POTENSI TUNIKATA Polycarpa aurata SEBAGAI SUMBER INOKULUM JAMUR ENDOSIMBION PENGHASIL ANTIMIKROBA Arafah Nurfadillah1, Magdalena Litaay1*, Risco G. Budji1, Nur Haedar1 1 Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Hasanuddin, Makassar 90245 *Email: [email protected] ABSTRACT The research on “Potency of tunicate Polycarpa aurata as a source of inoculum of endosymbiont fungal that produces antimicrobial” had been done. The research aimed to know the potency of tunicate as a source of inoculum fungal endosymbiont and to characterize isolate symbiont fungal tunicate P.aurata. Tunicate sample was collected from Barrang Lompo waters of Makassar, South Sulawesi. Isolation of endosymbiont fungi tunicate P. aurata was performed using Potato Dextrose Agar medium (PDA). The characterization of isolate fungal endosymbiont from tunicate P. aurata consist of macroscopic and microscopic observation by simple staining and activity testing against phatogenic microbes Salmonella thypi and Candida albicans. There is one isolate was isolated from intestine of tunicate, named PY1. The result of macroscopic and microscopic observation indicated that isolate was suspected to belong to the genus Saccharomyces. Isolate was able to inhibit the growth of pathogenic microbes, which was bacteriocide to Salmonella typhi and fungicide to Candida albicans. Key word: Ascidian, Polycarpa aurata, Endosymbiont fungus, Antimicrobial. PENDAHULUAN Laut merupakan salah satu sumber Ascidiacea, Thaliacea, (Larvacea) dan Apendicularia Sorberacea. kekayaan biologi dan kimia. Salah satu dibandingkan sumber kekayaan biologi dan kimia dapat invertebrata, tunikata adalah yang paling diperoleh dari organisme laut. Beberapa dekat dengan hewan vertebrata karena dekade mempunyai bagian tulang belakang seperti terakhir, senyawa bioaktif jumlah hasil penelitian isolasi dengan seluruh Jika hewan dari duri dan tabung saraf yang dimiliki saat organisme laut meningkat secara cepat dan masih larva, oleh karena itu tunikata sekarang telah ditemukan ratusan senyawa dimasukan dalam filum Chordata (Colin & baru setiap tahunnya. Senyawa bioaktif Arneson, 1995; Erdmann, 2004). Tunikata tersebut diekstraksi dari berbagai jenis yang ada di terumbu karang, diketahui invertebrata laut, salah satunya yaitu mengandung senyawa kimia yang berguna tunikata (Ananthan and Balasubramanian, sebagai bahan antibiotik, anti tumor, anti 2009; Nofiani, 2008). inflamasi, imunosupresan dan antikanker. Menurut Brusca (2002), tunikata dibagi dalam empat kelas yakni: Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 Salah satu senyawa anti kanker dari tunikata yang sudah cukup dikenal adalah 1 ecteinascidin 743 (ET-743) yang diisolasi polycarpaurine pertama kali dari tunikata Ecteinascidin polucarpathiamines A dan B (Abas et al., turbinate yang sudah dikembangkan di 1996; Radchenko et al., 1997; Wang et Uni Eropa dengan nama Yondelis®, dan al., 2007; Pham et al., 2013). digunakan untuk terapi sarcoma pada jaringan lunak (Carter and Keam, 2007). Tunikata B, C; serta Berdasarkan hal tersebut di atas maka perlu dilakukan penelitian isolasi dapat dan karakterisasi jamur simbion tunikata berasosiasi dengan bakteri laut dan jamur Polycarpa aurata asal perairan Pulau laut (marine derivated fungi). Pada tahun Barrang Lompo sebagai sumber inokulum 2004, dilaporkan 20 senyawa baru dari jamur penghasil senyawa bioaktif yang jamur laut yang telah diisolasi dari berpotensi sebagai antimikroba khususnya tunikata. Beberapa senyawa baru dari mikroba patogen pada manusia. jamur METODE PENELITIAN laut diketahui A, yang berasosiasi dengan tunikata adalah phitolides A-D (jamur Alat-alat yang digunakan pada Phytomyces sp. yang berasosiasi dengan penelitian ini terdiri atas peralatan untuk Oxycorynia fascicularis), oxepinamides A- sampling C (jamur Acremonium sp. yang berasosiasi Peralatan yang digunakan untuk sampling dengan adalah masker, fins, snorkel, wet suit, dan Ecteinascidia turbinate) dan dan peralatan laboratorium. yanuthone A-E (jamur Aspergilus niger coolbox. yang berasosiasi dengan Aplidium sp.) laboratorium adalah autoklaf, cawan petri, yang sebagai deck glass, objek glass, gelas ukur, gelas antiinflamasi dan antimikroba (Bugni and kimia, botol vial, batang pengaduk, sendok Ireland, 2004; Saleem et al., 2007; Wang tanduk, enkas, et al., 1997). lampu spiritus, mikroskop listrik, neraca diketahui berpotensi Salah satu contoh tunikata yang Sedangkan peralatan dalam erlenmeyer, inkubator, ohaus, ose bulat, swab cotton, oven, banyak ditemukan di perairan Indonesia, sentrifuse, khususnya plate, spoit, rak tabung reaksi, pipet tetes, di Kepulauan Spermonde shaker, tabung adalah Polycarpa aurata. Tunikata ini pipet memiliki ciri khas bertubuh agak keras sorong dan timbangan analitik. serta berwarna biru dan kuning. Beberapa penelitian jangka Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah tunikata Polycarpa menunjukkan bahwa tunikata Polycarpa aurata, aquadest, air laut steril, alkohol 70 aurata %, plastik sampel, minyak emersi, paper diantaranya akan telah spektrofotometer, dilakukan kaya yang skala reaksi, hot senyawa yakni: bioaktif, polycarpine; Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 2 disc, medium PDA (Potato Dextrose tabung reaksi yang berisi medium PDA Agar), medium SDA (Sabouraud Dextrose miring dan disimpan sebagai stok kultur Agar), medium Nutrient Agar (NA), untuk persiapan uji selanjutnya. medium PDB (Potato Dextrose Broth), Kultur Jamur Endosimbion methylen blue, aluminium foil, Isolat jamur pada Potato Dextrose chloramphenicol, ketoconazol, mikroba uji Agar, (Candida albicans dan Salmonella thypi), diinokulasikan pada media PDB (Potato NaCl 0,9 % dan spritus. Dextrose Broth) 50 ml dan dishaker pada Pengambilan Sampel Polycarpa aurata kecepatan 120 rpm selama 2 x 24 jam. Pengambilan sampel tunikata P. aurata dilakukan diambil dan Peremajaan Mikroba Uji perairan Pulau Mikroba uji yang digunakan yaitu Makassar pada Salmonella thypi dan Candida albicans SCUBA. yang berasal dari biakan murni, masing- Sesudah diangkat dari permukaan laut, masing diambil sebanyak satu ose lalu selanjutnya dibersihkan menggunakan air diinokulasikan dengan metode gores pada laut steril 2-5 kali. Kemudian dimasukkan medium Nutrient Agar (NA) miring untuk ke dalam plastik sampel, selanjutnya bakteri dan medium Sabouraud Dextrose dibawa Agar (SDA) miring untuk jamur lalu Barrang di kemudian Lompo, kedalaman 2-10 m dengan ke laboratorium dengan menggunakan coolbox. diinkubasi pada suhu 37 Isolasi Jamur Endosimbion 24 jam. Tunikata yang telah dibersihkan Pembuatan Suspensi Mikroba Uji dibelah dan diambil bagian ususnya, kemudian dipotong kecil-kecil dan selama 1-2 x Masing-masing mikroba uji dari agar miring disuspensikan dengan bantuan ditanam di atas medium PDA yang telah larutan memadat. Kemudian diinkubasi selama 5- Suspensi kemudian dituang ke dalam cuvet o NaCl fisiologis 0,9% steril. 7 x 24 jam pada suhu 37 C. Koloni jamur berdiameter 13 mm. Penentuan kepadatan yang tumbuh dan berbeda, kemudian suspensi biakan diatur sehingga diperoleh dipindahkan ke cawan petri berisi medium pengenceran PDA. diperoleh panjang gelombang 580 mm yang memliki selanjutnya dimurnikan dengan metode transmitan 25% (setara dengan kepadatan gores menggunakan ose bulat pada media 108) terhadap blanko NaCl 0,9% steril PDA hingga didapat koloni murni. Koloni dengan yang sudah dimurnikan, dipindahkan ke spektrofotometer. Isolat jamur yang Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 yang diharapkan pada menggunakan alat 3 meliputi; warna koloni, bentuk tepi koloni, Uji Aktivitas (Noverita, dkk., 2009). Pengujian dilakukan secara in vitro dengan metode difusi agar yang menggunakan paper disc berukuran 5 mm. Medium Nutrien Agar (NA) steril dan elevasi, permukaan koloni dan tekstur koloni. b. Pengamatan Mikroskopis (Intani, 2014). medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA) Pengamatan karakter mikroskopis dalam erlenmeyer didinginkan hingga dilakukan suhu mikroskop dan zar warna untuk melihat 40-45 . Kemudian dituangkan dengan suspensi mikroba uji secara aseptis ke bentuk dalamnya mikroskopis sebanyak 1 ml, lalu sel. menggunakan Pengamatan dilakukan secara dengan cara dihomogenkan dan dituang pada beberapa membuat preparat biakan di atas kaca cawan petri dan dibiarkan memadat. objek Beberapa lembar paper disc steril yang telah diwarnai dengan methylen blue, kemudian ditutup dengan masing-masing direndam selama 15 menit cover glass dan ditetesi minyak emersi. dalam suspensi isolat jamur Analisis Data simbion tunikata P. Aurata, suspensi ketoconazol Data diperoleh dari hasil uji (kontrol positif untuk jamur patogen), aktivitas dan pengamatan morfologi jamur suspensi chloramphenicol (kontrol positif endosimbion tunikata P. aurata yang untuk bakteri patogen) dan medium PDB dianalisis secara deskriptif yang diolah (kontrol negatif). Paper disc tersebut dalam bentuk tabel dan gambar. kemudian diletakkan secara aseptis dengan HASIL DAN PEMBAHASAN pinset steril pada permukaan medium Isolasi jamur simbion tunikata P. dengan jarak paper disc satu dengan yang aurata yang berasal dari perairan Pulau lain 2 cm. Selanjutnya diinkubasi pada Barrang Lompo, Makassar diperoleh satu suhu 37 selama 1-2 x 24 jam dan diukur isolat. Dari lima titik potongan usus yang daerah hambatannya menggunakan jangka tersebar pada medium Potato Dextrose sorong. Agar (PDA), hanya satu titik yang Identifikasi Isolat Jamur Endosimbion ditumbuhi oleh jamur yakni titik a pada a. inkubasi Pengamatan Makroskopis (Intani, 7x24 jam. Isolat tersebut kemudian dimurnikan dan diberi kode 2014). Pengamatan karakter makroskopis PY1. Hasil inokulasi tunikata P. aurata dilihat berdasarkan kenampakan koloni pada medium agar dapat dilihat pada yang tumbuh pada medium PDA yang Gambar 1. Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 4 endapan putih di dasar tabung sehingga a tergolong khamir fermentatif, sedangkan PY1 b isolat PY1 yang diinokulasikan pada medium e padat memperlihatkan pertumbuhan berupa bercak putih susu c yang licin. d Berdasarkan hasil pengamatan makroskopis terhadap isolat PY1 dapat Gambar 1. Hasil inokulasi tunikata P. aurata pada medium agar pada inkubasi 7x24 jam. disimpulkan bahwa isolat PY1 tergolong khamir, dimana khamir merupakan mikroorganisme golongan jamur (fungi) Jamur yang tumbuh tersebut kemudian diinokulasikan pada medium yang sama untuk mendapatkan isolat murni. Hasil pemurnian isolat jamur simbion tunikata P. aurata diinokulasikan pada medium agar miring sebagai stok murni untuk karakterisasi makroskopis dan mikroskopis serta persiapan uji aktivitas. Karakterisasi Isolat Jamur Simbion Polycarpa aurata pengamatan lebih kompleks daripada bakteri, berukuran 5-10 kali lebih besar dari bakteri, bereproduksi dengan budding, tidak mempunyai flagela atau organ lain untuk bergerak (Putranto dkk, 2010). Menurut Gandjar dkk (1999), khamir yang dinokulasikan pada medium cair tanpa digoyang akan menunjukkan pertumbuhan 1. Pengamatan Makroskopis Isolat Jamur Hasil yang berbentuk uniseluler, struktur selnya berupa kekeruhan medium yang makin lama akan mengendap sebagai lapisan makroskopis isolat jamur simbion tunikata P. aurata yang dimurnikan pada medium PDA berdasarkan warna, bentuk, tepi, tekstur, dan elevasi koloni yakni: koloni berbentuk oval, berwarna putih susu, bertepi rata, elevasi cembung dan bertekstur licin. Pertumbuhan isolat PY1 pada medium cair yang dirotasi terjadi perubahan warna media dari bening menjadi keruh dan isolat PY1 yang diinokulasikan pada medium cair tanpa dirotasi terbentuk Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 putih pada dasar tabung dan khamir yang diinokulasikan pada medium cair dengan digoyang menunjukkan pertumbuhan berupa kekeruhan medium yang makin lama makin keruh dibandingkan keadaan medium awal, sedangkan khamir yang diinokulasikan pada medium padat tanpa penggoyangan akan menunjukkan pertumbuhan berupa bercak-bercak licin agak basah pada permukaan medium. Bentuk pertumbuhan khamir pada medium cair ada dua yakni: pertumbuhan oksidatif 5 dan pertumbuhan fermentatif. Khamir mm terhadap S. thypi dan 13,85 mm oksidatif terhadap C. albicans, sedangkan pada tumbuh membentuk lapisan (film) atau pelikel pada biakan cair, inkubasi sedangkan khamir fermentatif biasanya menunjukkan diameter hambatan sebesar tumbuh 17,95 mm terhadap S. thypi dan 14,35 mm di seluruh cairan/membentuk endapan (Jumiyati dkk, 2012). jam isolat PY1 terhadap C. albicans. Kontrol (+) bakteri 2. Pengamatan Mikroslopis Isolat Jamur Tunikata Polycarpa aurata Pengamatan 2x24 menghambat 32,55 mm pada inkubasi 1x24 jam dan 33,45 mm pada inkubasi mikroskopis jamur 2x24 jam, sedangkan kontrol (+) jamur merupakan pengamatan yang dilakukan menghambat sebesar dengan menggunakan mikroskop untuk inkubasi 1x24 jam dan 22,75 mm pada melihat bentuk sel dari jamur. Hasil inkubasi 2x24 jam; dan untuk kontrol (-) pengamatan mikroskopis isolat jamur PY1 tidak mampu menghambat pertumbuhan terlihat sel berbentuk oval. bakteri Berdasarkan hasil pengamatan mikroskopis dan makroskopis dan mengacu pada buku The Yeast A Taxonomic Study (Kreger, 1987) ciri yang ditunjukkan oleh Isolat PY1 diduga berasal dari Genus Saccharomyces. dan Uji aktivitas uji. pada Dari hasil pengamatan diameter hambatan diatas, maka isolat PY1 dikatakan berpotensi sebagai antimikroba dimana isolat PY1 bersifat bakteriosidal terhadap S. thypi dan bersifat fungisidal terhadap C. albicans. Hal ini terlihat dari ukuran diameter hambatannya Uji Aktivitas Isolat Jamur Endosimbion jamur 22,5 mm yang meningkat setelah inkubasi 2x24 jam. Antimikroba yang dilakukan untuk bersifat membunuh bakteri dikenal sebagai melihat kemampuan isolat PY1 dalam bakteriosidal sedangkan yang membunuh menghambat mikroba jamur disebut fungisidal (Ganiswarna, patogen dengan menggunakan metode 1995). Besar kecilnya daerah hambatan difusi agar terhadap bakteri Salmonella dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti thypi dan jamur Candida albicans. Hasil laju uji aktivitas antimikroba dari isolat PY1 kemampuan dan laju difusi bahan aktif terhadap mikroba patogen diperlihatkan pada medium, kepekaan mikroorganisme pada Tabel 1. terhadap zat aktif serta ketebalan dan pertumbuhan Berdasarkan Tabel 1 terlihat bahwa pada inkubasi 1x24 jam isolat PY1 pertumbuhan viskositas medium mikroorganisme, (Cappucino and Sherman, 2001). memiliki diameter hambatan sebesar 17,35 Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 6 Tabel 1. Hasil pengukuran diameter hambatan isolat jamur simbion tunikata P. aurata setelah dishaker selama 2x24 jam dengan waktu inkubasi 1x24 jam dan 2x24 jam Diameter Hambatan (mm) 1x24 Jam Nama No Isolat 2x24 Jam Salmonella Candida Salmonella Candida thypi albicans thypi albicans 1 PY1 17,35 13,85 17,95 14,35 2 Kontrol (+) 32,55 22,5 33,45 22,75 3 Kontrol (-) - - - - Keterangan: Kontrol (+) = Chloramphenicol (bakteri) dan Ketoconazol (Jamur) Kontrol (-) = Medium PDB Menurut Roostita (2004), senyawa jamur laut (marine derivated fungi). antimikrobial khamir yang telah diketahui Beberapa senyawa baru dari jamur laut berupa asam-asam organik dan protein. yang berasosiasi dengan tunikata adalah Asam-asam phitolides A-D (jamur Phytomyces sp. tersebut yang dihasilkan memiliki sehingga sifat menghambat khamir antimikroba yang berasosiasi dengan Oxycorynia pertumbuhan fascicularis), oxepinamides A-C (jamur bakteri dan khamir. Berdasarkan hasil dari Acremonium sp. yang berasosiasi dengan beberapa umumnya Ecteinascidia turbinate) dan yanuthone A- mikroorganisme yang hidup dengan cara E (jamur Aspergilus niger yang berasosiasi berasosiasi dengan Aplidium sp.) yang diketahui penelitian, dengan pada organisme laut menunjukkan potensi besar dalam sekresi berpotensi metabolit antimikroba (Bugni and Ireland, 2004; sekunder yang bersifat antimikroba. sebagai antiinflamasi dan Saleem et al., 2007). Mikroorganisme yang berasosiasi Beberapa hasil penelitian dengan inangnya akan memproduksi sebelumnya menyatakan bahwa tunikata senyawa bioaktif yang sama secara Polycarpa aurata kaya akan senyawa struktural dan fungsional dengan senyawa bioaktif, diantaranya yakni: polycarpine; bioaktif polycarpaurine yang diproduksi inangnya Tunikata merupakan salah satu inang dari Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 A-C; serta polucarpathiamines A dan B (Abas et al., 7 1996; Amstrong et al, 2001; Radchenko et al., 1997; Wang et al., 2007; Pham et al., 2013). KESIMPULAN Kesimpulan dari penelitian ini adalah: 1. Tunikata Polycarpa aurata berpotensi sebagai sumber inokulum jamur simbion. 2. Terdapat satu isolat jamur simbion tunikata Polycarpa aurata (PY1) yang tergolong dalam Genus Saccharomyces. Ananthan, M. M. K. G. and T. Balasubramanian (2009), “Antimicrobial Activity of Crude Extracts of Some Ascidians (Urochordata : Ascidiacea) from Palk Strait, (Southeast Coast of India)”, World J. Fish and Marine Sci., 1 (4) : 262-267. Brusca, R C. 2002. Invertebrates 2nd: Other Deuterostomes Chaethognatha, Urochordata, Hemichordata. Sinauer Associates, Sunderland. 936 hlm. Bugni T. S., and C. Ireland (2004), “Marine-derived fungi: A Chemically and Biologically Diverse Group of Microorganisms”, Nat. Prod. Rep., 21:143-63. 3. Senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh jamur simbion tunikata Polycarpa aurata berpotensi dalam menghambat pertumbuhan mikroba patogen, Cappucino, J. G and N. Sherman (2001), Microbiology: A Laboratory Manual, 6th Edition. BenjaminCummings Publishing company, San Fransisco. 447 hlm. dimana bersifat bakteriosidal terhadap Salmonella thypi dan fungisidal terhadap Candida albicans. DAFTAR PUSTAKA Abas, S. A., M. Bilayet H, D. van der H, and J. Francis (1996), Alkaloids from the Tunicate Polycarpa aurata from Chuuk Atoll. J. Org. Chem. [Internet] April 19, 1996, 61 (8), pp 2709-2712. Available from: http://www.pubfacts.com [Accessed 03rd November 2014]. Amstrong, E., L. Yan, K. G. Boyd, P. C. Wright and J. G. Burgess (2001), “The Symbiotic role of Marine Microbes on Living surfaces”, Hydrobiologia, 461:37-40. Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 Carter, N. J. and S. Keam (2007), Trabectedin: A review of its use in the management of soft tissue sarcoma and ovarian cancer, Drugs [Internet] 16th October 2007, 67, 2257-2276. Available from: http://www.pubfacts.com [Accessed 25th October 2014]. Colin, P.L. and C. Arneson (1995), Tropical Pacific Invertebrates: A Field guide to the marine invertebrates occurring on tropical pacific coral reefs, sea grass beds and mangrove, Coral Reef Press, California. pp 296. Erdmann, A. M. (2004), A Natural History Guide To Komodo National Park, The natural conservancy, Indonesia coastal and marine program. pp 228. 8 Gandjar, I., W. Sjamsuridzal dan A. Oetari (1999), Mikologi Dasar dan Terapan, Yayasan Obor Indonesia. Jakarta. Hal 42-43. Intani, D. W. (2014), “Isolasi dan Identifikasi Khamir Berdasarkan Karakteristik Morfologi dan Fisiologis”, Laporan Biologi Khamir, FMIPA ITS. Jumiyati, H. S. Bintari dan I. Mubarok (2012), “Isolasi dan Identifikasi Khamir Secara Morfologi di Tanah Kebun Wisata Pendidikan Universitas Negeri Semarang”, Biosantifika. 4(1) (2012) 27-35. Kreger, R. N. J. W. (1987), The Yeast A Taxonomic Study, Elsevier Science Publisher BV., Amsterdam. 1098 Hlm. Nofiani, R. (2008), Urgensi dan Mekanisme Biosistesis Metabolit Sekunder Mikroba Laut. Jurnal Natur Indonesia10 (2). 120-125. Noverita, D., Fitria dan E. Sinaga (2009), “Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Jamur Endofit dari Daun dan Rimpang Zingiber ottensii Val”, Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 4, No. 4. pp 171176. Pham, C. D., H. Weber, R. Hartmann, V. Wray, W. Lin, D. Lai, and P. Proksch (2013) New Cytotoxic 1,2,4-Thiadiazole Alkaloids from the Ascidian Polycarpa aurata, Org. Lett. [Internet] 12th April 2013, 15 (9), pp 2230-2233. Available from: http://www.pubfacts.com [Accessed 15th October 2014]. Putranto, W. S., R. L. Balia, O. Rachmawan dan E. Wulandari. Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 (2010), “Isolasi Yeast dari Daging dan Potensinya sebagai Agen Biopreservasi dan Pewarna Makanan”, Jurnal Ilmu Ternak, Juni 2010, Vol. 10 No. 1, 21-25. Radchenko, O. S., V. L. Novikov, R. H. Willis, P. T. Murphy and G. B. Elyakov (1997) “Synthesis of polycarpine, a cytotoxic sulfurcontaining alkaloid from the ascidian Polycarpa aurata, and related compounds”, Tetrahedron Letters. 38 (20) pp 3581-3584. Roostita, L B (2004), “Potensi dan Prospek Yeast (khamir) dalam Meningkatkan Diversifikasi Pangan di Indonesia”, Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar Tetap dalam Ilmu Pangan. Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran. Bandung. Saleem, M., Ali, M.S, Hussain, S., Jabbar, A., Ashraf, M., and Y. S. Lee. (2007) Marine natural products of fungal origin. Nat. Prod. Rep. [Internet] October 2007, 24: 1142– 1152. Available from: Http://www.pubfacts.com [Accessed 29th October 2014]. Wang, G. Y.S., B. M. Borgeson and P. Crews (1997), Phitolides A-D, polyketides from a Marine Tunicate-derived Culture of Phytomyces sp. Tetrahedron Letters. [Internet] 8th December 1997. 38(49) pp 8449-8452. Available from: http://www.sciencedirect.com [Accessed 1st November 2014] Wang, W., T. Oda, A. Fujita, R. E. P. Mangindaan, T. Nakazawa, K. Ukai, H. Kobayashi and M. Namikoshi (2007) Three New Sulfur-containing Alkaloids, Polycarpaurines A, B and C, from an Indonesian Ascidian Polycarpa 9 aurata. Tetrahedron. [Internet] 8th January 2007. Vol. 63 (2): 409412. Available from: Submit to Jurnal Alam dan Lingkungan 2015 http://www.sciencedirect.com [Akses 1 Nopember 2014] 10