III. TEKNIK PEWARNAAN GRAM IDENTIFIKASI BAKTERI Tujuan: 1

III. TEKNIK PEWARNAAN GRAM IDENTIFIKASI BAKTERI
Tujuan:
1. Mempelajari cara menyiapkan olesan bakteri dengan baik sebagai
prasyarat untuk memeplajari teknik pewarnaan
2. Mempelajari cara melakukan pewarnaan sederhana bakteri untuk
mengamati bagian atau struktur bakteri
3. Mempelajari prosedur pewarnaan gram, memahami tahapan prosedur dan
reaksi kimiawi yang terlibat dalam prosedur
Pendahuluan
Bakteri berukuran sangat kecil dan tipisa sehingga sukar dilihat struktur
tubuhnya walaupun dengan bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri
secara lebih jelas dikembangkan teknik pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan
bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion protoplasma sel.
Ada dua kelompok zat pewarna bakteri.(1) bersifat asam, berupa anion dan
umum digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat alkalis, berupa kation
dan umum digunakan dalam bentuk klorida. Selain zat warna diperlukan zat
tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil rekasi zat warna dengan
komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat pematek
yang akan melekatkan zat warna pada plasma sel. Contoh zat pematek adalah:
Amonium, fenol, Yodium, Asam tanat, Garam-garam Aluminium, Besi, Timah,
Seng, Tembaga, Chrom, dll. Pematek dapat ditambahkan sebelum pewarnaan,
ditambahkan ke dalam larutan zat warna atau saat diatara pewarnaan
menggunakan dua zat warna. Umumnya larutan zat warna dibuat dalam
konsentrasi kurang dari 1% untuk meningkatkan daya lekat warna pada dinding
sel bakteri.
Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi:

Pewarnaan sedehana atau tunggal, dengan menggunakan satu macam zat
warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.

Pewarnaan diferensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.
Prosedur
1. Pewarnaan Sederhana

Bersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak.
Kemudian panaskan diatas lampu spirtus.

Buat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Jika sampel berbentuk padat
gunakan NaCl fisiologis untuk membuat suspensi.

Pijarkan ose lalu dinginkan. Celupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan
goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada
medium padat(media agar), maka teteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu
pada kaca preparat kemudian goreskan bakteri tersebut dengan ose.

Keringkan preparat dengan mengangin-anginkan pada suhu ruang atau
dekat hawa hangat api, kemudian lalukan preparat diatas api bunsen
sebanyak 3 x.

Dinginkan preparat kemudian beri 5 tetes zat warna diatas suspensi yang
telah mengering dan diamkan selama 1-2 menit.

Zat warna yang berlebih dituang dari preparat dan dicuci dengan air yang
telah disediakan dalam botol semprot

Preparat dikeringkan dengan kertas saring atau dekat nyala api

Preparat kemudian ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada bagian yang
akan diamati

Hasil yang diamati dicatat dan digambar
Hasil pewarnaan:

Dengan air fucshin sel bakteri berwarna merah

Dengan kristal violet sel bakteri berwarna violet

Dengan biru metilen sel bakteri berwarna biru
Hasil pengamatan:
1.
Gambarkan bentuk sel bakteri yang saudara lihat
2.
Apa tujuan pemanasan diatas nyala api
2. Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan digunakan untuk mengetahui morfologi dan identifikasi jenis bakteri.
Pewarna yang digunakan dua atau lebih. Contoh pewarnaan diferensial adalah
pewarnaan Gram, pewarnaan Spora, pewarnaan kapsul, dll.
Pewarnaan Gram
Cara kerja

Siapkan preparat sampel dalam bentuk suspensi diatas kaca objek dan
keringkan dengan mengangin-anginkan atau meletakkannya dekat api.
Setelah itu lalukan di atas api sebnayak 3x.

Tetesi preparat tersebut dengan zat warna Karbol Gentian Violet. Diamkan
selama 30 detik. Buang zat warna berlebih.

Tambahkan zat pematek Lugol (Iodium : Kalium Iodium : Aquades = 1 :
2 : 300), selama 30 detik. Kemudian cuci dengan air

Bilas preparat dengan alkohol 96% selama 2 detik hingga zat warna larut
kemudian bilas dengan akuades.

Tetesi preparat dengan pewarna kedua. Diamkan selama 30 detik. Buang
kelebihan zat warna. Bilas dengan akuades.

Keringkan preparat dan diatasnya diberi satu tetes minyak imersi untuk
menghindarkan perbedaan indek bias. Amati di bawah mikroskop.

Catat hasil pengamatan.
Hasil :
Bakteri gram positif berwarna ungu dan
Bakteri negatif berwarna merah
Beberapa perbedaan bakteri gram positif dan negatif
Bakteri gram positif

Mangandung Mg Ribonukleat

Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan

Sensitif terhadap penisilin

Tahan basa, tidak larut dalam KOH 1%

Kisaran isoelelektrik pH 2,5 – 4

Biasanya berbentuk kokus atau batang pembentuk spora kecuali
Lactobacillus dan Cyanobacterium

Dapat bersifat tahan asam
Contoh :
Staphylococcus albus, Bacillus subtilis
Bakteri gram negatif

Tidak mengandung Mg ribonukleat

Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan

Sensitif terhadap streptomisin

Sensitive basa, larut dalam KOH 1%

Kisaran isoelektrik pH 4,5 – 5,5

Biasanya berbentuk batang non spora kecuali neisseria

Tidak tahan asam
Contoh :
Salmonella thypii
Escericia coli
Pewarnaan Gram
Hasil dan pengamatan
1.
Jelaskan bentuk sel, rangkaan dan warnanya
2.
klasifikasikan mikroorganisme tersebut berdasarkan reaksi gram
3.
apa keuntungan pewarnaan digerensial di bandingkan pewarnaan tunggal
3. Pewarnaan Negatif
Pewarnaan ini bertujuan untuk mengetahui morfologi bakteri yang tidak
dapat diwarnai dengan teknik sederhana. Sesuai namanya, yang diwarnai pada
teknik ini adalah latar belakang suspensi preparat menggunakan tinta cina,
sehingga mikroorganisme terlihat transparan diantara medan yang gelap.
Tujuannya adalah melihat morfologi bakteri.
Cara kerja :
1. Sediakan dua buah kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak
2. Teteskan setetes tinta cina pada salah satu ujung kaca objek
3. Letakkan suspensi bakteri di samping tinta cina dengan menggunakan
kawat ose steril.
4. Dengan kaca objek yang kedua, kedua tetesan tersebut dicampurkan dan
diratakan dengan posisi 45o terhadap kaca objek dibawahnya. Selanjutnya
kaca objek tersebut didorong menuju ujung sebelahnya (diapus) sehingga
membentuk sebuah lapisan film yang tipis
5. Keringkan kaca objek tersebut, amati dibawah mikroskop
Hasil Pewarnaan
Bakteri berupa bagian bening pada latar yang gelap
a.
Bakteri kotoran gigi
b.
Menggunakan pewarna tinta cina
Pewarnaan Negatif
Gambarkan hasil pengamatan saudara