara
Difusi
Paper
disc............................................................................................. 32
8. Identifikasi Bakteri Endofit........................................................ 33
xiii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
E. Analisis Hasil................................................................................. 40
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. ................................... 43
2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L. ..................... 43
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).................. 44
4. Disinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L. ......................
46
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium........... 47
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate..................... 49
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap
S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc............................... 52
8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan
Isolat
Bakteri
Endofit
dengan
Bakteri
Uji
S.aureus.......................................................................................... 54
9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang
Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli......... 59
10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode
D...............................................................................
63
a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D.............................................................. 64
b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B
dan Bakteri Endofit kode D....................................................... 71
c. Uji Biokimia.............................................................................. 73
xiv
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan.................................................................................... 85
B. Saran.............................................................................................. 85
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 86
LAMPIRAN...................................................................................................... 90
BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 102
xv
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil
Pengukuran
Diameter
Zona
Hambat
dari
Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 56
Tabel II. Hasil
Pengukuran
Diameter
Zona
Hambat
dari
Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 57
Tabel III. Hasil
Pengukuran
Diameter
Zona
Hambat
dari
Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 60
Tabel IV. Hasil
Pengukuran
Diameter
Zona
Hambat
dari
Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 61
Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit
kode D................................................................................................ 82
Tabel VI. Hasil Identifikasi Bakteri Endofit kode B, Bakteri Endofit kode D,
dan Bakteri Genus Amphibacillus ..................................................
xvi
84
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema Kerja Penelitian .................................................................. 42
Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu
Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 55
Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu
Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 57
Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi
24 Jam ........................................................................................... 60
Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi
24 Jam ........................................................................................... 61
Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 65
Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 66
Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 67
Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 68
Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B .................... 69
Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D .................... 70
xvii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman A.annua L.................... 90
Lampiran 2. Tanaman A.annua L..................................................................... 92
Lampiran 3. Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu
Inkubasi 3 hari ............................................................................. 92
Lampiran 4. Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting
dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ................................................... 93
Lampiran 5. Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit
kode D pada Medium Semi Solid ................................................ 93
Lampiran 6. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrient Broth ............................................ 94
Lampiran 7. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak .................................. 94
Lampiran 8. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring .................................. 95
Lampiran 9. Hasil Uji Asam sulfida (H2S) ....................................................... 95
Lampiran 10. Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin ..................................................... 96
Lampiran 11. Hasil Uji Indol .............................................................................. 97
Lampiran 12. Hasil Uji Methylen Red (MR) ..................................................... 97
Lampiran 13. Hasil Uji Sitrat ............................................................................. 98
Lampiran 14. Hasil Uji Katalase ........................................................................ 99
Lampiran 15. Hasil Uji Oksidase ....................................................................... 99
xviii
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Lampiran 16. Hasil Uji Gelatin .......................................................................... 100
Lampiran 17. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin .................... 100
Lampiran 18. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin ................. 101
xix
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikrobia yang
dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh
mikrobia lain. Setiap antibiotika mempunyai aktivitas penghambatan hanya
terhadap kelompok mikrobia tertentu yang disebut spektrum penghambatan
(Suwandi, 1989)
Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang
membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil
identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa
(Simanjuntak, Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih, & Said, 2004).
Bacillus polymixa termasuk dalam genus Bacillus yang mempunyai ciri sel
berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, motil,
dan bersifat katalase positif (Holt, Krieg, Sneath, Staley, & Williams, 2000).
Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di jaringan tanaman pada
periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan
tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikrobia endofit tumbuh di jaringan
vaskular dari tanaman inangnya (Stone, Bacon, White, 2000). Setiap tanaman
tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Mikrobia endofit
tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer
genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
2
(Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi metabolit
sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat
besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia
endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Bakteri
endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman A.annua L., dapat
memproduksi metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria
(Simanjuntak, dkk, 2004).
Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan media yang dapat menyokong
pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, &
Maffei, 2001). Media Murashige-Skoog (MS) merupakan media yang digunakan
untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garamgaram mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+
(Hendaryono,1994).
Staphylococcus aureus dapat menghemolisis darah dan mengkoagulasi
plasma, juga menginfeksi bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan
nanah. Eschericia coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, terjadinya diare,
sepsis, dan meningitis. (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). S.aureus (gram
positif) dan E.coli (gram negatif) dipilih untuk mengetahui keefektifan potensi
antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit terhadap bakteri
gram positif dan gram negatif, sehingga dapat diketahui spektrum penghambatan
dari senyawa antibakteri tersebut.
Jan G. Bruhn dan Lars Bohlin pada tahun 1997 memperkenalkan
molecular
pharmacognosy,
yang
mendifinisikan
pharmacognosy
sebagai
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
3
pengetahuan molekuler yang menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari
bahan-bahan alam dengan potensinya sebagai obat. Bahan-bahan alam yang
berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat
baru (Samuelsson, 1999). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan
pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu,
eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan
senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).
1. Permasalahan
Dari latar belakang yang telah diuraikan di atas, permasalahan yang
muncul dalam penelitian ini adalah :
a. Apakah bakteri endofit dapat diisolasi dari batang A.annua L. ?
b. Apakah senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang
A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus ?
c. Bagaimana identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri
terhadap E.coli dan S.aureus tersebut ?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal belum pernah dilakukan penelitian
tentang isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L.
yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S aureus. Penelitian
isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A annua L yang
mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus dilakukan
bersama dengan Rachmawati (2007). Perbedaan dari penelitian bersama ini
adalah digunakan bakteri uji yang berbeda, di mana Rachmawati (2007)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
4
menggunakan bakteri uji Bacillus subtilis dan Salmonella thypii.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang
senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dalam batang
A.annua L. yang memiliki potensi antibakteri.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat menemukan isolat bakteri endofit
penghasil senyawa antibakteri yang dapat mendukung bidang kefarmasian
dan mampu memberikan informasi tentang senyawa antibakteri yang
dihasilkan oleh bakteri endofit sebagai model atau prekursor dalam rangka
penemuan obat baru di masa yang akan datang.
c. Manfaat metodologis
Metode yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan dan
terus dikembangkan dalam usaha pencarian bakteri endofit penghasil
senyawa antibakteri.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengisolasi bakteri endofit dalam batang A.annua L.
2. Menguji potensi senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari
batang A.annua L. terhadap E.coli dan S.aureus.
3. Mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap
E.coli dan S.aureus tersebut.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Antibiotik
Antibiotik didefinisikan sebagai produk metabolit yang dihasilkan oleh
organisme tertentu, yang dalam konsentrasi rendah bersifat merusak atau
menghambat mikrobia lain. Dengan kata lain, antibiotik merupakan zat kimia
yang dihasilkan oleh suatu mikrobia yang dapat menghambat mikrobia lain
(Pelczar & Chan, 1988)
Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri,
yang mempunyai khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan mikrobia,
sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Turunan zat tersebut yang
dibuat secara semi-sintetis termasuk kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis
dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotik (Pelczar & Chan, 1988).
Terjadinya resistensi mikrobia yang tadinya peka terhadap antibiotika
dapat terjadi melalui mutasi pada kromosomnya atau pertukaran materi genetik di
antara mikrobia. Pertukaran materi kromosomal sangat jarang, yang banyak
terjadi adalah pertukaran materi genetik ekstrakromosomal, baik berupa plasmid
konjugatif ataupun plasmid non konjugatif. Secara biokimiawi, resistensi bakteri
terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mekanisme: (i). Berkurangnya
permeabilitas mikrobia terhadap obat, (ii). inaktifasi antibiotika oleh enzim yang
dihasilkan bakteri, (iii). modifikasi reseptor obat, (iv). meningkatnya sintesa
senyawa yang antagonistik terhadap obat (Sjahrurachman, 1996)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
6
Resistensi mikrobia terhadap antibiotika akibat perubahan permeabilitas
dapat terjadi akibat perubahan pada reseptor obat, penurunan kapasitas transpor
obat dan perubahan struktur dinding sel. Mekanisme ini merupakan mekanisme
tersering dalam hal resistensi terhadap tetrasiklin dan sulfonamida. Resistensi
bakteri karena modifikasi obat secara enzimatik banyak ditemukan terhadap
antibiotika beta-laktam, kloramfenikol dan aminoglikosida. Enzim-enzim yang
memodifikasi antibiotika tersebut dapat disandi oleh gen kromosom maupun gen
ekstrakromosom, misalnya pada Staphylococcus yang resisten terhadap penisilin
G, menghasilkan β laktamase yang merusak obat tersebut (Jawetz dkk, 1996).
Resistensi bakteri terhadap antibiotika karena perubahan reseptor dapat ditemukan
pada resistensi terhadap streptomisin. Telah diketahui bahwa pada bakteri yang
resisten, ribosomnya berbeda dibandingkan dengan bakteri yang sensitif terhadap
streptomisin. Hal ini disebabkan terjadinya mutasi noktah satu asam amino pada
ribosom 30S. Dampak klinis resistensi tipe ini tidak begitu penting karena sifatnya
tidak menyebar. Contoh lain resistensi jenis ini adalah resistensi terhadap penisilin
pada bakteri Neisseria gonorrhoeae sebagai akibat perubahan pada penicillin
binding protein (PBP) (Sjahrurachman, 1996).
Bahan-bahan alam telah sejak lama digunakan untuk pengobatan. Bahan
alam meliputi segala organisme seperti tanaman, hewan, dan mikroorganisme.
Obat-obat modern yang digunakan pada masa kini sekitar 40 persennya berasal
dari bahan-bahan alam. Obat-obatan dari bahan alam tersebut termasuk juga jenis
obat-obat penting seperti glikosida jantung, morfin, dan antibiotik. Beberapa jenis
antibiotik merupakan turunan dari bahan-bahan alam yang struktur kimianya telah
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
7
dimodifikasi untuk menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis yang
diinginkan (Samuelsson, 1999).
B. Mikrobia Endofit
Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di dalam jaringan tanaman
pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan
tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Mikrobia endofit tumbuh
di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular
(pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar
dan tunas (Campbell, Reece, Mitchell, 2002). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat
mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa
biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat transfer genetik
(genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan &
Zou, 2001).
Kemampuan mikrobia endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder
sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat
diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang
diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Dari sekitar 300.000 jenis
tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung
satu atau lebih mikrobia endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel &
Daisy, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat
dapat
menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau
bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
8
aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu
yang relatif lama untuk dipanen (Radji, 2005).
Mikrobia endofit
meningkatkan adaptasi ekologi inangnya dengan
menaikkan toleransi mereka pada “stress” lingkungan (lingkungan yang kurang
menguntungkan) dan juga menaikkan resistensi inangnya terhadap fitopatogen
dan atau herbivora termasuk serangga yang memakan tanaman inang. Mikrobia
endofit juga dapat melindungi inangnya dari serangan bakteri atau fungi patogen
dari lingkungan disekitarnya (Tan & Zou, 2001).
Berbagai jenis mikrobia endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman
inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam medium pembenihan yang sesuai.
Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrobia endofit tersebut
dapat diisolasi dan dimurnikan serta dielusidasi struktur molekulnya (Radji,
2005).
Beberapa penelitian terkait dengan mikrobia endofit yang berpotensi
sebagai antibiotik telah dilakukan. Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan
oleh mikrobia endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari
tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang
patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel,
Miller, Miller, Condron, Teplow, & Hess, 1999). Phomopsiahalasin merupakan
metabolit yang diisolasi dari mikrobia endofit Phomopsis spp.berkhasiat sebagai
antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, dan
dapat juga menghambat pertumbuhan fungi Candida tropicalis (Horn, Simmonds,
Schartz, & Blaney, 1995). Antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
9
dihasilkan oleh endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan
endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat
pertumbuhan
Bacillus
anthracis
dan
Mycobacterium
tuberculosis
yang
multiresisten terhadap berbagai obat anti TBC (Castillo et al, 2002).
Ditinjau dari hubungan tersebut, mikrobia endofit berpotensi untuk
digunakan pada pengobatan modern, pertanian, dan industri. Fungi dan bakteri
adalah mikrobia yang paling umum membentuk koloni pada jaringan tanaman,
yang selanjutnya disebut mikrobia endofit (Strobel & Daisy, 2003). Endofit
umumnya tidak ditemukan pada organ yang spesifik tetapi kebanyakan spesies
mikrobia endofit diisolasi dari batang dan juga dari daun (Anonim, 2005).
Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikrobia perlu dilakukan isolasi
untuk memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar & Chan (1986) setiap koloni
yang berlainan mewakili macam mikrobia yang berbeda sehingga hal ini dapat
digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikrobia. Untuk mengisolasi mikrobia
di bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang
akan memenuhi persyaratan tipe mikrobia tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan
dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi,
dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar & Chan,
1986).
Banyak prosedur untuk isolasi mikrobia endofit yang relatif mudah dan
biasa digunakan oleh orang yang terlatih dalam dasar teknik mikrobiologi. Setiap
tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Endofit
tidak menunjukkan tanda- tanda keberadaan mereka sehingga sulit dideteksi dan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
10
hanya dapat diteliti dengan menggoreskan secara hati- hati permukaan jaringan
yang telah dibersihkan dengan etanol dan NaOCl (pemutih). Penambahan dan
waktu untuk pencelupan dalam NaOCl beragam sesuai dengan jaringan dari inang
(Anonim, 2005).
Mikrobia endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang
telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai. Pada
isolasi mikrobia endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong pertumbuhan
tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001).
Medium Murashige-Skoog (MS) merupakan medium yang digunakan untuk
hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-garam
mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ (Hendaryono,
1994). Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur
hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada
bahan-bahan
lain
yang
berguna
untuk
merangsang pertumbuhan
serta
perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman
induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam tanaman tersebut, sehingga
pemberian unsur hara kedalam medium kultur untuk membantu eksplan supaya
dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang
meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan
(Katuuk, 1989)
C. Artemisia annua L.
Tanaman A.annua termasuk Familia Asteraceae ; Genus Artemisia ;
Spesies Artemisia annua L. Mempunyai nama daerah : Anuma (Irian Jaya);
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
11
Anuma (Jawa) (Anonim, 1999)
Tanaman A.annua L. merupakan terna semusim, tinggi 30–100 cm.
Batang tegak, bulat persegi, berwarna hijau kecoklatan. Daun majemuk, bentuk
oval, lonjong, panjang 10-18 cm, lebar 6-15 cm, ujung runcing, pangkal tumpul,
anak daun bentuk oval, tepi bergerigi, pertulangan daun tegas, warna ungu
kehijauan, hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan, terletak di ujung batang,
panjang mencapai 30 cm, kelopak hijau, bentuk bintang, berlekuk lima, mahkota
halus mengelilingi cawan bunga tempat benang sari dan putik, diameter 2-3 mm,
warna putih gading. Biji berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar serabut,
berwarna putih kekuningan. Bagian daun dari tanaman A.annua L. biasa
digunakan sebagai obat demam (anti piretik) dan dapat juga digunakan sebagai
obat anti malaria. Kandungan kimia dari tanaman A.annua L. yaitu saponin,
flavonoida, polifenol, dan minyak atsiri (Anonim, 1999).
A.annua L. adalah tumbuhan obat berupa perdu berasal dari Cina. Di
Cina tumbuhan ini disebut qinghao. Di Amerika Serikat tumbuhan ini dikenal
dengan nama sweet annie atau wormwood. Sejak zaman dulu, menurut catatan
“Chinese Handbook of Prescriptions for Emergency Treatments,” yang dicetak
tahun 340 sebelum Masehi, orang Cina menggunakannya untuk mengobati
demam (Anonim, 2005).
Minyak atsiri yang dihasilkan tanaman Artemisia annua L diketahui
dapat menghambat dengan baik pertumbuhan bakteri Gram Positif Enterococcus.
Kandungan minyak atsiri dari A.annua L meliputi camphor (44%), germacrene D
(16%), trans-pinocarveol (11%), beta-selinene (9%), beta-caryophyllene (9%) and
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
12
artemisia ketone (3%) (Juteau, Masotti, Bessiere, Dherbomez, & Viano, 2002).
Minyak tersebut merupakan metabolit sekunder yang kaya akan senyawa
terpenoid. Contoh umum terpenoid adalah methanol, camphor (monoterpen),
famesol, dan artemisinin (sesquiterpenoid). Artemisinin dan derivatifnya alphaarteether digunakan sebagai antimalaria. Terpen atau terpenoid aktif terhadap
bakteri, fungi, virus, dan protozoa. Mekanisme kerja terpen belum diketahui
dengan baik dan dispekulasi terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa
lipofilik (Anonim, 2005). Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada
mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang
sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah
Bacillus polymixa (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit dapat memproduksi
senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya. Dari hasil
penelitian Simanjuntak (2004), diketahui bahwa mikrobia endofit (Bacillus
polymixa) hasil isolasi dari tanaman A.annua L dapat memproduksi senyawa
antimalaria artemisinin.
D. Rekombinasi Genetik
Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia
endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang
diduga sebagai akibat terjadinya transfer genetik (genetic recombination) dari
tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri endofit dari
tanaman Artemisia annua L. diduga melalui cara transformasi. Transformasi
merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
13
DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA
atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau organisme lainnya.
DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan
DNA bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan (Tjahjoleksono, 2005).
Proses transfer genetik ini melibatkan juga enzim restriksi, enzim restriksi
adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik
yang jumlahnya terbatas, potongan molekul DNA ini disebut fragmen restriksi.
Fragmen restriksi berupa fragmen DNA untai-ganda dengan sedikitnya satu ujung
untai-tunggal, yang disebut ujung lengket (Campbell et al, 2002). Ujung lengket
plasmid bakteri endofit akan berpasangan dengan ujung lengket yang
berkomplementer dari fragmen DNA A.annua L sehingga didapatkan plasmid
rekombinan. Sel bakteri endofit kemudian mengambil plasmid rekombinan
dengan mekanisme transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA
oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri
(DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari
sel bakteri lainnya atau organisme lainnya (Tjahjoleksono,2005). Menurut Radji
(2005), kemampuan bakteri endofit dalam memproduksi senyawa metabolit
sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan suatu koevolusi
antara bakteri endofit dengan tanaman inangnya. Koevolusi adalah pengaruh
mutual pada evolusi dari dua spesies berbeda yang berinteraksi satu sama lain dan
yang secara timbal balik saling mempengaruhi adaptasi masing-masing (Campbell
et al, 2002).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
14
E . Bakteri Uji
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif
dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena tetap mengikat
kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun
diberi larutan pemucat
(alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks kristal
violet-yodium larut sewaktu pemberian larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh
cat lawan yang berwarna merah (Lay, 1994). Dalam penelitian ini, bakteri yang
digunakan sebagai bakteri uji bersifat gram positif yaitu Staphylococcus aureus
dan sebagai gram negatif adalah Eschericia coli.
1. Eschericia coli
E.coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang lurus,
bergerak dengan flagel atau tidak dapat bergerak, mudah tumbuh dengan
pembenihan sederhana. Pada pembiakan, E.coli membentuk koloni bulat
konveks, halus, dan pinggir-pinggir nyata (Jawetz et al, 1986). E.coli
termasuk dalam genus Eschericia, dengan ciri berukuran 1,1-1,5 μ m x 2,0-6,0
μ m, bersifat fakultatif anaerob, tumbuh dengan optimal pada suhu 370 C.
Memberikan reaksi negatif untuk tes oksidase, hidrolisis urea, tes H2S, dan tes
sitrat, mereduksi nitrat, memberikan reaksi positif untuk tes katalase dan tes
Methylen Red (Holt et al, 2000).
E.coli adalah anggota flora usus normal, umumnya tidak menyebabkan
penyakit bila masih dalam usus. E.coli dapat menyebabkan penyakit bila telah
mencapai jaringan di luar tractus digestivus, seperti saluran kemih, saluran
empedu, paru-paru, peritoneum, dan selaput otak (Jawetz et al, 1996).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
15
E.coli adalah penyebab yang paling lazim dari infeksi saluran kemih dan
merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90%
wanita muda. E.coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di
seluruh dunia, dan diklasifikasikan oleh ciri khas sifat-sifat virulensinya
(Jawetz et al, 1996).
Bila pertahanan inang normal tidak mencukupi, E.coli dapat memasuki
aliran darah dan menyebabkan sepsis. E.coli merupakan penyebab meningitis
pada bayi, dan E.coli merupakan penyebab pada sekitar 40% kasus meningitis
neonatal (Jawetz et al, 1996).
2. Staphylococcus aureus
S.aureus adalah jenis bakteri yang berbentuk bulat, berdiameter kurang
lebih 1 μ m, hidup bergerombol seperti buah anggur. Berdasar pengecatan
gram, S.aureus termasuk gram positif yang ditunjukkan dengan warna ungu.
S.aureus mempunyai ciri dapat memfermentasi manitol yang dapat
memberikan warna kuning keemasan pada tes biokimiawi, memberi reaksi
positif terhadap reaksi katalase dan koagulasi (Jawetz et al, 1996).
S.aureus termasuk dalam genus Staphylococcus yang mempunyai ciri non
motil, tidak mempunyai spora, dan bersifat fakultatif anaerob. Koloni dari
Staphylococcus tidak tembus cahaya (opaque), berwarna putih atau krem, dan
kadang berwarna kuning sampai orange, memberi reaksi negatif pada tes
oksidasi, mereduksi nitrat menjadi nitrit. Staphylococcus sering ditemukan
pada produk makanan, sampah, dan air (Holt et al, 2000).
S.aureus sering menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, densitas
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
16
kolonisasi antara lain pada kulit dan selaput lendir manusia, juga menginfeksi
berupa bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah (Jawetz et
al, 1996).
Pada suhu 300C pertumbuhannya sangat cepat, sedangkan pembentukan
pigmen terbaik pada suhu 200C. Koloni pada pembenihan padat berbentuk
bulat, halus, menonjol, dan berkilauan, membentuk pigmen warna kuning.
S.aureus dapat menjadi resisten terhadap banyak zat antimikrobia dan
menyebabkan masalah pengobatan menjadi sulit. Penanahan setempat adalah
kekhususan infeksi S.aureus (Trihendrokesowo, 1986).
F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia
Potensi antimikrobia dapat ditetapkan dengan berbagai cara antara lain :
1.
Metode Difusi
Cara ini berdasarkan kemampuan obat untuk berdifusi dalam medium
tempat mikrobia dapat berkembang biak secara optimal. Disk antibiotik
diletakkan di atas agar atau bila dengan metode sumuran antibiotik
dimasukkan dalam sumuran. Besarnya daerah difusi tergantung dengan
daerah pertumbuhan atau hambatan mikrobia uji dan sebanding dengan
kadar obat yang diberikan. Pada pelaksanaannya, metode difusi ada
beberapa cara, yaitu:
a.
Cara Kirby Bouwer
Cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi mikrobia
tertentu, umumnya 106 Colony Forming Unit (CFU) per-ml pada
permukaan medium hingga merata. Kertas disk yang mengandung
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
17
antibiotik diletakkan di atas medium lalu diinkubasikan pada suhu
37oC selama 18-24 jam, setelah itu dibaca hasilnya. Cara ini dikenal 2
macam zona, yaitu:
1).
Zona radikal adalah suatu daerah di sekitar disk yang sama sekali
tidak ditemukan adanya pertumbuhan mikrobia.
2).
Zona irradikal adalah suatu daerah disekitar disk yang
menunjukkan pertumbuhan mikrobia yang dihambat oleh
antibiotik tersebut tetapi tidak dimatikan (Hugo & Russel, 1987;
Anonim, 1986).
b.
Cara paper disc
Cara ini adalah cara yang paling banyak digunakan untuk
menentukan kepekaan mikrobia terhadap berbagai macam obat-obatan.
Cara ini menggunakan cakram kertas saring atau tablet yang
mengandung suatu obat dengan kekuatan tertentu yang diletakkan pada
lempeng agar yang telah ditanami mikrobia yang akan diperiksa.
Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak memperlihatkan
adanya pertumbuhan mikrobia di sekitar cakram. Lebar hambatan ini
tergantung pada daya resap obat ke dalam agar dan kepekaan mikrobia
terhadap obat tersebut.
Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam. Pada keadaan
tertentu mungkin dapat dilakukan pembacaan pendahuluan setelah
inkubasi selama 6-8 jam, untuk menguatkan kemudian diulang setelah
18-24 jam. Daerah hambatan diukur dalam satuan milimeter, dengan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
18
mengukur seluruh garis tengah hambatan dan cakram (Bonang &
Koeswardono, 1982).
c.
Cara sumuran
Penyiapan dilakukan seperti cara Kirby Bouwer. Setelah biakan
siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus terhadap
permukaan agar, ke dalam sumuran diteteskan larutan uji lalu
diinkubasi selama 24 jam 37oC, setelah itu hasilnya dibaca seperti cara
Kirby Bouwer (Hugo & Russel, 1987).
2.
Metode dilusi
Metode ini menggunakan senyawa anti mikrobia dengan kadar
menurun secara bertahap, baik dengan medium cair atau padat. Kemudian
medium diinokulasikan mikrobia uji dan diinkubasi. Tahap akhir dilarutkan
senyawa antimikrobia dengan kadar yang menghambat atau mematikan.
Pada uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya
dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair dengan
menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai, namun kini
ada cara yang sederhana dan banyak dipakai yakni menggunakan
microdilution plate. Keuntungan mikrodilusi cair adalah bahwa uji ini
memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikrobia yang
dibutuhkan untuk mematikan mikrobia uji (Jawetz et al ,2001).
G. Identifikasi Mikrobia
Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni suatu mikrobia
hasil isolasi perlu ditentukan morfologi sel individual, morfologi koloni, dan sifat-
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
19
sifat biokimianya (fisiologi), patogenisitas dan serologinya (Jutono, Soedarsono,
Hartadi, Kabirun, Suhadi & Soesanto,1980)
Pada identifikasi mikrobia mula-mula diamati morfologi individual
secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai medium. Karena suatu
bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasar sifat-sifat morfologinya saja,
maka perlu diteliti pula sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhannya. Mikrobia yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam
kebutuhan nutrisi serta persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH, dan
sebagainya). Patogenesis mikrobia patogen dapat dipakai untuk membantu
identifikasi dan determinasi bakteri tersebut. Apabila suatu bakteri memiliki sifat
yang hampir sama (terutama yang patogen), maka perlu diselidiki sifat ekologinya
(Jutono dkk,1980).
Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan baku determinasi
oleh Holt et al (2000), yang memuat sifat-sifat bakteri yang telah dikenal.
1. Sifat Morfologi
a.
Morfologi sel individual, meliputi :
1) Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel.
2) Ada tidaknya spora dan kedudukan spora.
3) Ada tidaknya flagella, kedudukan dan jumlah flagella.
4) Ada tidaknya kapsula.
5) Reaksi- reaksi pengecatan.
b.
Morfologi koloni, meliputi : pertumbuhan, bentuk, ukuran, tekstur, bau,
konsistensi, kilat dan ciri- ciri optik dari isolat koloni bakteri pada
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
20
beberapa tipe medium yaitu medium agar miring, tegak dan cair. Pada
medium agar miring koloni bakteri diinokulasikan sepanjang agar secara
goresan dengan ose, pada medium agar tegak koloni bakteri
diinokulasikan secara tusukan, dan pada medium cair koloni bekteri
diinokulasikan langsung pada medium (Jutono dkk, 1980).
2. Sifat Biokimia
Pengujian sifat biokimia meliputi :
a.
Pembentukan asam sulfida (H2S)
Uji ini bertujuan untuk menunjukkan adanya pembentukan H2S pada
medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Jutono dkk, 1980).
b.
Dekarboksilase lisin
Uji
ini
bertujuan
menunjukkan
kemampuan
bakteri
dalam
mendekarboksilasi berbagai asam amino (Lay, 1994).
c.
Pembentukan Indol
Uji pembentukan Indol menunjukkan adanya indol dan triptofan (Jutono
dkk, 1980).
d.
Uji Methylen Red (MR)
Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran (Lay, 1994).
e.
Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai
satu- satunya sumber karbon dan energi. Digunakan medium Simmonsitrat berupa medium padat (Lay, 1994).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
f.
21
Uji katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen
peroksida ( H2O2 ) menjadi air dan O2. Pada bakteri yang bersifat
katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni
(Lay, 1994)
g.
Tes oksidase
Uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang
ditemukan pada mikrobia tertentu (Lay, 1994).
h.
Uji pencairan gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh dari tulang, tulang rawan atau
tenunan ikat hewani lainnya. Hidrolisis gelatin oleh mikrobia tersebut
dikatalisis oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang dicerna
tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair (Lay, 1994).
i.
Uji oksidasi fermentasi (OF)
Uji ini bertujuan untuk menentukan kemampuan mikrobia untuk
memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi (Lay, 1994).
H. Keterangan Empiris
Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia
endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang
diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke
dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).
A.annua L. telah diketahui merupakan tanaman yang menjadi inang
untuk mikrobia endofit, pada tanaman ini diketahui bahwa ada suatu spesies
22
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
bakteri yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar
(Simanjuntak, dkk, 2004). Selain itu minyak essensial yang dihasilkan tanaman
A.annua L. juga diketahui menunjukkan aktivitas antibiotik (Juteau et al, 2002).
Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau
prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 2000). Untuk memperoleh
antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi,
1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif
untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).
Pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri dalam medium
produksinya dilihat dengan mengukur diameter zona hambat. Data untuk
identifikasi isolat bakteri endofit tersebut berupa data-data morfologi koloni,
morfologi sel, dan sifat-sifat biokimianya. Data hasil identifikasi bakteri endofit
kemudian dideterminasi dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al,
2000) untuk mengetahui genus dari bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman
A.annua
L
tersebut.
Penelitian
ini
ditujukan
untuk
mengisolasi
dan
mengidentifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L, dan untuk
menguji potensi isolat bakteri endofit dari tanaman A.annua L terhadap E.coli
dan S.aureus.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat
eksploratif-deskriptif. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a.
Variabel bebas : senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit
yang diisolasi dari batang tanaman A. annua L.
b.
Variabel tergantung : diameter zona hambat (mm).
c.
Variabel pengacau terkendali : waktu inkubasi 24, 48, 72, 120 jam, suhu
inkubasi 370C; medium kultur tanaman inang yaitu MS (MurashigeShoog) medium; medium isolasi bakteri endofit, medium pemeliharaan
bakteri endofit, E.coli, dan S.aureus yaitu NA (Nutrient Agar); medium
produksi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yaitu NB
(Nutrient Broth); batang tanaman A.annua L. yang sehat dan berumur 6
bulan; volume isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang
diinokulasikan dalam paper disk sebanyak 40 μL; volume suspensi E.coli
dan S.aureus setara dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml)
sebanyak 1 ml.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
24
2. Definisi operasional
a.
Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat
(BPTO) Tawangmangu dan diketahui bahwa ada suatu spesies bakteri
yang membentuk koloni dalam jaringan vaskular daerah batang sampai
akar tanaman A.annua L. ini.
b.
Senyawa antibakteri adalah substansi yang dihasilkan oleh isolat bakteri
endofit dalam tanaman
A.annua L. yang mampu menghambat
pertumbuhan atau membunuh E. coli dan S.aureus.
c.
Bakteri endofit dari tanaman A.annua L. adalah bakteri yang membentuk
koloni dalam suatu sistem jaringan vaskular dari tanaman A.annua L.
yang dapat ditumbuhkan di MS Medium dan dapat menghasilkan
senyawa yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan
S.aureus.
d.
Potensi antibakteri adalah kemampuan suatu zat atau substansi yang
dihasilkan oleh bakteri endofit dari tanaman A.annua L. yang mampu
menghambat atau mematikan bakteri E.coli dan S.aureus, ditandai
dengan adanya area hambatan di sekitar paper disk.
e.
Eshericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
dari Laboratorium
Mikrobiologi
Fakultas Kedokteran Universitas
Gadjah Mada, adalah bakteri uji, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri
gram positif yang bersifat patogen terhadap manusia.
f.
MS (Murashige-Shoog) medium adalah medium kultur tanaman A.annua
L. MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
25
untuk mendukung pertumbuhan eksplan ( batang tanaman A.annua L. )
dan mengandung senyawa nitrogen yang berguna dalam regenerasi sel
eksplan.
C. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan penelitian
a.
Tanaman Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman
Obat (BPTO) Tawangmangu dan berumur 6 bulan.
b.
Biakan murni Eschericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus
ATCC 25923 dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada.
c.
Medium kultur tanaman A.annua L yaitu MS (Murashige-Shoog)
medium
dengan
komposisi
:
NH4NO3,
KNO3,
CaCl2.2H2O,
MgSO4.7H2O, KH2PO4, unsur hara mikro, sukrosa, agar, vitamin,
hormon BAP dan 2,4 Diklorofenoksi Asetat, FeSO4.7H2O dan Na2
EDTA,
d.
Medium isolasi bakteri endofit yaitu Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L
dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0;
peptone 5,0; sodium chloride 5,0 agar 15,0.
e.
Medium produksi senyawa anti bakteri yaitu medium Nutrient Broth
(Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder
1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0.
f.
Medium pemeliharaan E. coli, S. aureus, bakteri endofit dan medium
identifikasi bakteri endofit :
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
26
1) Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L dengan komposisi (g/L) : “Lablemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride
5,0 agar 15,0.
2) Nutrien Broth (Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lablemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride
5,0.
g.
Bahan untuk uji biokimia :
1) Uji Oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine.
2) Uji Katalase : reagens hydrogen peroksida (H2O2).
3) Uji hydrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
(Oxoid).
4) Uji Dekarboksilasi lisin : medium LIA (Lisin Iron Agar) (Oxoid).
5) Uji Indol : medium peptone water dan reagens Kovac.
6) Uji MR : medium MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer), methyl
red.
7) Uji hidrolisis gelatin : dengan komposisi Nutrient Broth (Oxoid) dan
12% gelatin.
8) Uji Fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco).
9) Uji Sitrat : medium Simmon’s Citrate (Oxoid).
10) Uji Pergerakan mikrobia : Nutrient Broth (Oxoid), 0,2% – 0,4% Agar
Bacteriologycal (Oxoid).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
h.
27
Bahan untuk pengecatan bakteri :
1) Pengecatan Gram : kristal violet, larutan iodine, alkohol 95%,
safranin.
2) Pengecatan Spora : Malachite green 5%, safranin.
3) Pengecatan Acid Fast : cat Ziehl Neelson Carbolfuchsin, methylen
blue, alkohol 95%.
i.
Paper disc dengan diameter 6 mm.
j.
Kontrol positif : Amoxicilin untuk injeksi (Danoxilin®)
k.
Kontrol negatif yaitu medium Nutrien Broth tanpa inokulasi mikrobia
endofit.
l.
Larutan standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri 6.108
CFU/ml).
m. Aquadest steril.
n.
Alkohol 70%.
o.
Minyak emersi.
p.
Sodium hipoklorit (Bayclin) untuk pembersihan batang A.annua L.
q.
Tween 80 sebagai wetting agent pada proses pembersihan batang
A.annua L.
2. Alat penelitian
Autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd. Midorigouka Kamurashi, Tokyo,
Japan), Microbioogical Safety Cabinet (lokal), Inkubator (Memmert, tipe BE
400, Swahabach FRG, Germany), Vortex (Stuart Scientific); Neraca analitik
(Mettler Pc 2000); Sentrifuge (Heraeus Christ); Oven (WTC Binder);
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
28
Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30); mikropipet (Nichiryo 5000 DG),
Shaker Resiprok (Imorius Utrecht); beker glass (Pyrex), lemari pendingin
(Sharp, Japan), Cawan petri (Pyrex), kaca steril, pisau, botol kultur, Pipet
volume, Pipet tetes, glass firm, Tabung sentrifuge, Tabung reaksi, kaca arloji,
Erlenmeyer, Pinset, lampu spiritus, jarum inokulasi, penggaris, jarum ose, dan
alat- alat gelas.
D. Tahapan Penelitian
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.
Determinasi tanaman A.annua L. dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman
Obat ( BPTO ), Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dengan
menggunakan kunci determinasi menurut Backer ( 1968 )
2. Pengumpulan Batang Artemisia annua L.
Sampel batang yang sehat (bagus/ tidak rapuh) tanaman A.annua L. yang
diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ) Tawangmangu,
Karanganyar, Jawa Tengah, dipilih yang telah berumur dewasa, yakni yang
berumur 6 bulan. Sampel yang berupa batang disimpan di dalam kantong
plastik untuk mengurangi penguapan selama perjalanan dan penyimpanan
sementara.
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
a. Penimbangan unsur makro
Ditimbang bahan-bahan untuk unsur makro, antara lain
: 1,65 g
NH4NO3 ; 1,9 g KNO3 ; 0,44 g CaCl2.2H2O ; 0,37 g MgSO4.7H2O ; 0,17
g KH2PO4.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
29
b. Pembuatan larutan stok
1) Pembuatan larutan stok hara mikro
Ditimbang bahan-bahan untuk stok mikro, antara lain : 41,5 mg
kalium iodida; 310,0 mg
asam borat; 845,0 mg mangansulfat-
tetrahidrat; 430,0 mg sengsulfat-heptahidrat; 1,25 mg tembaga (II)
sulfat; 12,5 mg natriummolibdat-dihidrat; 1,25 mg kobalt (II) kloridaheksahidrat.
Masing-masing bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam
Beaker Glass 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest, diaduk
hingga larut. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml,
diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium
dibutuhkan 5 ml larutan stok ini.
2) Pembuatan larutan stok besi
Besi (II) sulfat-heptahidrat ditimbang sebanyak 139 mg dan 186,5
mg natrium etilen diamin tetra asetat. Dilarutkan dalam aquadest
masing-masing 15 ml secara terpisah. Untuk natrium etilen diamin
tetra asetat dibantu dengan pemanasan. Setelah larut dicampur dalam
Erlenmeyer dan diaduk rata. Larutan tersebut kemudian dipindahkan
ke dalam labu ukur 50 ml. Erlenmeyer tersebut dibilas dengan sisa
aquadest dan masukkan dalam labu ukur tersebut sampai tanda. Untuk
1 liter medium dibutuhkan 5 ml stok ini.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
30
3) Pembuatan larutan stok vitamin
Erlenmeyer diisi dengan 50 ml aquadest, kemudian berturut-turut
dimasukkan 250,0 mg asam nikotinat; 250,0 mg piridoksin; 50,0 mg
tiamin; dan 100,0 mg glisin. Diaduk hingga jernih, kemudian
dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml. Ditambahkan aquadest
sampai tanda. Untuk 1 liter medium membutuhkan 5 ml larutan stok.
4) Pembuatan larutan stok mio-inositol
Ditimbang 10,0 mg mio-inositol, kemudian dimasukkan ke dalam
Beaker Glass satu liter yang terlebih dahulu telah diisi dengan 700 ml
aquadest. Setelah larut, dipindahkan ke dalam labu ukur 1 liter dan
diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium
dibutuhkan larutan stok sebanyak 10,0 ml.
c. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker
Glass 1000 ml, kemudian bahan- bahan nutrisi makro dimasukkan ke
dalam Beaker Glass, sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer.
Selanjutnya berturut-turut dimasukkan 5 ml larutan stok hara mikro; 5 ml
larutan stok besi; 5 ml larutan stok vitamin; serta 10 ml larutan stok mioinositol dalam campuran medium. Kemudian dimasukkan campuran 30 g
sukrosa dan 8-10 g agar. Aquadest ditambahkan sampai kurang lebih 1000
ml, diaduk, dan dipanaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih,
Beaker Glass diangkat dari pemanas. Zat pengatur tumbuh golongan
sitokinin yaitu BAP (Benzilaminopurin) ditambahkan sebanyak 1 ppm dan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
31
medium dibagi menjadi tiga bagian untuk membuat variasi zat pengatur
tumbuh. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D). pH
larutan medium diatur 5,2- 5,6. Jika terlalu alkali ditambahkan HCl 1N,
tetapi jika terlalu asam ditambahkan KOH 1N. Larutan medium
dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan medium kurang lebih
satu cm. Botol tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil,
kemudian disterilisasi dengan autoklaf (121 °C, 15 menit). Medium yang
telah disterilkan tersebut selanjutnya disimpan ke dalam inkubator.
4. Desinfeksi Batang Artemisia annua L.
Batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit. Setelah itu,
batang dicuci dalam 10 ml bayclin (commercial bleaching yang mengandung
5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian bilas dengan
aquadest steril sampai bersih.
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium
Batang tanaman Artemisia annua L. yang telah dibersihkan ditanam secara
aseptis ke dalam MS medium. Penanaman dilakukan dengan menggunakan
pinset steril dan batang yang telah dibersihkan dipotong sepanjang ± 0,5-0,8
cm dan ditanamkan ke permukaan MS medium dengan hati-hati. Penanaman
batang dalam posisi horisontal dengan bekas potongan tertanam di permukaan
MS medium, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, akan
tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
32
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate
Setelah
didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan
isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk
mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Satu ose mikrobia yang didapat
diinokulasikan pada nutrient agar secara streak plate. Diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 24 jam. Akan didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah.
Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam
medium NA miring untuk stok mikrobia.
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli
dan S.aureus Secara Difusi Paper disc
a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji
Diambil ± 1 ose dari stok bakteri uji dari biakan murni E.coli ATCC
35218 dan S.aureus ATCC 25923, kemudian diinokulasikan pada Nutrien
Broth (NB) 9 ml sampai konsentrasi 6 x 108 CFU/ml (Larutan Standar
Mac Farland II).
b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap
E.coli dan S.aureus
Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 6 diuji potensi
antibakterinya terhadap E.coli dan S.aureus dengan metode Paper Disc
Agar Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian
ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth dan digojog menggunakan
shaker inkubator pada suhu 37° C dengan kecepatan 170 rpm selama 3-4
hari. Pemisahan biomassa sel dengan medium Nutrient Broth yang
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
33
mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan
dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam, supernatan
dipakai untuk skrining bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri.
Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 μl
supernatan. Untuk mengurangi ekses air, paper disc dikeringanginkan di
atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1 jam. Mikrobia uji yaitu E.coli
dan S.aureus ditumbuhkan dalam NA secara pour platting pada petri yang
berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri uji E.coli dan S.aureus
sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Agar
yang sedang mencair pada temperatur 50oC lalu dituang ke dalam cawan
petri dan digoyang perlahan- lahan untuk mencampur kultur bakteri
dengan agar. Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi
supernatan ditempatkan di permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada
suhu 37oC selama 24 jam atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar
paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan mengukur diameter zona
jernihnya menggunakan penggaris.
8. Identifikasi Bakteri Endofit
a. Morfologi sel
1) Pengecatan Gram
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam,
difiksasi di atas pembakar spiritus. Diteteskan cat kristal violet dan
didiamkan selama 45 detik. Sisa cat dicuci dengan air mengalir lalu
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
34
ditetesi larutan iodine dan didiamkan selama 1,5 menit. Dicuci dengan
air mengalir dan diberi larutan peluntur safranin, didiamkan selama 20
detik, kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan
menggunakan minyak immersi. Jika sel bakteri berwarna ungu berarti
isolat bakteri endofit yang diisolasi termasuk bakteri gram positif.
Tetapi jika sel bakteri berwarna merah berarti isolat bakteri endofit
termasuk bakteri gram negatif.
2) Pengecatan Spora
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dan
difiksasi di atas pembakar spiritus. Ditetesi dengan malachite green
dan dipanasi selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir lalu diberi cat
safranin dan didiamkan selama 30 detik kemudian dicuci di bawah air
mengalir lalu dikeringanginkan dan diamati di bawah mikroskop
dengan perbesaran kuat 1000X dengan minyak immersi. Spora
berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.
3) Pengecatan Acid Fast
Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada
kaca obyek dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Lalu ditutup
dengan sepotong kertas filter, ditambah larutan carbolfuchsin dan
dipanaskan di atas pembakar spiritus dengan nyala api kecil.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
35
Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Dicuci
dengan larutan peluntur sambil digoyang- goyangkan sampai seluruh
warna dari carbolfuchsin tidak tampak. Dicuci dengan air mengalir dan
dikeringkan. Setelah itu ditambahkan dengan metylen biru selama 2030 detik. Dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat 1000X.
Bakteri yang tidak tahan terhadap pencucian asam akan berwarna biru
sedangkan bakteri yang tahan asam akan berwarna merah.
4) Uji pergerakan
Isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan
paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam diinokulasi dengan
cara tusukan dalam agar tegak dengan kandungan agar 0,2% – 0,4%.
Akan tampak pergerakan bakteri yang berupa serabut- serabut halus
disekitar tusukan, pergerakan bakteri ini disebabkan karena bakteri
memiliki flagela.
b. Morfologi Koloni
Diinokulasikan biakan bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 ke dalam medium cair ( Nutrient
Broth), NA tegak dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan,
dan NA miring secara goresan dengan jarum ose. Diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 24 jam. Pada medium cair diamati pertumbuhan pada
permukaan, endapan yang terjadi, bau, dan kekeruhan. Pada NA tegak
diamati tingkat pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan.
Pada NA miring diamati tingkat pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
36
bekas tusukan, kilat, topografi, warna, ciri- ciri optik, bau, konsistensi dan
warna medium.
c. Uji biokimia
1) Uji pembentukan H2S
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dengan jarum inokulasi secara tusukan pada medium TSIA miring
dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan dengan
menggunakan ose. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC.
Pengamatan uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium
yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa
inokulasi bakteri endofit). Pembentukan H2S ditunjukkan dengan
terbentuknya endapan hitam yang berarti bakteri mampu menghasilkan
senyawa desulfurase, selain itu dapat digunakan untuk mengamati
fermentasi gula. Jika pada bagian bawah medium berwarna kuning
sedang bagian atas berwarna merah berarti terjadi fermentasi glukosa.
Jika baik pada bagian atas ataupun bawah medium berwarna kuning
dan kadangkala disertai pembentukan gas berarti laktosa atau sukrosa
atau keduanya difermentasikan. Dan jika seluruh medium berwarna
merah berarti ketiga macam gula tidak difermentasikan.
2) Uji dekarboksilasi lisin
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
37
jam dengan cara tusukan dalam medium Lysin Iron Agar (LIA)
kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam.
Pengamatan uji dekarboksilasi lisin dilakukan dengan membandingkan
medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap
kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Hasil
diamati, positif bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning
pada umur 24 jam dan kemudian berwarna ungu kembali. Perubahan
warna menjadi kuning menandakan bakteri dapat melakukan
fermentasi dan kembali berwarna ungu yang berarti lisin mengalami
dekarboksilasi.
3) Uji Indol
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dalam masing- masing tabung reaksi yang berisi medium tripton
water. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu
ditambahkan reagen Kovac. Pengamatan uji Indol dilakukan dengan
membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit
terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Memberikan hasil
positif apabila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan
medium. Hal ini dikarenakan bakteri dapat menghasilkan enzim
triptofanase.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
38
4) Uji Methyl Red
Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam dengan jarum inokulasi pada masing- masing tabung yang berbeda
berisi medium MR-VP. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.
Pengamatan uji Methyl Red dilakukan dengan membandingkan
medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol
(tanpa inokulasi bakteri endofit). Pada uji MR ditambah reagen methyl
red. Bakteri yang tidak dapat memfermentasikan gula akan merubah
warna menjadi merah pada uji MR. Sedangkan apabila terjadi
fermentasi gula, medium akan berubah menjadi kuning.
5) Uji sitrat
Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai
potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48
jam pada medium simmon’s citrate secara miring. Diinkubasi pada
suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan uji sitrat dilakukan dengan
membandingkan medium simmon’s citrate yang diinokulasikan isolat
bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).
Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri
mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon.
6) Uji katalase
Satu ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 diletakkan pada gelas benda.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
39
Ditambahkan 1 tetes 30% H2O2. diamati dengan melihat terjadi atau
tidaknya pembentukan gelembung udara di sekitar koloni bakteri
endofit setelah diberi reagens 30% H2O2 dan dibandingkan dengan
kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). jika terjadi gelembung udara
berarti bakteri memiliki enzim katalase.
7) Uji Oksidase
Pada kertas saring diteteskan reagens tetrametil paraphenildiamin.
Pada kertas saring yang diberi reagens diletakkan 1 ose kultur isolat
bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik
pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam. Diamati hasilnya dengan melihat
apakah terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu tua
setelah diberi reagens dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa
inokulasi bakteri endofit). Jika terjadi warna ungu tua setelah
didiamkan selama 10 menit berarti hasil positif bahwa bakteri uji
memiliki enzim oksidase sitokrom. Sedangkan hasil negatif ditandai
dengan tidak terjadinya perubahan warna.
8) Uji hidrolisis gelatin
Diinokulasi kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi
penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam secara
tusukan pada medium dengan komposisi gelatin 12% dan nutrient
broth dengan takaran 13 gram/L kemudian diinkubasikan selama 72
jam. Setelah 72 jam, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30
menit. Diamati apakah terjadi pencairan gelatin atau tidak dan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
40
dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).
Apabila terjadi pencairan gelatin berarti bakteri mampu menghasilkan
eksoenzim gelatinase.
9) Uji fermentasi karbohidrat
Dua tabung berisi medium O-F diinokulasi dengan kultur isolat
bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik
pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam menggunakan jarum inokulasi
secara tusukan dan dua tabung sebagai kontrol (tanpa inokulasi bakteri
endofit), tabung pertama ditetesi parafin dan tabung kedua tanpa
ditetesi parafin kemudian diinkubasikan pada suhu 37o selama 48 jam.
Hasil diamati dengan melihat perubahan warna medium O-F. Warna
awal medium O-F adalah hijau. Jika pada medium yang ditutup
paraffin tetap berwarna hijau sedangkan yang tidak ditutup paraffin
warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti bakteri endofit
mampu memetabolisme karbohidrat secara oksidasi. Tetapi jika pada
tabung dengan medium O-F yang ditutup paraffin ataupun tidak
ditutup paraffin, warna mediumnya berubah menjadi kuning berarti
bakteri endofit mampu memetabolisme karbohidrat secara fermentasi.
E. Analisis Hasil
Medium yang digunakan untuk isolasi bakteri endofit dari batang Artemisia
annua L. adalah MS (Murashige-Shoog) medium. Isolat bakteri endofit kemudian
dilakukan reisolasi secara streak plate pada Nutrient Agar dalam petri supaya
didapatkan kultur murni bakteri endofit. Potensi antibakteri isolat bakteri endofit
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
41
penghasil senyawa antibakteri diujikan pada S aureus dan E.coli menggunakan
metode difusi dengan paper disk, potensi antibakteri diketahui dengan cara
mengukur zona hambat yang terbentuk di sekitar paper disk dengan menggunakan
penggaris. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan melihat sifat morfologi
sel, morfologi koloni dan pengujian sifat biokimia. Dari sifat- sifat tersebut dapat
diidentifikasi bakteri endofit yang bersifat antibakteri terhadap S.aureus dan
E.coli dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000) sehingga dapat
ditentukan genus dari bakteri endofit tersebut. Seluruh data pengamatan
dideskripsikan dengan dilengkapi foto dan gambar mikrofotografi.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
42
Pengumpulan batang tanaman Artemisia annua L.
Pembersihan batang tanaman Artemisia annua L.
Penanaman batang tanaman Artemisia annua L pada MS medium untuk isolasi
bakteri endofit
Isolasi dan Reisolasi bakteri endofit secara streak plate
Isolat murni bakteri endofit
Skrining bakteri endofit dengan metode paper disk
Identifikasi bakteri endofit
Morfologi sel :
- sifat gram
- rangkaian sel
- bentuk sel
- pergerakan
Morfologi koloni :
Medium cair (NB)
- tekstur permukaan
- kekeruhan
- bau
- endapan
Medium padat (NA)
- bentuk pertumbuhan
- konsistensi
- warna
Sifat biokimia :
- H2S
- dekarboksilasi lisin
- indol
- MR
- sitrat
- katalase
- oksidase
- gelatin
- fermentasi
Determinasi isolat bakteri endofit menggunakan panduan baku Bergey’s Manual
of Determinative Bacteriology (Holt et al, 2000)
Genus isolat bakteri endofit
Gambar1. Skema Kerja Penelitian
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.
Identifikasi tanaman (disebut juga dengan determinasi tanaman) adalah
penentuan nama ilmiah suatu tanaman yang didasarkan pada acuan suatu
sistem klasifikasi tanaman (Stace, 1989). Determinasi tanaman bertujuan
untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan untuk penelitian.
Tanaman yang akan digunakan dalam penelitian adalah Artemisia annua L.
yang dideterminasi sampai tingkat spesies. Determinasi tanaman dilakukan
oleh Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO), Tawangmangu, dengan
menggunakan kunci determinasi menurut Backer (1968) (Lampiran 1).
Berdasarkan determinasi hingga kategori spesies tersebut, maka tanaman
yang digunakan dalam penelitian ini adalah Artemisia annua L. (Lampiran 2).
Artemisia annua L. merupakan anggota familia Asteraceae (sinonim
Compositae) (Backer & Brink,1965).
2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L.
Batang tanaman yang akan digunakan untuk penelitian diperoleh dari
Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ), Tawangmangu, dan dipilih tanaman
A.annua L. yang berumur dewasa dan sehat ( berumur ± 6 bulan ). Mikrobia
endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al,
2000). Jaringan vaskular (pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman,
mengangkut zat-zat antara akar dan tunas. Kedua jenis jaringan vaskular
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
44
tersebut adalah xilem, yang mengirim air dan mineral yang terlarut ke atas
dari akar ke tunas, dan floem, yang mengangkut makanan yang dibuat di daun
yang sudah dewasa ke akar dan ke bagian-bagian sistem tunas (Campbell et
al, 2002). Pada tanaman yang terlalu muda, jaringan vaskular yang terbentuk
belum sempurna sehingga kemungkinan munculnya bakteri endofit kecil
karena nutrien yang diperlukan untuk tumbuhnya bakteri endofit kurang.
Apabila batang tanaman yang dipilih kurang sehat kemungkinan jaringan
tanaman di dalam batang tersebut sudah ada yang rusak sehingga tidak dapat
menghasilkan nutrien secara maksimal untuk tumbuhnya bakteri endofit.
Jaringan tanaman yang sehat dapat menghasilkan nutrien yang cukup untuk
tumbuhnya bakteri endofit (Pudaritadesantamaria, 2004). Nutrien adalah
substansi yang digunakan untuk biosintesis dan sebagai sumber energi untuk
mendukung pertumbuhan mikrobia (Prescott, Harley & Klein, 1999).
Digunakan batang tanaman A.annua L. karena dalam batang A.annua L.
terdapat jaringan vaskular sebagai tempat tumbuh bakteri endofit.
3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)
Medium tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap
pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Macam-macam medium kultur telah
ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama medium tumbuh
untuk eksplan ini biasanya sama dengan nama penemunya, antara lain adalah:
Medium Murashige dan Skoog (MS), Medium Gamborg, Medium Vacin
Went (VW), Medium Woody Plant Medium (WPM), dan lainnya. Medium
tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
sama, hanya agak berbeda dalam besarnya
kadar
untuk
45
tiap-tiap
persenyawaan. Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro
dan unsur hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur
juga harus ada bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang
pertumbuhan
serta
perkembangan
sel
jaringan
yang
dikulturkan
(Hendaryono,1994). Agar supaya batang tanaman A.annua L. tetap tumbuh,
berkembang dan menyokong pertumbuhan dari bakteri endofit pada saat
proses isolasi bakteri endofit diperlukan lingkungan yang cocok untuk batang
tanaman A.annua L. tersebut, karena itu diperlukan proses kultur jaringan
untuk
batang tanaman A.annua L. Batang tanaman A.annua L ini dapat
disebut juga eksplan, yaitu bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan
atau dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan (Katuuk,1989).
Pemisahan batang tanaman A.annua L. dari tanaman induk menyebabkan
perubahan biosintesa dalam batang tanaman A.annua L. tersebut, sehingga
pemberian unsur hara ke dalam medium kultur untuk membantu batang
tanaman A.annua L. supaya dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu
adalah bahan organik yang meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta
zat yang mengatur pertumbuhan. MS medium merupakan medium yang paling
banyak digunakan untuk induksi kalus (Katuuk, 1989). Medium yang
digunakan untuk kultur batang tanaman A.annua L adalah MS medium. MS
Medium dipilih sebagai medium kultur batang tanaman A.annua L karena MS
Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap untuk
mendukung pertumbuhan eksplan dan mengandung senyawa nitrogen yang
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
46
berguna dalam regenerasi sel eksplan. Bakteri endofit dalam batang tanaman
A.annua L. dapat tumbuh karena mendapat nutrien dalam jaringan vaskular
batang tanaman A.annua L. (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular berfungsi
untuk transportasi nutrien tanaman A.annua L., jadi nutrien yang digunakan
tanaman A.annua L. untuk tumbuh digunakan juga oleh bakteri endofit
tersebut untuk tumbuh, sehingga diharapkan bakteri endofit tersebut juga
dapat tumbuh dalam MS medium.
4. Desinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L.
Pembersihan batang tanaman A.annua L. dilakukan untuk menghilangkan
menghilangkan kotoran dan mikrobia kontaminan dari permukaan batang
tanaman A.annua L., sehingga pada tahap isolasi bakteri endofit dari batang
A.annua L. akan diperoleh isolat murni bakteri endofit. Cara pembersihannya
yaitu batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit kemudian batang
dicuci dalam 10 ml bayclin® (commercial bleaching yang mengandung 5,3%
sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian dibilas dengan
aquadest steril sampai bersih. Bayclin® berfungsi sebagai desinfektan untuk
menghilangkan kotoran, bakteri dan fungi yang ada pada batang sehingga
ketika batang ditanam pada medium tidak tumbuh fungi atau bakteri
kontaminan di sekitarnya. Tween 80 merupakan suatu surfaktan yang
berfungsi untuk menaikkan kontak desinfektan (Bayclin® ) dengan batang
tanaman A.annua L., sehingga dapat membersihkan batang A.annua L. dari
kotoran dan mencegah adanya kontaminasi fungi dan bakteri. Tujuan
pembilasan dengan aquadest steril adalah untuk menghilangkan busa Tween
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
47
80 yang masih menempel pada batang yang dapat mengganggu pertumbuhan
bakteri endofit.
5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium
Batang yang telah dibersihkan kemudian dipotong menggunakan pisau
steril sepanjang ± 0,5-0,8 cm dan ditanam menggunakan pinset steril secara
aseptis ke permukaan medium MS. Penanaman batang dalam posisi horisontal
dengan bekas potongan tertanam di permukaan MS medium, kemudian
diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, tampak pertumbuhan bakteri
endofit di sekitar batang A.annua L. (Lampiran 3).
Bakteri endofit ini hanya akan tumbuh di sekitar batang A.annua L.
karena bakteri endofit ini pada awalnya memperoleh nutrien dari batang
A.annua L.. Pertumbuhan bakteri endofit di MS Medium akan tampak berbeda
dengan mikrobia kontaminan. Mikrobia kontaminan akan memenuhi seluruh
permukaan MS Medium setelah inkubasi.
Munculnya bakteri endofit tersebut karena terdapat hubungan simbiosis
antara bakteri endofit dan tanaman A.annua L., di mana bakteri endofit
memperoleh nutrien dan pelindungan dari tanaman A.annua L.. Peran nutrien
yang diperoleh dari tanaman A.annua L. bagi bakteri endofit adalah sebagai
sumber energi sesuai kebutuhan sel bakteri endofit, dan sebagai bahan
pembangun sel bakteri endofit. Sebagai timbal baliknya, tanaman A.annua L.
memperoleh substansi dari bakteri endofit yang berguna untuk mendukung
pertumbuhan
tanaman
A.annua
L..
Bakteri
endofit
memproduksi
phytohormones seperti indole-3-acetic acid (IAA), cytokines, dan substansi
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
48
lainnya yang mendukung pertumbuhan tanaman (Tan & Zou, 2001). Bakteri
endofit juga memberikan perlindungan kepada tanaman inang dari berbagai
mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik,
atau menginduksi ketahanan tanaman. Bakteri endofit yang diisolasi dari akar
pisang telah diketahui dapat menghambat pertumbuhan Fusarium oxysporum
penyebab
penyakit
layu
Fusarium
pada
tanaman
pisang
(Pudaritadesantamaria, 2004).
Bakteri endofit mengkoloni jaringan vaskular dari tanaman A.annua L.,
sehingga bakteri endofit tersebut hidup di lingkungan yang kaya akan nutrien,
oleh karena itu transpor nutrien dari tanaman A.annua L. ke dalam bakteri
endofit dapat terjadi dengan mekanisme difusi pasif dan difusi terfasilitasi.
Difusi pasif adalah proses berpindahnya molekul dari konsentrasi yang tinggi
menuju konsentrasi rendah, kecepatan dari difusi pasif dipengaruhi oleh
besarnya gradien kadar dari molekul. Kecepatan dari difusi nutrien menembus
membran sel dapat ditingkatkan dengan menggunakan protein carrier yang
terdapat dalam plasma membran sel, mekanisme ini disebut difusi terfasilitasi.
Protein carrier menyerupai enzim yang spesifik untuk setiap nutrien yang
akan ditransportkan (Prescott, 1999).
Bakteri endofit dalam batang A.annua L dapat memproduksi senyawa
metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya, metabolit sekunder yang
berpotensi sebagai antibiotik ini diduga sebagai hasil transfer genetik (genetic
recombination) dari A.annua L. ke dalam bakteri endofit. Mekanisme transfer
genetik bakteri endofit dengan A.annua L. secara alami belum diketahui
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
49
secara pasti. Bioteknologi dapat dijadikan pendekatan untuk mengetahui
bagaimana proses transfer genetik ini berlangsung. Praktek-praktek dalam
bioteknologi selalu mengandalkan proses genetik alami, seperti mutasi dan
rekombinasi genetik (Campbell et al, 2002). Proses transfer genetik antara
bakteri endofit dengan tanaman A.annua L diduga berlangsung dengan
melibatkan plasmid dari bakteri endofit. Plasmid adalah molekul DNA kecil,
sirkular, dan dapat bereplikasi sendiri di dalam sitoplasma sel bakteri
(Campbell et al, 2002).
6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate
Isolasi adalah memisahkan suatu mikrobia dari lingkungan di alam dan
menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium biakan (Jutono, dkk,
1980). Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan
isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk
mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Diinokulasikan 1 ose bakteri
endofit yang tumbuh di sekitar batang A.annua L. Pada MS Medium secara
streak plate ke permukaan Nutrient Agar dalam cawan petri. Diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 24 jam, kemudian didapat koloni- koloni bakteri yang
terpisah. Dari tahap reisolasi ini diperoleh koloni- koloni bakteri terpisah yang
berbentuk circulair, berwarna putih kekuningan, dan terpisah satu sama lain
(Lampiran 4). Kemudian diambil 4 koloni (masing-masing diberi kode Bakteri
Endofit A, B, C, dan D) dan masing- masing koloni ditumbuhkan dalam
medium NA miring untuk stok bakteri endofit yang akan diuji potensi
penghambatannya terhadap S.aureus dan E.coli. Digunakan medium agar
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
50
miring untuk memperoleh permukaan yang lebih luas untuk pertumbuhan
bakteri endofit. Stok bakteri endofit menggunakan Nutrien Agar (Oxoid)
karena di dalam medium ini terkandung nutrien yang berguna untuk
pertumbuhan bakteri endofit. Nutrien adalah substansi anorganik dan organik
yang diperoleh dari lingkungan, diperlukan pada biosintesis dan produksi
energi dari sel, dan digunakan sebagai sumber energi untuk mendukung
pertumbuhan mikrobia (Prescott et al, 1999)
Nutrien Agar (Oxoid) ditinjau secara kimiawi termasuk dalam medium
sintetik, dalam Nutrien Agar terkandung nutrien yang mendukung
pertumbuhan bakteri. Yeast extract (ekstrak khamir) merupakan suatu sumber
yang amat kaya akan vitamin B, juga mengandung Nitrogen organik dan
senyawa-senyawa karbon. Pepton merupakan sumber utama Nitrogen organik,
dapat pula mengandung vitamin dan karbohidrat. Karbon digunakan oleh
bakteri untuk memproduksi karbohidrat dan senyawa-senyawa organik lain
yang digunakan sebagai makanan. Vitamin berfungsi membentuk subtansi
yang mengaktivasi enzim (bagian dari koenzim). Agar digunakan sebagai
bahan pemadat medium, agar bukan merupakan sumber nutrien bagi bakteri
(Pelczar & Chan, 1986).
Koloni terpisah bakteri isolat endofit kode A, kode B, kode C, kode D
yang telah ditumbuhkan dalam medium NA miring diinkubasi pada suhu 370
C selama 24 jam. Setelah proses inkubasi, ternyata yang dapat tumbuh dengan
baik hanya bakteri endofit kode B dan kode D. Bakteri endofit kode A dan
kode C terhambat pertumbuhannya. Hal ini dapat disebabkan karena
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
51
persyaratan nutrien maupun kondisi fisik dari medium biakan kurang sesuai
untuk mendukung pertumbuhan bakteri endofit kode A dan kode C. Untuk
mendapatkan media tumbuh yang baik untuk bakteri endofit, diperlukan
media pra-pengayaan dan media pengayaan. Nutrien yang pada umumnya
diperlukan bakteri adalah macroelements dan microelements. Macroelements
meliputi karbon, oksigen, hidrogen, nitrogen, sulfur, fosfor, potassium,
kalsium, magnesium, dan besi. Microelements meliputi mangan, zinc, kobalt,
molybdenum,
dan
nikel.
Persyaratan
fisik
yang
dibutuhkan
untuk
pertumbuhan bakteri meliputi suhu, tekanan atmosfer, dan pH. Beberapa jenis
bakteri mempunyai persyaratan tambahan untuk dapat tumbuh dengan
optimum. Pertumbuhan bakteri tertentu dapat dipengaruhi oleh keadaan
tekanan osmotik (tenaga atau tegangan yang terhimpun ketika air berdifusi
melalui suatu membran) atau tekanan hidrostatik (tegangan zat alir). Tidak ada
satu pun perangkat kondisi yang memuaskan bagi kultivasi semua bakteri di
laboratorium. Bakteri amat beragam baik dalam persyaratan nutrien maupun
fisiknya. Beberapa bakteri mempunyai persyaratan nutrien yang sederhana,
sedangkan yang lain mempunyai persyaratan yang rumit (Pelczar & Chan,
1986). Dari hasil pengamatan, bakteri endofit kode B dan kode D dapat
tumbuh dengan baik di medium biakan, oleh karena itu bakteri endofit kode B
dan kode D digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu pengujian potensi
antibakteri isolat bakteri endofit terhadap S.aureus dan E.coli
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
52
7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap S.aureus dan E.coli
Secara Difusi Paper disc
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Suspensi S.aureus dan E.coli dipersiapkan dengan cara mengambil
biakan murni E.coli ATCC 35218 dan S.aureus ATCC 25923 ± 1 ose yang
telah diinkubasi 37oC selama 24 jam untuk disuspensikan ke dalam 9 ml
Nutrien Broth. Menurut Koneman et al (1997), kekeruhan suspensi
inokulum disesuaikan dengan kekeruhan larutan standar Mc Farland II
sehingga diperoleh kepadatan bakteri uji setara kepadatan bakteri 6 x 108
CFU/ ml. Larutan standar Mc Farland II digunakan untuk mengetahui
jumlah sel bakteri, sehingga diharapkan suspensi S.aureus dan E.coli yang
digunakan sebagai bakteri uji, mempunyai kepadatan bakteri 6 x 108 CFU/
ml. Tujuan disamakannya kepadatan bakteri uji setara larutan standar Mc
Farland II adalah untuk mendapatkan kepadatan bakteri uji yang sama
untuk setiap replikasi. Pengujian potensi antibakteri isolat bakteri endofit
terhadap S.aureus dan E.coli ini dilakukan dengan tiga kali replikasi.
b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri
Terhadap S.aureus dan E.coli
Pengujian potensi antibakteri dilakukan dengan metode difusi
menggunakan paper disk (Paper Disc Agar Diffusion Method). Untuk uji
ini, isolat bakteri endofit B dan endofit D ditumbuhkan dalam medium
Nutrient Broth (NB). Medium tersebut kemudian dishaker selama empat
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
53
hari (96 jam) dengan tujuan untuk aerasi dan diharapkan mendapat
biomassa sel secara optimal. Pemilihan waktu empat hari (96 jam)
berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wahyuningsih (2006), pada
hari keempat (96 jam) umumnya bakteri telah mencapai fase stasioner dan
menghasilkan metabolit sekunder. Metabolit sekunder inilah yang menurut
Betina (1983) sering diistilahkan sebagai antibiotik. Dari penelitian yang
dilakukan oleh Wahyuningsih (2006) digunakan kecepatan shaker 170 rpm
sehingga penelitian ini ditetapkan menggunakan kecepatan shaker 170
rpm. Penggojogan dilakukan dengan tujuan agar seluruh nutrisi yang
dikandung medium dapat digunakan oleh bakteri secara optimal sebagai
bahan untuk proses metabolismenya sehingga senyawa antibakteri dapat
dihasilkan dengan optimal. Selain itu penggojogan dengan kecepatan 170
rpm dimaksudkan agar bakteri mampu mensekresikan senyawa antibakteri
yang dihasilkannya ke dalam medium biakan secara optimal. Hal ini
sesuai dengan Suwandi (1989) bahwa kebanyakan metabolit sekunder
disekresikan ke dalam medium biakan. Setelah digojog, kemudian medium
disentrifuge dengan kecepatan 5000 rpm selama 1 jam agar terjadi
pemisahan antara supernatan dengan biomassa sel yang mengendap.
Supernatan yang telah didapat kemudian diinokulasikan ke paper disk
steril sebanyak 40μL. Selanjutnya paper disk yang telah diinokulasikan
supernatan dikeringkan di atas kaca arloji steril untuk menghilangkan
ekses air, kemudian paper disk yang telah diinokulasi supernatan
diletakkan di permukaan lempengan medium NA yang telah diinokulasi
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
54
bakteri uji S.aureus dan E.coli. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada
kontrol positf dan kontrol negatif. Tujuan dari penyamaan volume 40μL
ini adalah untuk mendapat hasil yang dapat dibandingkan dengan kontrol.
Sebagai kontrol positif digunakan salah satu antibiotik yang beredar di
pasaran, yaitu Amoksisilin dalam injeksi (Danoxilin®). Dipilih bentuk
sediaan injeksi untuk mendapatkan Amoksisilin murni tanpa bahan
tambahan yang dapat mempengaruhi proses difusi Amoksisilin. Antibiotik
ini dapat menghambat dan mematikan pertumbuhan
penyebab
penyakit
bisul.
Digunakan
Amoksisilin
bakteri S.aureus
murni
dengan
konsentrasi 20 mg/ml untuk bakteri uji S.aureus dan konsentrasi 25 mg/ml
untuk bakteri uji E.coli. Konsentrasi yang berbeda dipilih karena menurut
Lateef, Oloke, & Gueguim-Kana (2004) MIC (Minimum Inhibitory
Concentrations) dari amoxicilin berada di range antara 10-20 mg/ml untuk
S.aureus dan antara 10-25 mg/ml untuk E.coli. Kontrol negatif
menggunakan medium NB tanpa diinokulasi isolat bakteri endofit, yang
diberi perlakuan sama dengan NB yang diinokulasikan dengan bakteri
endofit kode B dan kode D. Paper disk diletakkan di atas lempengan
medium NA yang telah diinokulasi dengan S.aureus dan
E.coli.
Kemudian di inkubasi selama 24 atau sampai terbentuk zona hambat
disekitar paper disc dengan suhu 37oC.
8. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji S.aureus
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
55
Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan
kode D yang diperoleh dari tahap 6, diuji potensi antibakterinya dengan
bakteri uji S.aureus. Setelah inkubasi 24 jam, terlihat adanya zona jernih di
sekitar paper disc, hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri S.aureus
dihambat oleh senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B.
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat dengan waktu inkubasi
24 jam, rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan sebesar 9,6 mm dan
rata-rata zona hambat pada amoksisilin (kontrol positif) adalah 25 mm,
sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri endofit)
tidak memberikan zona hambat (Gambar 2, Tabel I).
Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri
Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit
P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B
K+ : Amoksisilin konsentrasi 20 mg/ml
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Tabel I.
56
Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
Diameter Zona Hambat (mm)
Senyawa
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
antibakteri yang
Amoksisilin
Nutrient broth
dihasilkan Bakteri
(Konsentrasi 20
(Tanpa Inokulasi
Endofit kode B
mg/ml)
Bakteri Endofit)
1
9
24
0
2
10
26
0
3
10
25
0
Rata-rata ± SD
9,6 ± 0,47
25 ± 0,82
0±0
Ulangan
Rata-rata diameter zona hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan
Bakteri Endofit kode D terhadap S.aureus dengan waktu inkubasi 24 jam
sebesar 10,3 mm dan rata-rata diameter zona hambat kontrol positif
(Amoksisilin) sebesar 24,7 mm, sedangkan pada kontrol negatif (medium NB
tanpa inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat. Hal ini
menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat
tumbuh dengan optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke
dalam medium dengan jumlah yang cukup (Gambar 3,Tabel II).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
57
Gambar 3. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri
Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit
P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D
K+ : Amoksisilin konsentrasi 20 mg/ml
Tabel II. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
Diameter Zona Hambat (mm)
Senyawa antibakteri
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
yang dihasilkan
Amoksisilin
Nutrient broth
Bakteri Endofit kode
(Konsentrasi 20
(Tanpa Inokulasi
D
mg/ml)
Bakteri Endofit)
1
10
25
0
2
11
25
0
3
10
24
0
Rata-rata ± SD
10,3 ± 0,48
24,7 ± 0,47
0±0
Ulangan
Dari hasil pengujian potensi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri
endofit kode B dan endofit kode D terhadap S.aureus dengan waktu inkubasi
24 jam, dapat diketahui bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri
endofit kode D memberikan zona hambat yang lebih besar dari senyawa
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
58
antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit B. Hal ini menunjukkan bahwa
isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat tumbuh lebih optimal
dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium dengan
jumlah cukup. Senyawa yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D
yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji S.aureus bersifat sebagai
antibakteri. Mekanisme kerja antibakteri dari senyawa yang dihasilkan endofit
kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli
belum diketahui dengan baik, dan diduga terlibat dalam perusakan membran
sel oleh senyawa lipofilik. Untuk mengetahui mekanisme penghambatan dari
senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D
terhadap S.aureus, perlu dilakukan karakterisasi senyawa antibakteri tersebut,
sehingga dapat diprediksikan mekanisme penghambatan dari senyawa
antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D terhadap
S.aureus.
Dari hasil pengamatan, dipilih bakteri endofit kode D yang merupakan
bakteri penghasil senyawa antibakteri yang lebih optimal daripada bakteri
endofit kode B. Bakteri endofit kode D lebih potensial dalam menghambat
pertumbuhan bakteri uji S.aureus daripada bakteri endofit kode B, ditunjukkan
dengan diameter zona hambat yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode D
lebih besar daripada bakteri endofit kode B. Hal ini berarti senyawa
antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D lebih spesifik untuk bakteri
uji E.coli daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
59
B. Bakteri endofit kode D digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu
identifikasi dan determinasi bakteri endofit tersebut.
9. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli
Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan
kode D yang diperoleh dari tahap 6, diuji potensi antibakterinya dengan
bakteri uji E.coli. Setelah inkubasi 24 jam, terlihat adanya zona jernih di
sekitar paper disc, hal ini menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri E.coli
dihambat oleh senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B.
Berdasarkan hasil pengukuran diameter zona hambat dengan waktu inkubasi
24 jam, rata-rata diameter zona hambat yang dihasilkan sebesar 9,7 mm dan
rata-rata diameter zona hambat pada amoksisilin (kontrol positif) adalah 39,7
mm sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa inokulasi bakteri
endofit) tidak memberikan zona hambat (Gambar 4,Tabel III).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
60
Gambar 4. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri
Endofit B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit
P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode B
K+ : Amoksisilin konsentrasi 25 mg/ml
Tabel III. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
Diameter Zona Hambat (mm)
Senyawa antibakteri
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
yang dihasilkan
Amoksisilin
Nutrient broth
Bakteri Endofit kode
(Konsentrasi 25
(Tanpa Inokulasi
B
mg/ml)
Bakteri Endofit)
1
10
40
0
2
10
39
0
3
9
40
0
Rata-rata ± SD
9,7 ± 0,48
39,7 ± 0,32
0±0
Ulangan
Rata-rata diameter zona hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan
Bakteri Endofit kode D terhadap E.coli dengan waktu inkubasi 24 jam sebesar
8,7 mm dan rata-rata diameter zona hambat kontrol positif (Amoksisilin)
sebesar 24,7 mm, sedangkan pada kontrol negatif (medium NB tanpa
inokulasi bakteri endofit) tidak memberikan zona hambat. Hal ini
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
61
menunjukkan bahwa isolat bakteri endofit kode D pada medium NB dapat
tumbuh dengan optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke
dalam medium dengan jumlah yang cukup (Gambar 5,Tabel IV).
Gambar 5. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri
Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
K- : Medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit
P : Senyawa antibakteri yang dihasilkan Bakteri Endofit kode D
K+ : Amoksisilin konsentrasi 25 mg/ml
Tabel IV. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa
Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap
E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
Diameter Zona Hambat (mm)
Senyawa antibakteri
Kontrol Positif
Kontrol Negatif
yang dihasilkan
Amoksisilin
Nutrient broth
Bakteri Endofit kode
(Konsentrasi 25
(Tanpa Inokulasi
D
mg/ml)
Bakteri Endofit)
1
9
40
0
2
8
38
0
3
9
39
0
Rata-rata ± SD
8,7 ± 0,58
24,7 ± 1
0±0
Ulangan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
62
Dari hasil pengujian potensi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri
endofit kode B dan endofit kode D terhadap E.coli dengan waktu inkubasi 24
jam, dapat diketahui bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri
endofit kode B memberikan zona hambat yang lebih besar dari senyawa
antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D. Hal ini menunjukkan
bahwa isolat bakteri endofit kode B pada medium NB dapat tumbuh lebih
optimal dan dapat mensekresikan senyawa antibakteri ke dalam medium
dengan jumlah cukup. Senyawa yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan
kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji E.coli bersifat
sebagai antibakteri. Mekanisme kerja antibakteri dari senyawa yang dihasilkan
endofit kode B dan kode D yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji
E.coli belum diketahui dengan baik, dan diduga terlibat dalam perusakan
membran sel oleh senyawa lipofilik. Untuk mengetahui mekanisme
penghambatan dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode
B dan kode D terhadap E.coli, perlu dilakukan karakterisasi senyawa
antibakteri tersebut, sehingga dapat diprediksikan mekanisme penghambatan
dari senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B dan kode D
terhadap E.coli.
Dari hasil pengamatan, dipilih bakteri endofit kode B yang merupakan
bakteri penghasil senyawa antibakteri yang lebih optimal daripada bakteri
endofit kode D. Bakteri endofit kode B lebih potensial dalam menghambat
pertumbuhan bakteri uji E.coli daripada bakteri endofit kode D, ditunjukkan
dengan diameter zona hambat yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
63
lebih besar daripada bakteri endofit kode D. Hal ini berarti senyawa
antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode B lebih spesifik untuk bakteri
uji E.coli daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode
D. Bakteri endofit kode B digunakan untuk langkah kerja selanjutnya yaitu
identifikasi dan determinasi bakteri endofit tersebut.
Dari hasil pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri yang
dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D terhadap S.aureus dan
E.coli secara difusi paper disc, didapatkan hasil bahwa senyawa antibakteri
yang dihasilkan isolat bakteri endofit kode B dan kode D dapat menghambat
pertumbuhan S.aureus dan E.coli. Senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat
bakteri endofit kode B dan kode D dapat menjadi model atau prekursor dalam
penemuan senyawa antibiotik baru yang potensial dalam menghambat
pertumbuhan dari bakteri patogen.
Eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk
mendapatkan senyawa antibiotik baru. Dengan menyelidiki hubungan struktur
dan aktifitas dari senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat bakteri endofit
dengan potensinya sebagai antibiotik, diharapkan akan didapatkan senyawa
antibiotik baru dengan efek farmakologis yang diiginkan (Samuelsson, 1999).
10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode D
Dari skrining potensi antibakteri, didapatkan hasil senyawa antibakteri
yang dihasilkan bakteri endofit kode B lebih berpotensi menghambat E. coli
daripada senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D.
Sedangkan senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit kode D lebih
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
64
berpotensi menghambat S.aureus daripada senyawa antibakteri yang
dihasilkan bakteri endofit kode B. Selanjutnya dilakukan identifikasi kedua
isolat bakteri endofit tersebut. Identifikasi bakteri dilakukan dengan
mengetahui sifat morfologi sel, sifat morfologi koloni dan sifat biokimia.
a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D
1. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan diferensial yang sangat
berguna
dan
paling
banyak
digunakan
dalam
laboratorium
mikrobiologi. Pewarnaan ini merupakan tahap penting dalam pencirian
dan identifikasi bakteri (Lay, 1994)
Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Grampositif dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena
tetap mengikat kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun
diberi larutan pemucat (alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna
merah karena kompleks kristal violet-yodium larut sewaktu pemberian
larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh cat lawan yang berwarna
merah (safranin). Hal ini disebabkan karena dinding sel bakteri Gramnegatif mempunyai kandungan lipida yang lebih tinggi dibandingkan
dinding sel bakteri Gram-positif. Lipida ini akan larut dalam larutan
pemucat, sehingga pori-pori dinding sel membesar dan meningkatkan
daya larut kompleks kristal violet-yodium bakteri Gram-negatif.
Fungsi cat lawan (safranin) hanyalah sebagai pembeda (kontras)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
65
terhadap cat warna kristal violet. Dari hasil yang didapatkan, isolat
bakteri endofit kode B dan isolat bakteri endofit kode D sama-sama
merupakan bakteri Gram-positif (warna ungu).
Sebagian besar dinding sel bakteri endofit kode B dan bakteri
endofit kode D terdiri dari peptidoglikan (ciri bakteri Gram-positif).
Pada bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D akan terbentuk
persenyawaan kompleks kristal violet-yodium ribonukleat, hal ini
menyebabkan bakteri endofit tetap berwarna ungu karena kompleks
persenyawaan kompleks kristal violet-yodium ribonukleat pada bakteri
endofit tidak larut dalam larutan pemucat (alkohol 95%). Penambahan
cat lawan (safranin) tidak menyebabkan perubahan warna pada bakteri
endofit, karena persenyawaan kompleks kristal violet-yodium tetap
terikat pada dinding sel bakteri endofit, sehingga bakteri endofit kode
B dan isolat bakteri endofit kode D tetap berwarna ungu.
Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B
Keterangan Gambar:
Sel bakteri ditunjukkan dengan warna ungu (Gram positif),
berbentuk.batang (basil), garis lurus menunjukkan panjang 32,2 μm.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
66
Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D
Keterangan Gambar:
Sel bakteri ditunjukkan dengan warna ungu (Gram positif), berbentuk.
batang (basil), garis lurus menunjukkan panjang 30,2 μm.
2. Pengecatan Spora
Menurut Lay (1994) spora pada bakteri merupakan struktur yang
tahan panas dan tahan bahan kimia. Spora dibentuk oleh bakteri
tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bagi
bakteri. Spora terbentuk dalam sel sehingga seringkali disebut sebagai
endospora, dalam sel bakteri hanya terdapat 1 spora. Spora ini tidak
berfungsi untuk reproduksi. Semua endospora bakteri mengandung
sejumlah besar asam dipikolinat, substansi ini tidak terdeteksi pada sel
vegetatif. Sejumlah besar kalsium juga terdapat dalam endospora, dan
diduga bahwa lapisan korteks spora ( lapisan yang menutupi spora )
terbuat dari kompleks Ca2+-asam dipikolinat-peptidoglikan (Pelczar &
Chan, 1986).
Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan
kimia, sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai
dengan dipanaskan. Pemanasan dengan api bunsen menyebabkan
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
67
lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna Malachite green
dapat masuk ke dalam spora. Setelah dingin warna hijau ini akan
terperangkap di dalam spora. Pencucian preparat dengan air akan
mencuci zat warna Malachite green dari sel vegetatif, namun tidak
dapat mencuci zat warna Malachite green dalam spora. Pada
penambahan zat warna safranin, preparat tidak perlu dipanaskan. Zat
warna safranin termasuk zat warna basa, sehingga akan mengikat
muatan negatif yang terdapat pada permukaan sel. Safranin tidak akan
masuk ke dalam spora, dan
sel vegetatif akan terlihat merah,
sedangkan spora berwarna hijau. Dari hasil yang diperoleh bakteri
endofit kode B dan D membentuk spora, ditunjukkan dengan anak
panah berwarna merah, dan sel vegetatif bakteri endofit kode B dan D
ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru.
Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B
Keterangan Gambar:
Spora ditunjukkan dengan anak panah berwarna merah, sel vegetatif
ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru, garis lurus
menunjukkan panjang 27,8 μm
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
68
Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D
Keterangan Gambar:
Spora ditunjukkan dengan anak panah berwarna merah, sel vegetatif
ditunjukkan dengan anak panah berwarna biru, garis lurus
menunjukkan panjang 28,8 μm.
3. Pengecatan Acid Fast
Pewarnaan tahan asam digunakan untuk memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocardia dari bakteri lainnya. Kelompok bakteri
ini disebut tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna
pertama yaitu carbolfuchsin sewaktu dicuci dengan larutan pemucat
yang mengandung asam dan alkohol. Bakteri tahan asam memiliki
keistimewaan, karena dinding selnya mengandung lipida yang terlihat
sebagai lapisan lilin. Kandungan lipida ini sangat tinggi, pada beberapa
spesies, lipida ini dapat mencapai sampai 60% dari berat dinding sel.
Kandungan lipida yang tinggi ini menyebabkan sel bakteri sulit
diwarnai, karena zat warna tidak dapat menembus lapisan lilin ini.
Sifat tahan asam berkaitan dengan kandungan lipida dinding sel,
oleh karena itu digunakan pemanasan sehingga zat warna dapat masuk
ke dalam sel bakteri yang diliputi oleh lipida. Jika bakteri tahan asam
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
69
diwarnai dengan zat warna pertama (carbolfuchsin), maka zat warna
ini tidak mudah dilunturkan oleh larutan pemucat. Metylen biru
sebagai zat warna kedua tidak akan menyebabkan perubahan warna
merah (dari carbolfuchsin) pada bakteri tahan asam. Sebaliknya pada
bakteri yang tidak tahan asam, larutan pemucat akan melarutkan cat
warna pertama sehingga bekteri tidak berwarna. Setelah penambahan
cat warna kedua yaitu metylen biru, bakteri yang tidak tahan asam
akan berwarna biru (Lay, 1994). Dari hasil yang diperoleh bakteri
endofit kode B dan kode D merupakan bakteri yang tidak tahan asam
karena sel berwarna biru.
Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B
Keterangan Gambar:
Bakteri endofit kode B merupakan bakteri yang tidak tahan asam,
ditunjukkan dengan sel berwarna biru, Perbesaran 1000x.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
70
Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D
Keterangan Gambar:
Bakteri endofit kode D merupakan bakteri yang tidak tahan asam,
ditunjukkan dengan sel berwarna biru, Perbesaran 1000x.
4. Motilitas
Pergerakan bakteri (motilitas) diamati dengan membuat agar tegak
yaitu Nutrient Broth ditambah dengan 0,2% - 0,4% agar. Tujuan dari
penambahan agar adalah untuk diperoleh medium semi padat sehingga
pertumbuhan bakteri di sekitar tusukan akan terlihat. Bakteri endofit
kode B dan bakteri endofit kode D yang berumur 48 jam diinokulasi
dengan cara tusukan dalam agar tegak tersebut. Dari hasil pengamatan
untuk bakteri endofit kode B dan kode D, di sekitar arah tusukan ada
pertumbuhan seperti serabut- serabut tipis ke arah luar tusukan
sehingga bakteri endofit kode B dan kode D dapat dikatakan
mengalami pergerakan (Lampiran 5)
Pada pengamatan morfologi sel isolat bakteri endofit kode B, dapat
diketahui bahwa isolat bakteri endofit kode B memiliki ciri sel
berbentuk. batang, bersifat gram positif, membentuk spora, tidak tahan
asam dan bergerak (motil).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
71
Pada pengamatan morfologi sel isolat bakteri endofit kode D, dapat
diketahui bahwa isolat bakteri endofit kode D memiliki ciri sel
berbentuk. batang, bersifat gram positif, membentuk spora, tidak tahan
asam dan bergerak (motil).
b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D.
Pada tahap pengamatan morfologi koloni digunakan beberapa medium
yaitu: medium NA miring, Medium NA tegak dan medium Nutrient Broth.
1. Medium Nutrient Broth
Medium Nutrient Broth ditinjau dari konsistensinya berbentuk cair,
sehingga dapat digunakan untuk mengetahui kebutuhan bakteri endofit
terhadap O2. Setelah isolat bakteri bakteri endofit kode B dan bakteri
endofit kode D diinkubasi 24 jam pada medium Nutrient Broth,
tampak pertumbuhan bakteri endofit sebagian besar di permukaan
medium, serta ada pula pertumbuhan di dasar tabung membentuk
endapan berwarna putih. Bakteri endofit kode B dan bakteri endofit
kode D pada medium NB mempunyai ciri berbau tidak enak, tingkat
kekeruhan sedang bila dibandingkan dengan kontrol Nutrient Broth
tanpa inokulasi bakteri endofit yang berwarna kuning jernih. Hal ini
menunjukkan bahwa bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D
bersifat fakultatif anaerob, karena bakteri endofit kode B dan bakteri
endofit kode D dapat tumbuh di dasar dan juga di permukaan medium
(Lampiran 6)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
72
2. Medium Nutrient Agar Tegak
Tabung yang berisi Nutrient Agar dibiarkan tegak hingga
memadat, agar tegak ini digunakan untuk pengamatan morfologi
koloni bakteri endofit secara tusukan. Bakteri endofit kode B dan
bakteri endofit kode D dalam medium NA tegak pertumbuhannya
lebih baik pada bagian permukaan medium, berwarna putih susu,
pertumbuhan mengikuti arah tusukan jarum, bentuk pertumbuhan pada
bekas tusukan tampak tebal dan seperti rambut (villous) (Lampiran 7)
3. Medium Nutrient Agar Miring
Nutrient Agar miring dibuat dengan memiringkan tabung yang
berisi NA pada kemiringan 30-450, dan dibiarkan memadat. NA miring
memiliki permukaan yang luas sehingga dapat digunakan untuk
pengamatan morfologi koloni bakteri endofit. Bakteri endofit kode B
dan bakteri endofit kode D dalam medium NA miring terlihat bentuk
pertumbuhan koloni sepanjang bekas inokulasi bergerigi atau
berbintik-bintik
(echinulate),
berwarna
putih
susu,
tingkat
pertumbuhan sedang, elevasi tipis merata (effuse), mengkilat, topografi
permukaan licin (smooth), konsistensi seperti lendir (slimmy), ciri
optik tidak tembus cahaya (opaque), berbau tidak enak dan warna
medium tidak mengalami perubahan (Lampiran 8)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
73
c. Uji Biokimia
Untuk mengidentifikasi bakteri tidak hanya berdasarkan sifat-sifat
morfologi sel dan koloni saja, tetapi juga perlu diteliti sifat biokimianya.
Uji Biokimia didasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang
disebabkan oleh daya kerja enzim (Lay, 1994). Uji biokimia yang
dilakukan meliputi uji katalase, uji oksidase, uji oksidasi-fermentasi (O-F),
penggunaan sitrat, uji dekarboksilase lisin, hidrolisis gelatin, pembentukan
asam sulfida ( H2S ), pembentukan indol, uji Methyl Red ( MR ), uji
urease. Pengamatan uji biokimia dilakukan dengan membandingkan
perlakuan dengan kontrol (medium tanpa inokulasi bakteri), penambahan
reagen (bila diperlukan) dilakukan pada kedua medium tersebut.
1. Uji Asam Sulfida (H2S)
Uji H2S bertujuan untuk mengetahui terbentuknya H2S yang
ditunjukkan dengan adanya warna hitam sepanjang garis inokulasi.
Pembentukan asam sulfida (H2S) oleh mikroorganisme menunjukkan
adanya penguraian asam amino yang mengandung sulfur, asam amino
ini dihasilkan sewaktu protein dihidrolisiskan untuk memenuhi
kebutuhan
zat
hara
mikroorganisme.
Mikroorganisme
yang
menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dengan medium yang
kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk
H2S. Fe++ yang terdapat dalam medium biakan akan bereaksi dengan
H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak
larut dalam air.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
74
Pada uji H2S, medium yang digunakan adalah TSIA (Triple Sugar
Iron Agar). Medium TSIA mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa,
laktosa,
sukrosa,
indikator
merah
fenol
dan
FeSO4
untuk
memperlihatkan pembentukan H2S yang ditunjukkan dengan adanya
endapan hitam. Pada medium TSIA ini H2S akan bereaksi dengan Fe
menjadi FeS yang berwarna hitam.
Uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium yang
diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi
bakteri endofit). Cara inokulasi, pada medium TSIA bagian atas yang
disebut slant secara goresan, dan pada bagian bawah yang disebut butt
secara tusukan (Lay, 1994). Kemudian diinkubasikan selama 24 jam
dan dilakukan pengamatan.
Dari hasil pengamatan bakteri endofit kode B, medium yang telah
diinokulasi isolat bakteri endofit berwarna merah muda pada bagian
slant, dan pada bagian butt berwarna kuning, sedangkan pada bagian
bawah tempat inokulasi secara tusukan terbentuk warna hitam. Ini
berarti hanya glukosa saja yang difermentasikan. Selain itu adanya
warna hitam menunjukkan terbentuknya H2S sehingga terjadi
penguraian asam amino yang mengandung sulfur.
Pada pengamatan bakteri endofit kode D seluruh medium yang
telah diinokulasi isolat bakteri endofit berwarna kuning dan pada
bagian bawah tempat inokulasi secara tusukan terbentuk warna hitam.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
75
Ini berarti laktosa, glukosa dan sukrosa difermentasikan dan juga
terbentuk H2S (Lampiran 9).
2. Uji Dekarboksilasi lisin
Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari
suatu molekul organik. Proses dekarboksilasi asam amino seringkali
juga digunakan untuk menetralisasi lingkungan asam. Pada waktu
proses fermentasi, mikroorganisme seringkali menghasilkan hasil
sampingan yang bersifat asam yang dapat menghambat pertumbuhan
mikroorganisme. Enzim dekarboksilase mengenyahkan gugus asam
dari asam amino dan menghasilkan amina
yang menyebabkan
medium pertumbuhan bersifat basa (Lay, 1994)
Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan
isolat bakteri endofit dalam medium LIA (Lisin Iron Agar) yang
mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa),
dan indikator pH brom cresol purple (BCP). Asam yang dihasilkan
dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH medium LIA
dan menyebabkan perubahan warna dari indikator pH dari ungu
menjadi kuning. Dalam suasana asam ini proses dekarboksilasi lisin
dapat
berlangsung
sehingga
terjadi
pembentukan
amin
yang
menetralisasikan suasana asam medium LIA tersebut. Proses
netralisasi ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning menjadi
ungu
seperti
sediakala,
perubahan
warna
menjadi
menunjukkan bahwa lisin mengalami dekarboksilasi.
ungu
ini
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Pengamatan
uji
dekarboksilasi
lisin
dilakukan
76
dengan
membandingkan medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri
endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang
berwarna ungu. Cara inokulasi dengan teknik tusukan. Setelah
diinokulasi medium tersebut diinkubasikan selama 24 jam dan
dilakukan pengamatan. Dari hasil pengamatan diketahui terjadi
perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada waktu inkubasi 24
jam dan 48 jam. Hal ini berarti endofit kode B dan bakteri endofit kode
D tidak mampu mendekarboksilasi asam amino lisin (Lampiran 10).
3. Uji indol
Indol merupakan zat yang berbau busuk yang dihasilkan oleh
bakteri yang ditumbuhkan dalam medium yang mengandung triptofan.
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim
terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat
digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Dalam
medium biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan
bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH4+ ) dapat
digunakan untuk memenuhi zat hara mikroorganisme (Lay, 1994).
Adanya indol dapat ditentukan dengan cara menambahkan reagen
Kovac yang mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida pada
medium tripton water yang mengandung triptofan. Menurut Koneman
et al (1997), uji indol berdasarkan pada pembentukan kompleks merah
saat indol bereaksi dengan aldehid dari reagen Kovac.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
77
Cara inokulasi bakteri pada medium tripton water dengan tusukan,
kemudian diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan. Saat
pengamatan diberikan penambahan diberikan penambahan 5 tetes
reagen Kovac pada medium tersebut. Setelah 30 menit, pada medium
uji tripton water terbentuk cincin merah di permukaan medium. Hal ini
terjadi karena pembentukan kompleks reagen kovac dan indol yang
disebut rosindol.
Pada pengamatan bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode
D setelah didiamkan selama 30 menit tidak terbentuk cincin berwarna
merah sehingga dapat diketahui bahwa bakteri endofit B dan bakteri
endofit D tidak dapat membentuk indol (Lampiran 11).
4. Uji Methylen Red (MR)
Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi
asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan
menghasilkan beberapa produk yang bersifat asam sehingga akan
menurunkan pH medium pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih
rendah. Penambahan indicator pH methyl red dapat menunjukkan
adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl red berwarna merah pada
lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan
dengan pH 6,2 (Lay, 1994). Bila terjadi fermentasi asam campuran,
medium akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam
campuran maka medium berubah menjadi kuning setelah penambahan
reagen Metil Red. Dari hasil pengamatan, bakteri endofit B dan bakteri
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
78
endofit D tidak mampu memfermentasikan asam campuran karena
medium berubah menjadi kuning (Lampiran 12).
5. Uji Sitrat
Menurut Lay (1994) uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia
menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon dan energi.
Digunakan medium Simmon-Sitrat Agar berupa medium padat.
Simmon-Sitrat Agar merupakan medium sintetik dengan Na sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan
brom thymol blue sebagai indikator pH. Bila mikrobia mempu
menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan
sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium
dari hijau menjadi biru.
Dari hasil pengamatan diketahui bahwa bakteri endofit kode B dan
bakteri endofit kode D tidak mengalami perubahan warna sehingga
bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mampu
menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon (Lampiran
13).
6. Uji katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian
hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida
bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim
dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob,
sehingga mikrobia yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
79
menguraikan bahan toksik tersebut (Lay, 1994). Uji ini dilakukan
dengan menambahkan 1 tetes pereaksi 30% H2O2 pada koloni yang
diletakkan ditengah obyek gelas. Pada bakteri yang bersifat katalase
positif terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni.
Dari hasil pengamatan, disekitar koloni bakteri endofit kode B dan
bakteri endofit kode D tidak tampak adanya gelembung udara. Adanya
gelembung udara disebabkan karena bakteri mampu menghasilkan
enzim katalase yang mengkatalisis penguraian hidrogen peroksida
menjadi air dan O2. Dapat diketahui bahwa bakteri endofit B dan
bakteri endofit D sifat katalase negatif (Lampiran 14).
7. Uji Oksidase
Menurut Lay (1994) uji oksidase dilakukan untuk menentukan
adanya oksidase sitokrom pada mikrobia. Bila koloni bakteri yang
bersifat
oksidase-positif
diberi
reagen
oksidase
tetramethyl-
paraphenyldiamine maka warna koloni akan berubah menjadi ungu
kehitaman dalam 30 menit. Perubahan warna ini disebabkan oksidase
sitokrom mengoksidasi larutan reagens.
Uji oksidase dilakukan dengan menambahkan 2-3 tetes reagen
tetramethyl-paraphenyldiamine pada koloni yang sudah diteteskan
pada permukaan kertas saring. Berdasarkan hasil pengamatan tidak
terjadi perubahan warna, maka bakteri endofit kode B dan bakteri
endofit kode D bereaksi negatif terhadap uji oksidase (Lampiran 15).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
80
8. Uji Gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh sewakti merebus tulang,
tulang rawan, atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila
didinginkan membentuk gel. Beberapa mikrobia tertentu mampu
menguraikan molekul sehingga asam amino yang dihasilkan dapat
digunakan sebagai zat hara (Lay, 1994). Uji pencairan gelatin
bertujuan untuk mengetahui terjadi atau tidaknya proses hidrolisis
gelatin yang dikatalisasi oleh eksoenzim yang disebut gelatinase.
Uji pencairan gelatin dilakukan dengan membandingkan medium
gelatin yang diinokulasi bakteri terhadap kontrol (tanpa inokulasi
bakteri endofit). Inokulasi bakteri dilakukan dengan teknik tusukan.
Setelah medium diinokulasi bakteri endofit, kemudian diinkubasi
selama 72 jam. Setelah diinkubasi, kedua medium tersebut dimasukkan
ke dalam lemari es dengan suhu 20oC, dalam keadaan tegak selama 30
menit.
Dari hasil pengamatan diketahui bahwa kontrol negatif membeku
dan medium gelatin yang diinokulasi bakteri endofit kode B dan
bakteri endofit kode D juga membeku. Hal tersebut menandakan
bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mampu
mencerna gelatin, sehingga medium gelatin tetap membeku saat
dikeluarkan dari lemari es. Maka dapat dikatakan bahwa bakteri
endofit kode B dan bakteri endofit kode D tidak mengalami pencairan
gelatin (Lampiran 16).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
81
9. Uji Oksidasi-Fermentasi (OF)
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri mampu
menggunakan glukosa sebagai sumber energi. Oksidase akan terjadi
pada organisme aerob yaitu pada tabung yang tidak ditutup dengan
paraffin. Hasil positif jika terbentuk warna kuning. Sedangkan
fermentasi terjadi pada bakteri anaerob yaitu tabung yang ditutup
dengan paraffin. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna
kuning. Bakteri fakultatif dapat dilihat dari terbentuknya warna kuning
pada kedua tabung. Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan
dengan cara tusukan. bakteri ke dalam 2 tabung yang berisi medium
O-F. Setelah dilakukan penginokulasian, salah satu tabung ditutup
dengan paraffin.
Pengamatan untuk uji OF dengan membandingkan medium OF
dengan atau tanpa paraffin yang diinokulasi bakteri endofit terhadap
medium kontrol yang berwarna hijau. Dari hasi pengamatan diapatkan
bahwa endofit B dan bakteri endofit D pada medium yang ditutup
paraffin dan yang tidak ditutup parafin dihasilkan perubahan medium
dari hijau menjadi kuning. Maka endofit B dan bakteri endofit D dapat
digolongkan dalam bakteri anaerob fakultatif (Lampiran 17 dan 18).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
82
Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit Kode B dan Endofit Kode D
Hasil Uji Biokimia
Uji
Bakteri Endofit Kode B Bakteri Endofit Kode D
H2S
Positif ( + )
Positif ( + )
Dekarboksilasi Lisin
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Indol
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Methyl Red
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Sitrat
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Katalase
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Oksidase
Negatif ( - )
Negatif ( - )
Pencairan Gelatin
Negatif ( - )
Negatif ( - )
OF-Parafin
Positif ( + )
Positif ( + )
OF tanpa Parafin
Positif ( + )
Positif ( + )
Berdasarkan hasil identifikasi morfologi sel, morfologi koloni, dan uji
biokimia isolat bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode D terdapat
kesamaan sifat morfologi dan biokimia, sehingga dapat disimpulkan bakteri
endofit kode B dan bakteri endofit kode D berasal dari genus yang sama. Hasil
menunjukkan bahwa sel berbentuk batang, rangkaian sel tunggal, bersifat gram
positif, bergerak (motil), fakultatif anaerob, warna koloni putih, tidak tembus
cahaya (opaque), positif terhadap uji H2S dan uji OF parafin maupun tanpa
parafin.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
83
Hasil pengamatan identifikasi bakteri endofit kode B dan bakteri endofit kode
D yang dicocokkan dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al, 2000)
menunjukkan ciri genus Amphibacillus. Genus Amphibacillus adalah kelompok
bakteri batang gram positif. Dalam Holt et al (2000) dijelaskan bahwa bakteri
genus Amphibacillus mempunyai ciri-ciri sel berbentuk batang, rangkaian sel
tunggal atau berpasangan dan kadang membentuk rantai pendek, gram positif,
terdapat endospora, fakultatif anaerob, katalase negatif, oksidase negatif, dan
motil. Bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus
yang diisolasi dari batang tanaman A.annua L. pada penelitian ini termasuk
dalam genus Amphibacillus. Pada penelitian isolasi dan identifikasi artemisinin
dari hasil kultivasi mikrobia endofit dari tanaman A.annua L yang dilakukan oleh
Simanjuntak dkk (2004), diketahui bahwa bakteri endofit dalam penelitian
tersebut adalah Bacillus polymixa yang termasuk dalam genus Bacillus. Genus
Amphibacillus dan genus Bacillus mempunyai kesamaan ciri, yaitu ciri sel
berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, dan
motil. Perbedaan dari kedua genus tersebut adalah genus Amphibacillus bersifat
katalase negatif, sedangkan genus Bacillus bersifat katalase positif (Holt et al,
2000).
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
84
Tabel VI. Hasil Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Kode B, Bakteri Endofit
Kode D, dan Bakteri Genus Amphibacillus
Ciri - Ciri
Identitas Isolat Bakteri
Identitas Bakteri Dari
Endofit Kode B dan
Genus Amphibacillus
Bakteri Endofit Kode D
(Holt et al, 2000)
Bentuk sel
Berbentuk batang
Berbentuk batang
Sifat gram
Gram positif
Gram positif
Endospora
Terdapat endospora
Terdapat endospora
Kebutuhan akan O2
Fakultatif anaerob
Fakultatif anaerob
Katalase
Katalase negatif
Katalase negatif
Oksidase
Oksidase negatif
Oksidase negatif
Pergerakan
Motil
Motil
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1.
Diperoleh isolat bakteri endofit yang dapat diisolasi dari batang A.annua L.
2.
Isolat bakteri endofit yang diperoleh dari batang A.annua L. mempunyai
potensi antibakteri terhadap E. coli dan S.aureus.
3.
Isolat bakteri endofit dari batang A.annua L. penghasil senyawa antibakteri
terhadap E.coli dan S.aureus diduga termasuk dalam genus Amphibacillus.
B. Saran
1.
Perlu dilakukan karakterisasi senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh
bakteri endofit dari tanaman A.annua L. dalam rangka penemuan antibiotik
baru di masa depan.
2.
Perlu dilakukan optimalisasi faktor- faktor pertumbuhan isolat bakteri
endofit dari tanaman A.annua L. untuk mendapatkan produksi senyawa
antibakteri yang optimal.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
86
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1986, Dasar- Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, Jilid I, 15-24,110-111,
Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
Anonim, 1992, Dasar-Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, Jilid II, 110-114,
Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.
Anonim, 1999, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, Jilid V, 17-18, Badan
Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, Departemen Kesehatan, Jakarta.
Anonim, 2005, Isolation of Endophytic Fungi, Available from
www.google.isolation of endophytic fungi.com Di akses pada 27 Maret
2006.
Anonim, 2006, Staphylococcus aureus, Available from www.wikipedia.com. Di
akses pada 1 Oktober 2007.
Backer, C.A, & Brink, R. C., 1965, Flora of Java, Spermatophytes Only, Vol II,
362, NVP Noordhoff, Groningen, Netherland.
Bonang, G. & Koeswardono, E.S., 1982, Mikrobiologi Kedokteran, Untuk
Laboratorium dan Klinik, 135-137, Penerbit PT Gramedia, Jakarta.
Campbell, N.A., Reece, J.B., Mitchell, L.G., 2002, Biology, Fifth Edition (Biologi,
Edisi Kelima), hal 6, 352-357, Diterjemahkan oleh Lestari, dkk, Jilid 1,
Penerbit Erlangga, Jakarta.
Castillo, U.F., Strobel, G.A., Ford, E.J., Hess, W.M., Poter, H., Jenson, J.B.,
Albert, H., Robinson, R., Condron, M.A., Teplow, D.B., Stevens, D., &
Yaver, D., 2002, Munumbicins, wide spectrum antibiotics produced by
Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans,
Microbiology 148: 2675-2685.
Hendaryono, D.P.S. & Wijayani, A., 1994, Teknik Kultur Jaringan, hal 26-35,
Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T., Williams, S.T., 2000,
Bergey’s Manual® of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, hal 347,
559, Lippincott William & Wilkins, Philadelphia, USA.
Horn, W.S., Simmonds, M.S.J., Schartz, R.E., Blaney, W.M., 1995,
Phomopsichalasin, a novel antimicrobial agent from endophytic Phomopsis
spp., Tetrahedron 14: 3969-3978.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
87
Hugo, W.B & Russel, A.D., 1987, Pharmaceutical Microbiology, 20-21,
Blackwel Scientific Publication, Oxford.
Juteau, F., Masotti, V., Bessiere, JM.., Dherbomez, M., Viano J., 2002,
Antibacterial and antioxidant activities of Artemisia annua essential oil.
Available from www.pubmed.gov Di akses pada 19 Februari 2006.
Jutono, Sudarsono, Hartadi, Suhadi, Susanto, 1980, Pedoman Praktikum
Mikrobiologi Umum (Untuk Perguruan Tinggi), 24-25, 90-115, Departemen
Mikrobiologi, Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., 1986, Review of Medical Microbiology
(Mikrobiologi Untuk Profesi Kedokteran), Edisi 16, 107-108, 288, 239, 384,
Diterjemahkan oleh Bonang, , Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Jawetz, E., Melnick, J.L., Adelberg, E.A., 1996, Mikrobiologi Kedokteran, Edisi
XX, 128, 239, 240, Diterjemahkan oleh Nugroho, E., dan Maulany, R.F.,
Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Katuuk, J.R.P., 1989, Teknik Kultur Jaringan dalam Mikropropagasi Tanaman,
hal 1-4,37,46. Departemen pendidikan dan Kebudayaan, Jakarta.
Lateef, A., Oloke, J.K., & Gueguim-Kana, E. B, 2004, Antimicrobial Resistance
of Bacterial Strains Isolated From Orange Juice Product, Available from
www.pubmed.gov Di akses pada 21 Mei 2006.
Lay, B., 1994 Analisis Mikrobia di Laboratorium, 79-101, 129-132, Manajemen
PT Grafindo Persada, Jakarta.
Mucciarelli, M., Scannerini, S., Bertea, C.M., Maffei, M., 2001, An ascomycetous
endophyte isolated from Mentha piperita L.: biological features and
molecular studies, Available from www.mycologia.org Di akses pada 21 Mei
2006.
Pelczar, M.J & E.C.S Chan, 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, hal 131-154,
Diterjemahkan oleh Ratnasari, dkk, Edisi I, UI Press, Jakarta.
Pelczar, M.J & E.C.S Chan, 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Diterjemahkan
oleh Ratnasari, dkk, Edisi II, 511, UI Press, Jakarta.
Prescott, L.M, Harley, J.P, Klein, D.A, 1999, Microbiology, fourth edition, hal 97100, 255, WCB / McGraw-Hill, USA.
Pudaritadesantamaria, W., 2004, Potensi Bakteri Rizofer dan Endofit pada Akar
Pisang dalam Pengendalian Penyakit Layu Fusarium, Hayati Vol.11 No.2,
67-71.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
88
Radji, M., 2005, Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit Dalam
Pengembangan Obat Herbal, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3, 113126.
Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, a Textbook of Pharmacognosy,
4th Revised Edition, Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm, Sweden.
Santoso, U. & Fatimah N., 2001, Kultur Jaringan Tanaman, UMM Press,
Malang.
Simanjuntak, P., Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih & Said, 2004,
Isolasi dan Identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari
tanaman Artemisia annua,. Majalah Farmasi Indonesia, Vol. 15 No.2, 68-74.
Sjahrurachman, A., 1996, Resistensi Bakteri terhadap Aminoglikosida, Cermin
Dunia Kedokteran No. 108, hal 49.
Stace, C. A., 1989, Plant Taxonomy and Biosystematics, 2nd edition, hal17,
Arnold, London, UK.
Strobel, G.A., & Daisy, B., 2003, Bioprospecting for Microbial Endophytes and
Their Natural Products, Microbiol. And Mol. Biology Rev. 67 (4): 491-502.
Strobel, G.A., Miller, R.V., Miller, C., Condron, M., Teplow, D.B., & Hess,
W.M., 1999, Cryptocandin, a potent antimycotic from endophytic fungus
Cryptosporiopsis quercina. Microbiology 145: 1919-1926.
Stone JK, Bacon CW, White JF Jr., 2000, An overview of endophytic microbes:
endophytism. Microbial endophytes. New York: Marcel Dekker, Inc. 3–29
Suwandi, U., 1989. Mikrobia Penghasil Antibiotika, Cermin Dunia Kesehatan,
Vol. 58, 37.
Tan, R. X., & W. X. Zou, 2001, Endophytes : a rich source of functional
metabolites, The Royal Society of Chemistry, Available from www.natural
product.com, Di akses pada 24 Februari 2006.
Tjahjoleksono, A., 2005, Teknologi DNA Rekombinan, Available from
www.natural product.com, Di akses pada 1 Oktober 2007.
Trihendrokesowo, 1986, Dasar-Dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, 7-42, Fakultas
Kedokteran UGM, Yogyakarta.
Wahyuningsih, P.E.R., 2006, Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Dalam Akar
Talinum triangulare (Jacq) Wild yang Mempunyai Potensi Sebagai
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
89
Antibakteri Terhadap Staphylococcus Aureus, Skripsi, Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Worang, R.L., 2003, Fungi Endofit Sebagai Penghasil Antibiotika, Available from
www.google.fungi.endofit.com. Di akses pada 19 Februari 2006.
Yusnita, 2003, Kultur Jaringan : Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien,
Agromedia Pustaka, Jakarta.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
90
Lampiran 1 : Surat Keterangan Determinasi Tanaman Artemisia annua L.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
91
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
92
Lampiran 2 :
Tanaman Artemisia annua L.
Lampiran 3 :
Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu
Inkubasi 3 hari
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
93
Lampiran 4 :
Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak
Platting dengan Waktu Inkubasi 24 Jam
Lampiran 5 :
Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri
Endofit kode D pada Medium Semi Solid
Keterangan :
A
: Bakteri endofit kode B mengalami pergerakan, di sekitar arah
tusukan ada pertmbuhan seperti serabut-serabut tipis ke arah luar
tusukan
B
: Bakteri bakteri endofit D mengalami pergerakan, di sekitar arah
tusukan ada pertmbuhan seperti serabut-serabut tipis ke arah luar
tusukan
C
: Kontrol medium semi solid tanpa inokulasi bakteri endofit
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Lampiran 6 :
94
Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Broth
Keterangan :
A
: Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode B rata pada seluruh
medium. Pada permukaan dan dasar medium terlihat pertumbuhan
seperti selaput
B
: Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode D rata pada seluruh
medium. Pada permukaan dan dasar medium terlihat pertumbuhan
seperti selaput
C
: Kontrol medium Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri endofit
Lampiran 7 :
Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
95
Keterangan :
A
: Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode B di sepanjang garis
inokulasi, tebal dan seperti rambut (villous)
B
: Terlihat pertumbuhan bakteri endofit kode D di sepanjang garis
inokulasi, tebal dan seperti rambut (villous)
C
: Kontrol medium Nutrient Agar Tegak tanpa inokulasi bakteri
endofit
Lampiran 8 :
Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan
Bakteri Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring
Keterangan :
A
: Medium NA miring yang diinokulasi bakteri endofit kode B, bentuk
pertumbuhan koloni echinulate dan berwarna putih susu.
B
: Medium NA miring yang diinokulasi bakteri endofit kode D, bentuk
pertumbuhan koloni echinulate dan berwarna putih susu.
C
: Kontrol medium NA miring tanpa inokulasi bakteri endofit
Lampiran 9 : Hasil Uji Asam sulfida (H2S)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
96
Keterangan :
A
: Medium TSIA yang diinokulasi bakteri endofit kode B berwarna
merah muda pada bagian slant, dan pada bagian butt berwarna
kuning, pada bagian bawah terbentuk warna hitam. Inkubasi 24 jam
B
: Medium TSIA yang diinokulasi bakteri endofit kode D berwarna
kuning pada bagian slant dan butt, pada bagian bawah terbentuk
warna hitam. Inkubasi 24 jam
C
: Kontrol medium TSIA tanpa inokulasi bakteri endofit
Lampiran 10 :
Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin
Keterangan :
A
: Medium LIA yang diinokulasi bakteri endofit kode B tetap berwarna
kuning setelah inkubasi 24 jam
B
: Medium LIA yang diinokulasi bakteri endofit kode D tetap
berwarna kuning setelah inkubasi 24 jam
C
: Kontrol medium LIA tanpa inokulasi bakteri endofit
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Lampiran 11 :
97
Hasil Uji Indol
Keterangan :
A
: Medium Tripton Water yang diinokulasi bakteri endofit kode B
tidak terbentuk cincin warna merah setelah inkubasi 24 jam
B
: Medium Tripton Water yang diinokulasi bakteri endofit kode D
tidak terbentuk cincin warna merah setelah inkubasi 24 jam
C
: Kontrol medium Tripton Water tanpa inokulasi bakteri endofit
Lampiran 12 :
Hasil Uji Methylen Red (MR)
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Keterangan :
A
: Medium MR yang diinokulasi bakteri endofit kode B,
ditambah reagen metil merah medium menjadi berwarna
(Inkubasi 24 jam)
B
: Medium MR yang diinokulasi bakteri endofit kode D,
ditambah reagen metil merah medium menjadi berwarna
(Inkubasi 24 jam)
C
: Kontrol medium MR tanpa inokulasi bakteri endofit
Lampiran 13 :
98
setelah
kuning
setelah
kuning
Hasil Uji Sitrat
Keterangan :
A
: Medium Simmon’s Citrate yang diinokulasi bakteri endofit kode B,
medium tetap berwarna hijau setelah Inkubasi 24 jam
B
: Medium Simmon’s Citrate yang diinokulasi bakteri endofit kode D,
medium tetap berwarna hijau setelah Inkubasi 24 jam
C
: Kontrol medium Simmon’s Citrate tanpa inokulasi bakteri endofit
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Lampiran 14 :
99
Hasil Uji Katalase
Keterangan :
Tidak terdapat gelembung udara pada koloni bakteri endofit kode B ( A ) dan
bakteri endofit kode D ( B ) setelah ditetesi pereaksi H2O2 30%
Lampiran 15 :
Hasil Uji Oksidase
Keterangan :
Tidak muncul warna ungu setelah koloni bakteri endofit kode B ( A ) dan
bakteri endofit kode D ( B ) ditetesi reagen tetramethyl-paraphenyldiamine.
Warna yang terjadi sama dengan kontrol ( C )
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
Lampiran 16 :
100
Hasil Uji Gelatin
Keterangan :
A
: Tidak terjadi pencairan gelatin pada medium NB + gelatin yang
diinokulasi bakteri endofit kode B
B
: Tidak terjadi pencairan gelatin pada medium NB + gelatin yang
diinokulasi bakteri endofit kode D
C
: Kontrol medium NB + gelatin tanpa inokulasi bakteri endofit.
Lampiran 17 :
Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
101
Keterangan :
A
: Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri
endofit kode B tanpa paraffin dari hijau menjadi kuning.
B
: Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri
endofit kode D tanpa paraffin dari hijau menjadi kuning.
C
: Kontrol medium OF tanpa paraffin dan tanpa inokulasi bakteri
endofit
Lampiran 18 :
Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin
Keterangan :
A
: Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri
endofit kode B dan ditutup paraffin dari hijau menjadi kuning.
B
: Terjadi perubahan warna medium OF yang diinokulasi bakteri
endofit kode D dan ditutup paraffin dari hijau menjadi kuning.
C
: Kontrol medium OF tanpa inokulasi bakteri endofit dan ditutup
paraffin.
PLAGIAT
PLAGIAT MERUPAKAN
MERUPAKAN TINDAKAN
TINDAKAN TIDAK
TIDAK TERPUJI
TERPUJI
102
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama Antonius Alfian Yuan Dias Priharta
dilahirkan di Klaten pada tanggal 26 Juli 1985. Penulis
anak pertama dari 2 bersaudara, dari pasangan Bernardinos
Dias Sidharta dan Caecilia Enita Amarwati. Jenjang
pendidikan penulis : TK Mater Dei Marsudirini Yogyakarta
(1990-1991), SD Marsudirini Yogyakarta (1991-1997),
SLTP Negeri 1 Yogyakarta (1997-2000), SMU Kolese de
Britto Yogyakarta (2000-2003).
Pada tahun 2003, penulis melanjutkan studi jenjang S1 di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis menjadi Asisten Dosen pada
mata kuliah Praktikum Mikrobiologi tahun ajaran 2005/2006 dan 2006/2007, dan
Praktikum Analisis Sediaan Obat Tradisional tahun ajaran 2007/2008. Penulis
aktif berorgansiasi di ISMAFARSI, menjabat sebagai Komisaris ISMAFARSI
Komisariat USD periode 2005/2006. Penulis menjadi delegasi pada RAKERNAS
Universitas Pakuan Bogor 2005, PIMFI Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
2005, PRAMUNAS Universitas Jendral Achmad Yani Bandung 2006, dan pada
event-event regional ISMAFARSI DIY-Jateng. Penulis juga menjadi panitia pada
kegiatan Pelepasan Wisudawan 2004, Sumpahan Apoteker 2005, TITRASI 2005,
REAKSI 2005, KIO 2006, Seminar SCL 2007, dan Diskusi Panel APOTEKER
2007.