Methylene Blue - Institut Teknologi Sepuluh Nopember

JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
1
Viabilitas Bacillus terhadap Methylene Blue
yang Berpotensi untuk Microbial Fuel Cell
(MFC)
Faisal Azis Prihantoro dan Enny Zulaika
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh
Nopember (ITS)
Jl. Arief Rahman Hakim, Surabaya 60111 Indonesia
e-mail: [email protected]
Abstrak—Microbial Fuel Cell (MFC) merupakan salah satu
cara mendapatkan energi listrik dari metabolisme bakteri.
Methylene blue adalah salah satu senyawa kimia yang digunakan
sebagai mediator imobilisasi elektron untuk mengalirkan elektron
pada sirkuit MFC. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui
apakah Bacillus mampu melakukan fermentasi glukosa dan
mengetahui kemampuan resistensi bakteri Bacillus terhadap
methylene blue sebelum digunakan sebagai bioanoda MFC.
Metode uji viabilitas Bacillus terhadap methylene blue
menggunakan kertas cakaram dan kurva pertumbuhan, sedangkan
fermentasi bakteri ditumbuhkan pada medium cair yang
menggunakan glukosa. Hasil yang diperoleh Bacillus S1, SS19,
dan DA11 mampu memfermentasi glukosa dan resisten serta viabel
terhadap methylene blue. Bacillus DA11, S1, SS19 mampu tumbuh
dengan optimal pada medium yang telah mengandung methylene
blue dengan konsentrasi 0,05 mM.
Kata Kunci—Bacillus, Methylene blue, MFC, Resistensi.
akan mengambil elektron dari rantai transpor elektron mikroba
sehingga mediator berubah ke spesi tereduksi (Medred). Spesi
(Medred) kemudian teroksidasi kembali di anoda menjadi spesi
Medox. Elektron yang dilepaskan dari proses ini kemudian
masuk ke sirkuit elektrik MFC melalui anoda [6].
Substrat berpengaruh dalam proses MFC dalam
menghasilkan jumlah elektron. Glukosa merupakan subtrat
yang sering digunakan dalam MFC. Glukosa merupakan gula
sederhana (monosakarida) yang mudah digunakan sebagai
substrat dalam menghasilkan energi oleh bakteri [7]. Isolat
yang digunakan yaitu bakteri Bacillus S1, SS19, dan DA11
yang merupakan isolat Koleksi Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi jurusan Biologi ITS, Surabaya. Pada
penelitian ini apakah Bacillus S1, SS19, dan DA11 rsisten dan
viabel terhadap methylene blue serta mampu melakukan
fermentasi glukosa.
I. PENDAHULUAN
II. METODOLOGI
Microbial fuel cell (MFC) merupakan salah satu
teknologi untuk menghasilkan listrik dari biomassa yang
menggunakan bantuan metabolisme bakteri [1]. Aliran listrik
didapatkan dari elektron yang berasal dari proses metabolisme
bakteri. Bakteri mampu melakukan degradasi bahan organik
maupun an organik untuk menghasilkan energi. Katabolisme
merupakan proses mendapatkan energi dari pemecahan
senyawa komplek. Terdapat dua jenis transfer elektron dari
bakteri menuju anoda yaitu, transfer elektron secara langsung
(DET) dan transfer elektron menggunakan mediator (MET)
[2]. DET dapat terjadi ketika bakteri terjadi kontak fisik
dengan anoda yang mengakibatkan elektron dari cytokrom
pada outer membran sel bakteri ditransfer menuju permukaan
anoda, contohnya yaitu genus Geobacter [3]. MET merupakan
transfer elektron secara tidak langsung dari bakteri ke anoda,
hal ini dapat terjadi dengan menggunakan mediator. Mediator
merupakan molekul yang membantu transfer elektron antara
bakteri dan elektroda. MET terjadi ketika bakteri tidak
mempunyai cytokrom pada membran luar nya sehingga tidak
bisa terjadi transfer secara langsung [4]. Senyawa yang bisa
digunakan sebagai mediator diantaraya, methylene blue,
neutral red, thionin, phycocyanin, dan methyl viologen [5].
Methylene blue merupakan salah satu mediator yang
digunakan sebagai pentransfer elektron dari bakteri menuju
anoda. Senyawa mediator dalam bentuk teroksidasi (Medox)
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Waktu penelitian dari bulan Februari sampai dengan bulan
Mei 2015. Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi
dan Bioteknologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, ITS.
B. Uji Fermentasi Glukosa
Uji fermentasi glukosa bertujuan untuk mengetahui
Bacillus mampu memfermentasi glukosa dan membuktikan
bahwa Bacillus merupakan bakteri kemoorganotrof. Isolat
Bacillus diremajakan pada medium NA slant secara aseptis,
diinkubasi selama 24 jam. Isolat yang sudah disubkulturkan
yang berumur 24 jam selanjutnya dilakukan uji fermentasi
karbohidrat. Media fermentasi yang digunakan adalah 1%
glukosa dalam 100 mL media cair pepton water yang
mengandung 1 ml indikator pH bromthymol blue 0.1%. Secara
aseptis masing-masing media fermentasi sebanyak 5 mL
dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi tabung
Durham. Masing-masing isolat Bacillus S1, SS19, dan DA11
sebanyak satu ose diinokulasikan ke dalam media fermentasi
secara aseptis dan diinkubasi selama 24 jam. Isolat yang
mampu memfermentasikan karbohidrat, ditandai dengan
perubahan warna media dari biru menjadi kuning dan atau
timbulnya gas pada tabung durham [8].
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
C. Viabilitas Bacillus Methylene Blue
Tujuan dari uji viabilitas Bacillus untuk mengetahui
konsentrasi methylene blue yang digunakan sebagai mediator
pada reaktor MFC yang viabel terhadap Bacillus serta
mengetahui resistensi Bacillus terhadap methylene blue secara
kualitatif. Konsentrasi methylene blue yang digunakan untuk
antimikrobial adalah 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM dan 2
mM. Secara aseptis dengan metode Kirby-Bauer suspensi
Bacillus dinokulasikan ke media NA cawan dengan
menggunakan cotton bud steril [8]. Kertas cakram yang
mengandung methylene blue dengan konsentrasi diatas
diletakkan di atas media yang telah diinokulasi isolat,
selanjutnya isolat diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam.
Isolat yang dipilih adalah isolat yang tidak membentuk zona
bening atau isolat yang membentuk zona bening relatif kecil
dibanding isolat lainnya. Pengamatan viabilitas Bacillus
dilakukan dengan cara ditumbuhkan pada medium cair untuk
mengetahui Bacillus mampu tumbuh atau tidak pada medium
cair yang ditambah methylene blue. Medium nutrient broth
(NB) dengan kultur isolat Bacillus ditambah methylene blue
dengan konsentrasi sesuai hasil uji resistensi di atas.
Komposisi kultur uji viabilitas terdiri dari kultur Bacilllus
pada medium NB 20 ml umur 24 jam dimasukkan dalam NB
180 ml yang telah ditambah 2 tetes methylene blue sesuai
dengan hasil uji resistensi di atas. Selanjutnya diinkubasi pada
suhu ruang di atas rotary shaker. Pengamatan pertumbuhan
dilakukan dengan mengukur nilai OD menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Mulai
pengukuran OD dilakukan setiap 1 jam selama 24 jam.
2
dihasilkan Bacillus S1, SS19, dan DA11 bervariasi. Ketiga
Bacillus uji membentuk zona bening yang relatif kecil pada
konsentrasi 0,05 mM dibandingkkan konsentrasi diatas 0,1
mM. Bacilllus S1 membentuk zona bening dengan diameter
0,6 cm, SS19 dengan diameter 0,4 cm, dan DA11 dengan
diameter 0,6 cm (Tabel 1).
Zona bening yang terbentuk di sekeliling koloni
menunjukkan bahwa bakteri tidak resisten terhadap methylene
blue, sedangkan tidak adanya zona bening menunjukkan
bahwa bakteri resiten terhadap methylene blue. Tidak
terbentuknya zona bening mengindikasikan bahwa Bacillus
S1, SS19, dan DA11 resisten terhadap methylene blue.
a
b
c
d
Gambar 1. Fermentasi Glukosa oleh Bacillus.
Keterangan gambar : (a) Bacillus SS19; (b) Bacillus S1 (c) Bacillus DA11 (d)
kontrol.
a
b
2
1
1
0,5
III. HASIL DAN DISKUSI
Hasi uji fermentasi glukosa dilakukan untuk mengetahui
Bacillus S1, SS19, dan DA11 mampu melakukan fermentasi
gula. Gula yang digunakan adalah glukosa. Hasil uji
rekonfirmasi fermentasi glukosa menunjukkan Bacillus S1,
SS19, dan DA11 mampu melakukan fermentasi glukosa
dengan menunjukkan reaksi positif yang ditandai dengan
berubahnya warna medium dari biru ke kuning. Perubahan
warna diakibatkan adanya asam organik yang dihasilkan dari
proses metabolisme Bacillus sehingga terjadi penurunan pH
dari alkali (biru) menjadi asidi (kuning) (Gambar 1).
Glukosa merupakan karbohidrat sederhana yang termasuk
dalam monosakarida [7]. Glukosa digunakan bakteri sebagai
sumber energi (ATP). Genus Bacillus merupakan bakteri yang
bersifat kemoorganotrof, dimana sumber energi didapatkan
dari bahan organik [9]. Pembentukan ATP pada fermentasi
karbohidrat disebut fosforilasi tingkat substrat. Pada proses
tersebut, ATP disintesis langsung dari senyawa intermediet
yang kaya energi selama proses katabolisme. Senyawa hasil
akhir fermentasi dapat berupa asam organik, gas, atau alkohol
[10].
Isolat Bacillus S1, SS19, dan DA11 resiten terhadap
methylene blue 0,1 mM dan 0,05 mM yang ditunjukkan
dengan tidak terbentuknya zona bening atau zona bening yang
terbentuk relatif kecil (Gambar 2). Zona bening yang
0,1
2
0,05
0,05
0,5
0,1
c
Gambar.2. Resistensi Isolat Bacillus terhadap Methylene Blue.
Keterangan gambar : (a) Bacillus S1; (b) Bacillus SS19 (c) Bacillus DA11.
Tabel 1. Diameter Zona Bening
Diameter Zona Bening (cm) pada Medium yang
Isolat
Mengandung Methylene Blue (mM)
Bacillus
0,05
0,1
0,5
1
2
S1
0,6
1
1,2
1,3
1,3
SS19
0,4
0,5
1,3
1,5
1,5
DA11
0,6
0,6
0,7
0,9
1
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
Optical Density (OD )
B acillus S1
0.800
0.600
0.400
0.200
-
NB
0,05 mM
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 01 11 21 31 4
0,1 mM
Jam ke-
Optical Density (OD)
B acillus SS19
0.800
0.600
0.400
0.200
-
NB
0,05 mM
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 01 11 21 31 4
0,1 mM
Jam Ke-
B acillus DA11
Optical Density (OD)
Senyawa methyelene blue dapat masuk ke dalam sel
bakteri dan membentuk fotoreduksi menjadi leuco-dye pada
kondisi anaerob. Methylene blue akan berikatan dengan rantai
DNA yang menyebabkan untai ganda DNA akan putus
menjadi untai tunggal. Methylene blue akan berikatan dengan
DNA mikroorganisme pada rantai G-C. Ikatan ini membentuk
senyawa tricyclic heterocyclic yang menyebabkan ikatan ionik
menjadi lemah [11].
Bakteri mampu menangani kerusakan DNA dengan
menggunakan sistem repairing. Bakteri mampu memperbaiki
kerusakan DNA dengan menggunakan sistem pembalikan
DNA secara langsung, ketika kerusakan masih dapat dikenali.
Perbaikan DNA secara langsung dengan fotoreaktivasi, akan
memperbaiki belahan dimer pirimidin dengan menggunakan
radiasi sinar ultra violet. Enzym fotoliase menyerap cahaya
biru dan menggunakan energinya untuk reaksi perbaikan
kerusakan DNA [10].
Viabilitas isolat Bacillus dengan media yang megandung
methylene blue untuk mengamati daya hidup Bacillus
tercekam atau tidak pada media yang mengandung methylene
blue yang divisualisasikan dengan pola pertumbuhan. Isolat
Bacillus dapat tumbuh dengan baik pada media yang
mengandung methylene blue 0,05 mM dan 0,1 mM (Gambar
3). Pola pertumbuhan Bacillus S1, SS19, dan DA11
cenderung lebih baik pada Methylene Blue 0,05 mM dari pada
0,1 mM.
Media pertumbuhan yang digunakan pada pengamatan
pertumbuhan Bacillus yaitu medium cair Nutrient Broth (NB)
yang telah ditambahkan methylene blue. Medium dengan
kondisi cair memungkinan seluruh bakteri kontak langsung
dengan nutrisi dan methylene blue yang ada di media dari
pada bakteri yang tumbuh pada medium padat, sehingga dapat
diketahui efek dari cekaman methylene blue terhadap pola
pertumbuhan bakteri. Berdasarkan pola pertumbuhan pada
Gambar 3 semua isolat uji menunjukkan aktivitas
pertumbuhan yang lebih baik pada konsentrasi 0,05 mM dari
pada 0,1 mM hal tersebut diasumsikan konsentrasi 0,05 mM
tidak mempengaruhi fisiologis bakteri. Bacillus merupakan
bakteri Gram positif yang memiliki struktur dinding sel yang
lebih kuat dari pada Gram negatif. Dinding sel terbentuk dari
lipopolisakarida dan peptidoglikan. Pedptidoglikan merupakan
polisakarida yang terbentuk dari derivat dua gula Nacetylglucosamine dan N-acetylmuramic acid, beberapa asam
amino, dan diaminopimelic acid (DAP). Dinding sel yang
tebal lebih toleran terhadap cekaman bahan kimia seperti
methylene blue, sehingga senyawa kimia berbahaya dapat
ditahan oleh dinding sel sebelum masuk ke dalam sel dan
memperkecil kerusakan sel [10]. Hal inilah yang
menyebabkan Bacillus mampu bertahan hidup meskipun
terdapat cekaman dari methylene blue di lingkungannya.
3
0.800
0.600
0.400
0.200
-
NB
0,05 mM
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 01 11 21 31 41 5
0,1 mM
Jam Ke-
Gambar 3. Pola Pertumbuhan Bacillus Uji pada Reaktor MFC.
IV. KESIMPULAN/RINGKASAN
Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah dilakukan,
maka kesimpulan dari penelitian ini adalah:
1. Bacillus S1, Bacillus SS19, dan Bacillus DA11 mampu
melakukan fermentasi glukosa.
2. Bacillus S1, Bacillus SS19, dan Bacillus DA11 resiten dan
viabel terhadap methylene blue dengan resitensi dan
viablitasnya pada konsentrasi 0,05 mM.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Enny
Zulaika, MP. melalui pendanaan penelitian dari PNBP ITS
tahun
anggaran
2015
sesuai
nomor
kontrak:
003246.256/IT2.11/PN.08/2015.
DAFTAR PUSTAKA
[1]
[2]
Logan, B.E.Microbial Fuel Cells.New Jersey.John Willey & Sons,
Inc.(2008).
He, Z., dan Angenent, L.T.Review Application of Bacterial Biocathodes
in Microbial Fuel Cells. Electroanalysis Vol. 18, no. 19-20 (2009) 2009
– 2015.
JURNAL SAINS DAN SENI ITS Vol. 4, No.1, (2015) 2337-3520 (2301-928X Print)
[3]
Huang, L., Regan, J.M., and Quan, X.2011. Electron transfer
mechanisms, new applications, and performance of biocathode microbial
fuel cells. Bioresource Technology Vol.102 (2011) 316–323.
[4] Zhou, M., Wang, H., Hasset, D.J., dan Gu, T.Riview: Recent advances
inmicrobial fuel cells (MFCs) and microbial electrolysis cells (MECs)
for wastewater treatment, bioenergy and bioproducts. J ChemTechnol
Biotechnol Vol.88 (2012) 508–518.
[5] Rahimnejad, A., Najafpour, G.D., Ghoreyshi, AA., Shakeri, M., dan
Zhare, H.2011. Methylene blue as electron promoters in microbial fuel
cell.International Journal of hydrogen Energy 36 (2011) 13335-13341
[6] Randy, A.2007.Pemanfaatan Membran Cangkang Telur Pada Microbial
Fuel Cells Termediasi Methylene Blue Menggunakan Kultur
Saccharomyces cerevisiae.Skripsi.Depok:Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Departermen Kimia, Universitas Indonesia.
[7] Nelson, David L & Cox, Michael M. Lehninger Principles of
Biochemistry. 4thEd. W.H. Freeman and Company. New York. (2005)
[8] Harley, J.P., dan Prescott, L.M. Laboratory Exercises in Microbiology
5th Edition. U.S.A: McGraw-Hill Publishers (2002).
[9] Holt, J.G., Krieg, N.R., Sneath, P.H.A., Staley, J.T. dan Williams, S.T.
1994.Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition.
USA: Lippincot Williams & Wilkins
[10] Madigan, M.T., Martinko, J.M., David, A.S., dan Clark, D.P.Brock
Biology of Microorganism.13th edition. New Jersey:Prentice-Hall
International, Inc.( 2012)
[11] Tuite, EM and Kelly, JM.1993.Phtochemical interactions of methylene
blue and analogues with DNA and other biological substrate.
J.Photochem. Photobiol, B: Biol. 21:103-124W.-K. Chen, Linear
Networks and Systems (Book style). Belmont, CA: Wadsworth (1993)
123–135.
4