bakteri kitinolitik yang diisolasi dari tambak udang

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
BAKTERI KITINOLITIK YANG DIISOLASI DARI TAMBAK UDANG
LAMONGAN JAWA TIMUR
CHITINOLYTIC BACTERIA ISOLATED FROM SHRIMP PONDS
LAMONGAN EAST JAVA
Nuniek Herdyastuti
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya
Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8298761
Email :[email protected]
Abstrak. Eksplorasi kitinolitik dari tambak udang bertujuan untuk mencari keragaman bakteri penghasil
kitinase dengan aktivitas yang tinggi dari lingkunga perairan. Aktivitas kitinase ditentukan dengan
metode Monreal-Reese berdasarkan pelepasan N-Asetil glukosamin. Diperoleh isolat LA-21 adalah
bakteri gram positif berbentuk batang dengan karakteristik koloni berwarna putih, bentuk bulat, elevasi
cembung, margin bergerigi (serrate) dan diameter koloni 1-2 mm. Hasil uji 16S-rRNA menunjukkan
bahwa isolat LA-21 mempunyai hubungan kekerabatan 97 % terhadap Bacillus sp AHBR 2.
Kata kunci: Aktivitaskitinase, bakteri kitinolitik, tambak udang
Abstract. Chitinolytic exploration of shrimp ponds aimed to diversity of bacteria producing chitinase
with high activity of aquatic environments. Chitinase activity was determined by a Monreal-Reese method
based on the release N-Acetyl glucosamine. Isolates LA-21 was a gram positive with characteristic rodshapes, white coloni, rounded shape, serrated margine, convex elevation and diameter coloni 1-2 mm.
Test result 16S-rRNA indicate that the isolates-LA-21 97% gene similarity to Bacillus sp AHBR 2
Key words : Chitinase activity, chitinolytic bacteria, shrimp ponds
PENDAHULUAN
perairan seperti laut, danau, tambak, limbah
udang dan sebagainya [2,3,4
Kitinase (EC 3.2.11.14) adalah enzim
yang
mempunyai
menghidrolisis
kemampuan
senyawa
kitin
Eksplorasi
untuk
habitat
telah
banyak
dilakukan untuk mencari biodiversitas bakteri
membentuk
oligosakarida dan monomernya. Kitinase dapat
kitinolitik
ditemukan dari berbagai macam organisma
keragaman bakteri yang mampu menghasilkan
seperti
aktivitas kitinase terbaik. Salah satu tempat yang
virus,
bakteri,
jamur,
serangga,
metabolismenya
peranan
[1].
penting
Bakteri
tujuan
mendapatkan
berpotensi menghasilkan bakteri kitinolitik yaitu
tumbuhan tingkat tinggi dan hewan yang
mempunyai
dengan
tambak udang. Beberapa wilayah di Jawa Timur
dalam
seperti
kitinolitik
Lamongan
Tuban,
Situbondo
dan
Sidoarjo berada di daerah pesisir pantai sehingga
merupakan penghasil enzim kitinase dapat
sebagian besar mata pencaharian penduduk
diperoleh dari berbagai sumber rti lingkungan
B - 192
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
adalah sebagai petani tambak. Penelitian ini
Prism 9700, perangkat Applied Biosystems
bertujuan untuk mengetahui keanekaragaman
3730XL Genetic Analyzer
bakteri kitinolitik yang berasal dari lingkungan
tambak udang khusunya di daerah Lamongan
Bahan
Jawa Timur.
Bahan-bahan yang di butuhkan
adalah kitin, HCl (37%), aquades, yeast
extract (Difco), NaCl, tripton (Difco), Bacto
agar (Difco), KH2PO4, Na-K- tartrat
tetrahidrat,
asam 3,5dinitrosalisilat
(SIGMA), N-asetil glukosamin (SIGMA).
universal primer
5’GGTTACTTGTTACGACTT-3’ (Uni B1)
dan
5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’
(Bact F1) , dNTP, Taq DNA polymerase,
Etidium Bromida, Red Safe flourecent kit,
loading buffer, agarose.
Udang mempunyai kandungan kitin
yang cukup tinggi. Focher menyatakan bahwa,
kulit udang mengandung protein (25 – 40 %),
kalsium karbonat (45 – 50 %), dan kitin (15 – 20
%), tetapi besarnya kandungan komponen
tersebut tergantung pada jenis udangnya. Kitin
merupakan bentuk linier polisakarida yang
dibentuk dari ikatan -1,4 residu N-asetilglukosamin [5]. Dengan demikian kitin secara
kimiawi
adalah
suatu
polimer
golongan
Prosedur Penelitian
polisakarida yang tersusun atas 2-asetamido-2deoksi-D-glukosa
Seleksi bakteri kitinolitik
membentuk ikatan -1,4.
Bakteri dari diisolasi dari tambak udang
Ikatan pada molekul tersebut membentuk fibra
yang linier. Rantainya dapat membentuk kristal
dengan
karena adanya ikatan hidrogen intramolekul dan
minimal yang mengandung koloidal kitin,
membentuk
panjang
dengan komposisi : 0,4 % koloidal kitin ; 0,7 %
menghasilkan struktur yang rigid dan stabil [6].
K2HPO4 ;, 0,3 % KH2PO4 ; 0,5 % MgSO4.5H2O
Kitin terutama dalam bentuk koloidal kitin
; 0,01 % FeSO 4.7H2O ; 0,001 % MnCl2 dan 0,5
banyak digunakan sebagai sumber karbon dan
% pepton. Campuran diinkubasi pada suhu
induser untuk memproduksi enzim kitinase dari
ruang selama 45 jam dengan pengocokan
berbagai strain [7].
kecepatan 150 rpm. Supernatan yang diperoleh
mikrofibril
yang
cara
menumbuhkan
pada
media
selanjutnya ditentukan aktivitas kitinasenya.
BAHAN DAN METODE
Alat
Persiapan Koloidal kitin
Beberapa alat yang digunakan antara lain :
Kitin dibuat bentuk koloid dengan
peralatan gelas yang umum digunakan, pH
menggunakan cara menurut Hsu and Lockwood
meter, Spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu,
[8]. Sebanyak 40 g kitin dilarutkan dalam 400
1800), sentrifuse dingin (5810 R), PCR ABI
mL HCl pekat, diaduk dengan pengaduk magnet
selama 30 – 50 menit. Larutan kitin kemudian
B - 193
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
diendapkan sebagai suspensi koloid dengan
Penentuan dilakukan berdasarkan tahapan
menambahkan 2 liter air dingin (suhu 5 – 10 C)
: isolasi DNA, amplifikasi dengan gen 16S-
secara pelan-pelan. Suspensi ditampung dengan
rRNA dengan kondisi reaksi PCR : siklus
cara menyaring menggunakan kertas saring, dan
sebanyak 30 siklus, denaturasi : 95 ºC
residu yang diperoleh dicuci dengan aquades 5
selama 1 menit; annealing : 55 ºC selama 1
liter. Pencucian diulang sedikitnya 3 kali atau
menit ; dan elongasi: 72 ºC selama 1 menit.
sampai pH sekitar 3,5. Pada proses ini kira-kira
Hasil PCR yang telah dimurnikan dilakukan
akan diperoleh 85 % kitin.
sequencing dengan kondisi dengan kondisi
initial denaturation 96 ºC selama 1 menit,
dengan siklus 25 kali terdiri dari 96 ºC
Penentuan aktivitas enzim kitinase
selama 10 detik, 50 ºC selama 5 detik dan 60
Aktivitas enzim ditentukan berdasarkan
ºC selama 4 menit.
jumlah gula reduksi yang dilepaskan dan diukur
secara kolorimetri dengan menggunakan metode
yang dijelaskan oleh Monreal dan Reese [9].
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak 2 mL larutan kitin 1,25 % (b/v)
Isolasi bakteri kitinolitik dari Tambak udang
Kitin
dilarutkan dalam 200 mM buffer kalium fosfat
diaduk
dengan
pengaduk
magnet
(1975)
yang
sebagai
media
selektif
untuk
mendapatkan bakteri kitinolitik. Enzim kitinase
tempatkan tabung ke dalam air mendidih selama
ekstraseluler
5 menit dan didinginkan pada suhu kamar.
dari
Bacillus
sp
WY22
menunjukkan spesifitas substrat paling tinggi
Suspensi disentrifugasi selama 10 menit pada
Sebanyak 1
kitin
yang telah dijelaskan oleh Hsu dan Lockwood
selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah 2 jam
rpm.
adalah
dilarutkan dalam asam klorida pekat seperti
dan
ditambahkan 0,5 mL larutan enzim. Inkubasi
kecepatan 4000
koloidal
dengan
mL
menggunakan
kitin
koloidal
bila
dibandingkan menggunakan substrat swollen
supernatan pada tabung sampel ditambahkan 2
kitin, glikol kitin atau serbuk kitin [10].
mL air deionisasi dan 1,5 mL reagen pewarna
Beberapa penelitian yang memanfaatkan kitin
yang mengandung 5,3 M larutan Natrium kalium
koloidal untuk mendapatkan bakteri kitinolitik
tartrat dan Asam 3,5 Dinitrosalisilat 96 mM.
seperti Enterobacter sp NRG4, Aeromonas sp,
Campuran dipanaskan dalam air mendidih
Aeromonas schubertii, Bacillus laterosporous
selama 5 menit setelah dingin diukur serapannya
MML2270 [11, 12, 13, 14].
dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
Hasil eksplorasi bakteri kitinolitik dari
gelombang 540 nm. Sebagai standar digunakan
tambak udang di Lamongan, telah diperoleh 54
N-asetil glukosamin.
isolat (LA 1 – LA54). Berdasarkan hasil uji
Penentuan gen 16S-rRNA
aktivitas pada ekstrak kasar menunjukkan bahwa
B - 194
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
37 dari 54 isolat mempunyai aktivitas kitinase
seperti pada Gambar 1 [15]. Hasil analisis
kuantitatif bakteri kitinolitik berdasarkan uji
aktivitas pada ekstrak kasar memberikan hasil
yang cukup tinggi. Nilai aktivitas tersebut cukup
tinggi bila dibandingkan dengan isolat kitinolitik
yang diperoleh dari tambak udang Tuban [16],
Stenotrophomonas sp. B2-4 yang diisolasi dari
17] and Enterobacter sp. G-1 yang diisolasi dari
Gambar 2. Pewarnaan Gram isolat LA-21 dengan
perbesaran 100 kali
kota Matsue, Jepang [18].
Tabel 1. Hasil uji Fisiologi isolat LA-21
No
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
Gambar 1. Hasil uji aktivitas ekstrak kasar isolat dari
Lamongan
Penentuan spesies Isolat LA-21
Berdasarkan hasil uji fisiologi dan
morfologi isolat LA-21 merupakan bakteri gram
positif berbentuk batang (Gambar 2) dengan
karakteristik koloni berwarna putih, bentuk
bulat,
elevasi
cembung,
margin
bergerigi
(serrate) dan diameter koloni 1-2 mm. Uji
morfologi (Tabel 1) menduga bahwa isolat LA21 merupakan Bacillus cereus dengan percent
probability 63.60%.
B - 195
Jenis uji Biokimia
Oksidase
Motilitas
Nitrat
Lisin
Ornitin
H2S
Glukosa
Xilosa
ONPG
Indol
Urease
VP
Sitrat
TDA
Gelatin
Malonat
Inositol
Sorbitol
Ramnosa
Sukrosa
Laktosa
Arabinosa
Adonitol
Rafinosa
Salisin
Arginin
Amilolitik
Proteolitik
Lipolitik
Hasil
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Gambar 3. Penentuan urutan DNA hasil amplifikasi
isolat LA-21
Penentuan spesies secara genetik, telah
diperoleh hasil amplifikasi isolat LA-21
dengan ukuran DNA 1500 bp. DNA isolatLA21 yang telah ditentukan urutannya
(Gambar 3)
di
BLAST
melalui
situs
www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mendapatkan
sequence alignment. Berdasarkan Sequence
Gambar 4. Phylogenetic Tree yang menunjukkan
kekerabatan isolat LA-21
alignment menunjukkan bahwa isolat LA-21
mempunyai hubungan kekerabatan yang
lebih dekat dengan Bacillus sp AHBR 2
sebesar
97
phylogenetic
%
tree
seperti
seperti
tampak
Bakteri kitinolitik dari kelompok Bacillus
pada
tersebut
sudah banyak
tampak pada
peneliti
yang
Gambar 4 [19]
lain,
dihasilkan
oleh
seperti yang
telah
dilakukan oleh Penelitian lain tentang bakteri
kitinolitik diperoleh beberapa bakteri yang
tergolong
dalam
Bacillus,
Bacillus
sp
maupun Bacillus licheniformis [20,21,22,
B - 196
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
4. Moon S.J, Young ML, Yong LC, Cherol
HK,Young CL., 2005. “Overexpression and
characterization of a novel chitinase gene
from marine bacterium Pseudomonas sp BK1”, Ind. J. Biochem. Biophy., 42 : 339-344
5. Nathalie,C., Fleury, A., Fukamiza,T., and
Ryszard,B.,
2006,
‘Two-exo--Dglukosaminidase from Actinomycetes define
anew subfamily 2 of glikoside hydrolases”,
Biochem.Journal , 394 : 675-686.
6. Gooday, G.W., 1990, “Physiology of
Microbial Degradation of Chitin and
Chitosan”, Biodegradation, 1 : 177-190
7. Mejia-Saulés,J.E.,Waliszewski, K.N.,Garcia,
M.A., and Cruz-Camarillo, R., 2006 “The use
crude shrimp shell powder for chitinase
production by Serratia marcescens”. Food
Techn.Biotechnology, 44(1) : 95-100
23]. Penghasil kitinolitik jenis yang lain juga
telah ditentukan seperti Pseudomonas sp
TKU008 diperoleh dari tanah di Taiwan [24]
Pseudomonas sp TNH54 dari tanah sawah
[25].
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan
bahwa :
1. Bakteri kitinolitik LA-21 yang diisolasi dari
tambak udang Lamongan mempunyai
aktivitas kitinase yang cukup tinggi yaitu
0,731 U/mL
2. Isolat LA-21 merupakan bakteri gram positif
berbentuk batang dan berdasarkan hasil
analisis 16s-rRNA tergolong sebagai
kelompok Bacillus sp
8. Hsu S.C., and Lockwood J.L., 1975,
Powdered Chitin Agar As a Selective
Medium
for
Enumeration
of
Actinomycetes in Water and Soil, Appl.
Microbiol., 29, 3, 422-426.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih disampaikan kepada
kelompok penelitian Kitinase khususnya kepada
Fauziah dan Rio Widodo yang telah
menyelesaikan penelitian ini.
9. Monreal J. and Reese, E.T., 1969, The
Chitinase of Serratia marcescens, Canadian
Journal of Microbiology, 15 : 689-696.
10.
Woo C.D and Park H.D., 2003, An
Extrasellular Bacillus sp Chitinase for the
production of chitotriose as a major
chitinolytic product, Biotechnol. Letters, 25 :
409-412.
11.
Dahiya N., Tewari, and Hoondai, 2005,
Chitinase from Enterobacter sp. NRG4 : Its
Purification, Characterization and Reaction
Pattern, Electronic J. Biotechnol., 8, 2.
12.
Guo, S.H., Chen J.K. and Lee,W.C.,
2004, Purification and Characterization of
Extracellular Chitinase From Aeromonas
schubertii,
Enzyme
and
Microbial
Technology, 35 : 550-556
13.
Huang C.J., and Chen C.Y., 2004,
“Gene
Cloning
and
Biochemical
Characterization of Chitinase CH from
Bacillus cereus 28-9”, Annals. Microbiol.,
54 (3) : 289-297
DAFTAR PUSTAKA
1. Kuddus, S.M., Ahmad, R.I.Z., 2013.
“Isolation of novel chitinolytic bacteria and
production optimization of extracellular
chitinase”, Journal of Genetic Engineering
and Biotechnology., 11 : 39-46
2. Donderski W, Brzezinska MS., 2003. “The
Utilization of N-Aceyloglu-cosamine and
Chitin as Sources of Carbon and Nitrogen by
Plantonic and Benthic Bacteria in Lake
Jeziorak”. Polish Journal of Enviromental
Studies., 12 : 685-692.
3. Chang SC, Wang JT, Vandamme P, Hwang
JH, Chang PS, Chen WM., 2004.
“Chitinimonas taiwanensis gen. nov., sp.
nov., a Novel Chitinolytic Bacterium Isolated
from a Freshwater Pond for Shrimp Culture”
System Appl. Microbiol., 27 : 43–49
B - 197
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
14.
Shanmugaiah V., Mathivanan N.,
Balasubramanian N., and Manoharan P.T.,
2008, “Optimization of cultural conditions
for production of chitinase by Bacillus
laterosporous MML2270 isolated from rice
rhizosphere soil”, Afric. J. Biotechnol., 7, 15,
2562-2568
15.
Fauziah dan Herdyastuti, N. 2013.
“Uji Aktivitas Bakteri Kitinolitik dari
Tambak Udang Di Lamongan dan
Sidoarjo”. UNESA Journal of Chemistry.
2(1) : 36-39
16.
Prabowo,Y.Y., dan Herdyastuti, N.,
2014, “Aktivitas bakteri kitinolitik yang
diisolasi dari tambak udang di Tuban”,
UNESA Journal of Chemistry. 3(3) :
17.
Soeka, YS, and Sulistiani. 2011.
“Seleksi, Karakterisasi, dan Identifikasi
Bakteri Penghasil Kitinase yang Diisolasi
dari Gunung Bromo Jawa Timur”. Jurnal
Natur Indonesia. 13(2). 155-161
18.
Mahata, M., Dharma A., Ryanto, I, and
Rizal Y. 2008. Characterization of
Extracellular Chitinase from Bacterial Isolate
99 and Enterobacter sp. G-1 from Matsue
City, Japan. Microbiology Indonesia. Vol. 2,
No. 1. 34-38
19.
Widodo, R., dan Herdyastuti, N.,
2013, “Penentuan gen penyandi 16SrRNA bakteri kitinolitik dari tambak
udang Lamongan”, UNESA Journal of
Chemistry. 3(3) :
20.
Anuradha, V. dan Revathi, K. 2013.
“Purification and characterization of
chitinase fromtwo Bacillus spisolated
from crustacean shells”. Journal of
Microbiology
and
Biotechnology
Research. 3 (3):160-167.
21.
Haliza, Winda dan Suhartono,
Maggy
Thenawidjaya.
2004.
“Karakteristik Kitinase Dari Mikrobia”.
Buletin Teknologi Pascananen Pertanian
Vol 8 (1).
22. Suryanto, D., Munir, E., and Yurnaliza.
2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik:
Keragaman Gen Kitinase pada Berbagai
Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya.
Medan: Universitas Sumatera Utara.
23. Anindyaputri, Amaryllis. dkk. 2010.
“Chitinolytic Bacteria Isolated from Chili
Rhizosphere: Chitinase Characterization
and Its Application as Biocontrol for
Whitefly
(Bemisia
tabaciGenn.)”.
American Journal of Agricultural and
Biological Sciences. 5 (4): 430-435.
24. Wang S.L., Bo-Shyun L., Liang T.W., Wang
C.L., Pei-Chen W., and Je-Ruei L., 2010,
“Purification and Characterization of
Chitinase from a New Species Strain
Pseudomonas sp. TKU008”, J. Microbiol.
Biotechnol., 20, (6) : 1001–1005
25. Herdyastuti,N., Cahyaningrum S.E.,
Raharjo T.J., Mudasir, Matsjeh,S., 2012,
“Potential antifungal of Chitinolytic
Bacteria Pseudomonas sp TNH54 from
Mud Field”, Research Journal of
Pharmaceutical,
Biological
and
Chemical Sciences, Vol.3 Issue 3:11171124
B - 198