PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI Penanggung Jawab : dr

PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
Penanggung Jawab :
dr. Indrawati Yunus
DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI PSPD ABDURRAB
PEKANBARU
2014
1
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
KEAMANAN LABORATORIUM
Pada prinsipnya semua specimen klinik, baik darah ataupun cairan tubuh
bersifat infeksius, serta mikroorganisme yang dipakai bersifat pathogen.
Oleh karena itu, untuk menjaga keamanan, perlu diperhatikan dengan
sungguh – sungguh :
1. Dilarang makan dan minum di laboratorium
2. Kuku tangan harus dipotong pendek
3. Bagi mahasiswa putri yang tidak memakai jilbab, rambut harus
diikat rapi ke belakang
4. Harus memakai jas praktikum dan name tag di lab
5. Dilarang menyedot pipet dengan mulut
6. Dilarang membawa kultur ke luar lab
7. Bila terjadi kecelakaan lab segera lapor petugas lab
8. Bila bahan sampel/specimen tumpah, segera bersihkan dengan
tissue dan desinfektan minimal 10 menit
9. Cuci tangan bersih dengan sabun sebelum meninggalkan lab
10. Simpan jas praktikum dalam bahan kedap air (plastik) dan segera
cuci di rumah
11. Mahasiswa yang mempunyai anak kecil atau sedang hamil,
beritahukan pada PJ praktikum. Mahasiswa tersebut tidak boleh
menerima sampel kuman tertentu
2
PELAKSANAAN PRAKTIKUM
1. Praktikum dilaksanakan pda waktu yang sudah ditentukan.
2. Semua tas dan buku ditempatkan pada tempat yang sudah
disediakan, tidak boleh di atas meja praktikum,kecuali buku
penuntun praktikum.
3. Pelajari prosedur praktikum dengan baik sebelum masuk lab
4. 15 menit pertama diadakan pretest sesuai materi yang akan
dipraktikumkan.
5. Mencatat hasil pengamatan dan membuat laporan
LAPORAN PRAKTIKUM
1. Dikumpul paling lambat 3 hari setelah praktikum kepada masing –
masing tutor. Pengumpulan laporan merupakan syarat mengikuti ujian
pratikum. Bila melewati batas waktu, dianggap tidak membuat laporan
dan tidak dapat mengikuti ujian pratikum.
2. Tutor berhak mengembalikan laporan apabila tidak sesuai dengan yang
diharapkan.
3. Dibuat pada buku tulis dan mencakup hal – hal berikut :
a. Judul praktikum
b. Tujuan praktikum
c. Prinsip kerja
d. Alat dan bahan
e. Cara kerja
f. Hasil  gambar dengan warna sesuai dan diberi keterangan
g. Interpretasi cocokkan atau bandingkan hasil dengan teori
praktikum. Bila berbeda dengan teori analisis kemungkinan.
h. Kesimpulan  jabarkan hasil praktikum dengan tujuan
praktikum, apakah tujuan praktikum telah tercapai.
3
BAB 1
PEWARNAAN SEDERHANA
A. Tujuan :
1. Mampu membuat preparat
2. Mampu melakukan pewarnaan sederhana positif dan
pewarnaan negatif
3. Mampu membedakan jenis pewarnaan positif dan negatif
4. Mampu mengidentifikasi bentuk dan rangkaian sel bakteri
B. Prinsip kerja :
 Pengecatan positif : Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan zat warna alkalin/basa karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka basa).
 Pengecatan negatif : menggunakan bahan cat yang
bersifat negatif sehingga tidak menembus dinding sel
bakteri yang juga bermuatan negatif, maka akan
dihasilkan bayangan bakteri yang tidak tercat dengan latar
belakang hitam.
C. Teori Praktikum :
Pewarnaan pada bakteri secara umum di bagi menjadi tiga, yaitu :
Pewarnaan Sederhana, Pewarnaan Difrential/Gram dan
Pewarnaan Khusus
Pewarnaan sederhana



Paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis
zat warna
Dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri
4


D. Alat :




Contoh pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal
violet dan karbol fuchsin
Pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis
pewarnaan
a. Pewarnaan Positif  pewarnaan positif yaitu untuk
melihat bentuk sel. Pada pewarnaan ini dilakukan
fiksasi dengan panas. Contohnya adalah metilen
blue, kristal violet dan karbol fuchsin.
b. Pewarnaan Negatif  metode untuk mewarnai latar
belakang slide menjadi hitam gelap, sehingga
mikroorganisme akan kelihatan transparan (tembus
pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini
olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan
yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka akan
mengurangi
terjadinya
penyusutan
sehingga
penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.
Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.



Slide yang bersih
Kertas tissue
Ose bulat dan ose
jarum
Mikroskop
Lampu bunzen
Marker
Slide holder atau kain
pemegang
E. Bahan :
 Akuades steril
 Specimen : kultur cair, kultur padat, specimen klinik
 Bahan cat positif : metilen blue atau Kristal violet atau
carbol fuchsin
5

Bahan cat negatif : nigrosin atau tinta cina
F. Cara Kerja
A. Pewarnaan Positif
1.
2.
Tandai pojok kiri slide dengan marker
Bila specimen diambil dari kultur cair, gosok tabung, lalu
secara aseptic, ambil 1 – 2 mata larutan bakteri dengan ose
bulat, letakkan di tengah – tengah slide. Ratakan suspensi ini
dengan diameter sekitar 1 cm.
3. Jika menggunakan kultur media padat, letakkan dulu satu
ose bulat air steril di tengah – tengah slide. Kemudian dengan
ose jarum ambil sedikit kultur dan campurkan dengan air
steril tadi. Ratakan suspense.
4. Jika menggunakan specimen klinik (misalnya sputum, pus,
LCS,dsb), ratakan specimen di tengah – tengan slide setipis
mungkin
5. Biarkan slide kering di udara atau tempatkan pada slide
warmer.
6. Lewatkan slide di atas api bunzen sebanyak tiga kali untuk
fiksasi panas dan membunuh bakteri.
7. Tempatkan pulasan preparat yang sudah dibuat tadi di atas
rak kotak pengecatan
8. Genangi preparat dengan metilen blue (1-2 menit) atau
Kristal violet (20 – 30 detik) atau carbol fuchsin (5 – 10 detik)
9. Buang sisa cat dan cuci dengan air beberapa detik
10. Keringkan preparat dengan menekankan kertas tissue secara
hati – hati
11. Lihat di bawah mikroskop, laporkan hasilnya.
6
B. Melakukan Pewarnaan Negatif
1. Beri label ujung kiri atas object glass dengan marker
2. Gunakan ose untuk mengambil specimen dan letakkan
di ujung slide.
3. Campur menjadi suspense yang homogen dengan
menambahkan akuades steril 1 tetes.
4. Tambahkan 1 -2 tetes nigrosin, campur hingga merata
5. Ratakan campuran dengan object glass kedua.
Kemudian buatlah sediaan apus dengan cara
mendorong object glass kedua dengan sudut 45 0,
sehingga terbentuk sebaran yang tipis.
6. Biarkan di udara. Jangan dipanaskan
7. Setelah kering, lihat di bawah mikroskop.
7
BAB 2
PEWARNAAN GRAM
A. Tujuan :
 Mampu melakukan pewarnaan Gram
 Mampu mengidentifikasi kuman berdasarkan sifatnya
terhadap pewarnaan Gram
B. Prinsip Kerja :
Berdasarkan pewarnaan Gram, diklasifikasikan bakteri
Gram-positif dan bakteri Gram-negatif.
Perbedaan ini
berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri akibat
adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri.
 Bakteri Gram-positif akan mempertahankan zat warna
dasar (kristal violet) dan tidak akan luntur pada saat
decolorizing dengan etanol 90% sehingga berwarna
ungu.
 Bakteri Gram-negatif tidak dapat mempertahankan zat
warna dasar pada saat decolorizing sehingga akan
menyerap zat warna berikutnya (safranin) yang
berwarna merah.
C. Teori Praktikum :
Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni
Gram-positif dan Gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik
dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan
penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938).
Dinding bakteri yang kaku dapat mempertahankan
bentuknya dan melindungi sel dari perubahan tekanan osmotik
8
antara sel dengan lingkungannya. Dinding sel bakteri Gram-positif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan membran sel,
sementara dinding sel bakteri Gram-negatif memiliki 3 lapisan :
membran dalam, membran luar dan lapisan peptidoglikan tipis.
Kelompok bakteri yang penting secara medis :
1. Kokus Gram (+) :
 Stafilokokus  spesies patogen utamanya :
Staphylococcus aureus
 Streptococcus  spesies patogen utamanya :
Streptococcus
pyogenes,
penyebab
nyeri
tenggorok
dan
demam
reumatik
dan
Streptococcus agalactiae, penyebab meningitis
neonates dan pneumonia.
2. Kokus Gram (-)
Kabanyakan kuman kokus adalah Gram (+), kecuali
kelompok Neisseria yang merupakan Gram (-). Kuman
yang patogennya :
 Neisseria meningitidis yang menyebabkan
meningitis dan septicemia.
 Neisseria gonorrhoe : penyebab uretritis/servisitis
gonore (infeksi menular seksual)
3. Basilus Gram (+)
a. Yang dapat membentuk spora :
 bersifat aerob Bacillus, spesies patogennya :
Bacillus anthracis (penyebab antraks)
 bersifat
anaerob  Clostridium, spesies
patogennya : Clostridium tetani (penyebab
9
tetanus), C. perfringens (penyebab gas gangrene)
dan C. botulinum (penyebab keracunan pada
makanan kaleng)
b. Yang tidak dapat membentuk spora :
 Corynobacterium spp , spesies patogen :
C.diphtheriae (penyebab difteri)
 Listeria sp , spesies pathogen :
L.monocytogenes (penyakit menyerupai
mononucleosis infeksiosa)
4. Basilus Gram (-)
Meliputi keluarga bakteri fakultatif Enterobacteriaceae,
yang merupakan flora normal pada manusia dan hewan
serta dapat ditemukan di lingkungan.
Genus patogen : Salmonella, shigella, Escherichia,
Proteus dan Yersinia. Serta genus Proteus yang
merupakan patogen penting di rumah sakit (infeksi
nosokomial)
5. Kokobasilus Gram (-)
Meliputi patogen saluran nafas Haemophilus dan
Bordenella .
6. Bakteri spiral
Helicobacter sp (penyebab ulkus lambung dan ulkus
duodenum) dan Campilobacter sp (menyebabkan diare
akut).
10
D. Alat :
 Mikroskop
 Slide yang bersih
 Kertas tissue


Ose bulat dan ose jarum
Bunsen burner
E. Bahan :
a. Slide yang sudah mengandung pulasan kering specimen
b. Bahan cat sederhana :
 Gram A : larutan Kristal violet
 Gram B : larutan lugol / iodine (mordant)
 Gram C : ethanol 95% (decolorator)
 Gram D : larutan safranin atau air fuchsin (counter
stain)
c. Aquades steril
d. Immersion oil
e. Larutan pembersih lensa
F. Cara Kerja :
1. Tempatkan pulasan preparat di atas rak kotak pengecatan
2. Genangi preparat dengan larutan Kristal violet selama 30
detik
3. Cuci dengan air selama 5 detik
4. Genangi dengan larutam lugol selama 1 menit
5. Cuci dengan air 5 detik
6. Lunturkan (decolorizing) dengan etanol selama 15 – 30
detik. Hati – hati dalam pelunturan, lakukan dengan
menuangkan tetes demi tetes sampai warna Kristal violet
kepucatan. Pelunturan jangan terlalu lama.
7. Cuci dengan air 5 detik
8. Genangi dengan safranin 60 – 80 detik
11
9. Cuci dengan air 5 detik
10. Keringkan preparat dengan menekankan kertas tissue
(blotting) secara hati – hati, jangan geserkan yang akan
berakibat lepasnya preparat.
11. Lihat di bawah mikroskop dgn perbesaran objektif 100 X
12. Gambarkan hasil beserta interpretasinya.
G. Pembacaan dan Interpretasi
Kuman Gram-positif : berwarna ungu
Kuman Gram-negatif : berwarna merah
12
Check list Praktikum Mikrobiologi Aktif
Pewarnaan Gram
Nama peserta :
Tanggal ujian
No
1
2
3
4
5
6
7
8
:
Poin Penilaian
Pembuatan preparat untuk pengecatan
Tandai pojok kiri slide dengan marker.
Kemudian letakkan 1 tetes larutan akuades
steril pada kaca objek.
Ambil kuman dari media kultur dengan cara
aseptik
( membuka cawan petri di sekitar panas,
memanaskan ose sampai membara sebelum
dan sesudah dipakai, meletakkan alat yang
sudah digunakan dalam cairan lisol )
Ratakan specimen dan biarkan kering di
udara.
Lewatkan slide di atas api Bunzen 3x untuk
fiksasi panas
Pengecatan Gram
Letakkan preparat di atas rak pengecatan
Genangi preparat dengan Krist al violet
selama 30 detik
Bilas dengan air 5 detik
Genangi dengan larutan lugol selama 1 menit
Bilas dengan air 5 detik
Lunturkan dengan ethanol selama 15 – 30
detik (hati-hati jangan terlalu lama)
Bilas dengan air 5 detik
Genangi dengan safranin 60 detik dan Bilas
13
0
1
2
9
dengan air 5 detik
Keringkan preparat dengan kertas tissue
secara hati-hati.
No
Poin Penilaian
1
2
Diagnosis mikroskopis (8 poin)
2 Spesies pathogen (4 poin)
Nilai =
Bisa
Tidak bisa
30
Penguji,
(
14
)
BAB 3
IDENTIFIKASI MIKROSKOPIS
Identifikasi mikroskopis merupakan pemeriksaan yang murah,
mudah dan cepat. Dalam kasus – kasus tertentu, pemeriksaan mikroskopis
mempunyai nilai diagnosis yang tinggi, misalnya uretritis gonorrhoe.
Dalam pemeriksaan mikroskopis, selain mengamati mikroba, diamati juga
reaksi jaringan yang terjadi, bisa berupa reaksi radang.
Pengamatan mikroba meliputi bentuk, ukuran, susunan bakteri,
reaksi terhadap pengecatan dan ada tidaknya bangunan lain seperti spora,
kapsul, flagel.
1. Berdasarkan bentuknya bakteri diklasifikasikan sebagai berikut :
 Kokus berbentuk sferis atau bulat
 Basilus berbentuk panjang dan tipis
 Kokobasilus : bentuk antara keduanya
 Spiral dengan panjang lengkungan yang berbeda.
2. Berdasarkan susunannya dapat dikelompokkan :
a. Soliter : satu – satu
b. Bergerombol dengan jumlah tertentu :
 Diplococcus
: berdua – dua
 Tetracoccus
: berempat – empat
 Streptococcus : berderet seperti rantai
 Staphylococcus : bergerombol tidak teratur
3. Berdasarkan reaksinya terhadap pewarnaan diferensial :
a. Pewarnaan Gram
: Gram-positif dan Gram-negatif
b. Pewarnaan tahan asam : tahan asam dan tidak tahan
asam
15
4. Bangunan khusus pada bakteri
a. Dengan pengecatan umum
b. Dengan pengecatan khusus
dan flagel
: ada tidaknya spora
: granula intrasel, kapsul
Gambar 3.1 berbagai macam bentuk bakteri
16
1. Staphylococcus aureus dengan pewarnaan Gram
2. Streptococcus pneumonia dengan pewarnaan Gram
17
3. Neisseria gonorrhoe dengan pewarnaan Gram
4. Salmonella typii dengan pewarnaan Gram
18
5. Mix anaerobic infections
19
20
KEPUSTAKAAN
1.
2.
3.
4.
Hadi,Purnomo. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi.
Semarang : Bagian Mikrobiologi FK UNDIP
Gillespie S & Bamford K. 2009. At a Glance Mikrobiologi Medis
dan Infeksi edisi ketiga. Jakarta : Penerbit Erlangga
Todar Kenneth. 2009. Todar’s Online Textbook of Bacteriology.
Diunduh dari www.textbookofbacteriology.net
Teknik Pewarnaan bakteri diunduh dari www.bengkelbio. Last
update : 10 Januari 2010.
21