Untitled - Jurnal Online UM

1
Anggrek merupakan salah satu tanaman yang menempati posisi penting
dalam industri florikultura di Indonesia, terutama anggrek species. Anggrek
species merupakan tanaman anggrek yang tumbuh secara alami, bersifat endemik,
dan pada umumnya tumbuh di ekosistem hutan. Salah satu jenis anggrek species
yang sering dijadikan sebagai induk dalam persilangan adalah D. helix (Cribb,
1985). Anggrek ini memiliki warna bunga kecokelatan, hal ini merupakan salah
satu faktor yang membuat anggrek ini banyak diminati. Warna bunga pada
tanaman dipengaruhi adanya kandungan beberapa pigmen, khususnya antosianin
yang termasuk golongan senyawa flavonoid. Warna bunga ditentukan oleh enzim
yang mengkatalisis biosintesis antosianin. Gen regulator yang terlibat dalam jalur
biosintesis antosianin adalah gen Myb, Myc, dan Wd, sedangkan gen struktural
yang terlibat adalah gen Chs dan DFR (Hongmei et al., 2009). Gen DFR
merupakan gen pengkode enzim DFR yang berfungsi untuk mengkatalisis
senyawa dihidroflavonol menjadi leucoantosianidin. (Katsumoto et al., 2007).
Proses screening molekular anggrek species merupakan salah satu usaha
untuk mendukung pemberdayaan genotipe unggul anggrek (Ming et al., 2013).
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil genetik gen DFR berdasarkan
karakter unggul warna bunga pada Dendrobium helix.
METODE PENELITIAN
Penelitian ini termasuk penelitian deskriptif eksploratif. Sampel yang
digunakan dalam penelitian ini adalah daun muda Dendrobium helix varian
“Pomeo Brown”. Isolasi DNA sampel mengikuti protokol modifikasi dari kit
Geneaid DNA Isolation Kit. Modifikasi meliputi tahap pre treatment sampel, lisis
(lama inkubasi), serta elusi. Protokol isolasi DNA meliputi tahapan sebagai
berikut : Pre treatment sampel, disosiasi jaringan, lisis, binding, washing, dna
elusi. Primer yang digunakan dalam penelitian ini didesain berdasarkan daerah
conserve gen DFR Dendrobium moniliforme. Primer forward F1 : (5’ ATG GAG
AAT GAG AAG AAG GG-3’) dan reverse R1 : (5’- TGC AGT GAT CAT GCT
TGG TG-3’). Siklus PCR yang digunakan sebagai berikut : denaturasi 94⁰C
selama 20 detik, annealing 56⁰C selama 20 detik, ekstensi 72⁰C selama 50 detik
dan ekstensi akhir 72⁰C selama 5 menit. Hasil PCR diperiksa melalui
2
elektroforesis dengan gel agarose 1,5%. Hasil dari elektroforesis diperiksa dengan
menggunakan UV Transiluminator. Hasil amplifikasi gen DFR disekuensing di
First BASE Laboratories, Malaysia.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil sekuensing gen target yang teramplifikasi adalah fragmen DNA
sepanjang 630 bp. Kromatogram menunjukkan bahwa fragmen yang diperoleh
tidak spesifik, terlihat dari puncak kurva yang bertumpuk dan urutan basa yang
tidak tidak lazim (poli G; poli C; poli A, dan poli T). Hal ini mengindikasikan
adanya multiple fragment yang teramplifikasi. Multiple fragmen diduga karena
multialel pada gen DFR Dendrobium helix. Dugaan ini berdasarkan pada beberapa
penelitian terdahulu yang melaporkan bahwa gen DFR merupakan kluster gen
pada beberapa spesies tumbuhan. Gen DFR Lotus japonicus terdiri dari 5 lokus
yaitu DFR1, DFR2, DFR3, dan DFR5; gen DFR 4 mengalami splicing
menghasilkan 2 gen yaitu DFR4a dan DFR4b sehingga ada 6 gen DFR pada Lotus
japonicus (Shimada et al., 2005). Sementara itu tumbuhan yang lain memiliki 1
gen DFR misalnya
Ascocenda spp. (Kunu et al., 2012), Brohmedia
Finlaysoniana (Liew et al., 1998) dan Cymbidium hybrida (Johnson et al., 1999).
Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan amplifikasi ulang dengan menggunakan
sepasang primer yang sama untuk memastikan dugaan diatas.
Hasil sekuensing fragmen DNA kedua yang teramplifikasi sepanjang 570bp.
Kromatogram menunjukkan bahwa sekuen forward kurang spesifik (Gambar 1.),
sedangkan sekuen reverse menunjukkan hasil yang lebih jelas (Gambar 2.).
3
Perbedaan hasil sekuensing diduga karena adanya multialel. Dugaan multialel
tersebut didasarkan atas substrat dan produk metabolit (pigmen) yang dihasilkan
berbeda.
Gambar 1. Kromatogram Forward dari Hasil Sekuensing Kedua
Gambar 2. Kromatogram Reverse dari Hasil Sekuensing Kedua
Perbedaan pigmen menyebabkan variasi warna bunga (Reddy et al., 2014;
Griesbach, 1995; Tanaka et al., 2009). Sianidin dalam jumlah yang banyak akan
4
menghasilkan bunga berwarna merah dan pink (Griesbach, 1995; Tanaka et al.,
2009). Peonidin dalam jumlah yang banyak akan menghasilkan bunga berwarna
merah hingga ungu (Griesbach, 1995). Delphinidin dalam kadar hingga 95% akan
menghasilkan bunga berwarna biru (Tanaka et al., 2009). Pelargonidin akan
menghasilkan bunga berwarna merah dan orange (Tanaka et al., 2009,). Malvidin
dalam kadar 77,3% dengan kombinasi petuniidn 22,7% menghasilkan bunga
berwarna violet (Griesbach, 1995). Berdasarkan hasil penelitian tersebut maka
warna coklat pada Dendrobium helix varian Pomeo Brown diduga karena
dominasi senyawa pelargonidin, hal ini belum ada laporan sebelumnya sehingga
dibutuhkan uji profil konten antosianin.
Perbedaan produk katalis dari enzim DFR diduga karena perbedaan
substrat enzim DFR (Katsumoto et al., 2007), hal ini mengindikasikan adanya
perbedaan enzim DFR ini. Sifat spesifik enzim DFR dalam mengkatalisis substrat
dipengaruhi oleh variasi residu Perbedaan produk katalis dari enzim DFR
dipengaruhi oleh perbedaan asam amino pada specific active site. Shimada (2005)
melaporkan bahwa residu asam amino pada sebagian besar spesies tumbuhan
adalah Asparagine (Asn), sedangkan pada tumbuhan yang lain khususnya
tumbuhan dikotil adalah Aspartat (Asp). Enzim DFR pada Viola cornuta dan P.
Hybrida mengalami penggantian residu active sitenya menjadi asam glutamat
sehingga enzim ini tidak memiliki kemampuan katalitik pada substrat
Dihydrokaempferol (Johnson et al., 2001).
Perbedaan residu asam amino enzim DFR diduga karena perbedaan urutan
basa penyusun gen DFR, karena setiap asam amino dikode oleh kodon yang
terdiri atas 3 basa nukleotida dengan urutan tertentu (Snustad & Simmon, 2012).
Perbedaan susunan basa nukleotida tidak hanya pada active site dari enzim DFR
melainkan juga pada bagian lain dari enzim tersebut sehingga ada kemungkinan
urutan basa di sepanjang gen DFR berbeda. Ketidakspesifikan fragmen forward
hasil sekuensing diduga karena terjadi amplifikasi domain gen DFR yang berbeda
dengan susunan asam amino yang berbeda.
5
KESIMPULAN
Profil genetik anggrek Dendrobium helix varian “Pomeo Brown” belum
dapat ditemukan. Sekuen konsensus gen DFR belum dapat diperoleh. Sekuen
konsensus tidak didapat diduga karena multialel.
DAFTAR PUSTAKA
Cribb.1985. The Antelope and Latourea Dendrobiums. American: Kew Buletin.
Griesbach, R.J. 1995. The Inheritance of Flower Colour in Petunia hybrida. The
Journal of Heredity, 87(3) : 241-245.
Hongmei, M. & Margaret, P. 2009. Anthocyanin Regulatory Structural Gene
Expression in Phaleonopsis. Social Horticulture Science, 134 (1): 88-96.
Hsiao, Y.Y., Pan, Z.J., Hsu, C.C., Yang, Y.P., Hsu, Y.C., Chuang, Y.C., Shih,
H.H., Chen, W.H., Tsai, W.C. & Chen, H.H. 2011. Research on Orchid
Biology and Biotechnology. Plant and Cell Physiology, 52: 1467–1486.
Imene, H., Francoi, B., Jochen, B., Christian, K., Serge, D. & Virginie, L. 2011.
Recent Advances in the Transcriptional Regulation of the Flavonoid
Biosynthetic Pathway. Journal of Experimental Botany, 62 (8): 2465–2483.
Johnson, E.T., Yi, H., Shin, B., Oh, B.J., Cheong, H. & Choi, G. 1999.
Cymbidium hybrida Dihydroflavonol 4-reductase Does Not Efficiently
Reduce Dihydrokaempferol to Produce Orange Pelargonium-type
Anthocyanin. Plant Journal, 19 (1): 81-85.
Johnson, E.T., Ryu, S., Shin, B., Cheong, H. & Choi, G. 2001. Alteration of a
Single Amino Acid Changes the Substrate Specificity of Dihydroflavonol 4Reductase. The Plant Journal, 25 (3): 325-333.
Katsumoto, Y., Fukuchi, M., Fukui, Y., Brugliera, F. & Holton, T.A. 2007.
Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully
Generated Blue-hued Flowers Accumulating Delphinidin. Plant Cell
Physiology, 48: 1589-1600.
Kunu, W., Thanonkeo, S. & Thanonkeo, P. 2012. Cloning and Expression
Analysis of Dihydroflavonol 4-reductase (DFR) in Ascocenda spp. African
Journal of Biotechnology, 11 (64): 12702-12709.
Liew, C.F., Loh, C.S., Goh, C.J. & Lim, S.H. 1998. The isolation, Molecular
Characterization and Expression of Dihydroflavonol 4-reductase cDNA in
the Orchid Brohmedia finlaysoniana. Plant Science, 135: 161-169.
6
Ming, H.H., Zhao, J.P., Pei, H.L., Hsiang, C.L., Hsin, H.Y., Chia, C.H., Wan,
L.W., Mei, C.C., Shyh, S.W., Wen, H.C. & Hong, H. C. 2013. VirusInduced Gene Silencing Unravels Multiple Transcription Factors Involved
in Floral Growth and Development in Phalaenopsis orchids. Journal of
Experimental Botany, 64 (12):3869–3884.
Reddy, A.M., Francies, R.M., Rasool, S.K.M. & Reddy, V.R.P. How Genes Paint
Flowers and Seeds. International Journal of Current Research, 6 (1): 47224732.
Shimada, N., Sasaki, R., Sato, S., Kaneko, T., Tabata, S., Aoki, T & Ayabe, S.
2005. A Comprehensive Analysis of Six Dihydroflavonol 4-reductase
Encoded by A Gene Cluster of the Lotus japonicus Genome. Journal
Experimental Botany, 56 (419): 2573-2585.
Snustad, D.P. & Simmons, M.J. 2012. Principle of Genetics sixth edition. John
Wiley&Sons, Inc.
Tanaka, Y., Bruliera, F. & Chandler, S. 2009. Recent Progress of Flower Colour
Modification by Biotechnology. International Journal of Molecular
Sciences, 10: 5350-5369.
7