plagiat merupakan tindakan tidak terpuji plagiat
advertisement
PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.) TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI KARAGENIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Dui Sostales NIM : 128114085 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.) TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI KARAGENIN SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Dui Sostales NIM : 128114085 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016 i PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI iii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN “Our greatest weakness lies in giving up. The most certain way to succeed is always to try just one more time” -Thomas Alva Edison- Takut akan TUHAN adalah permulaan pengetahuan, tetapi orang bodoh menghina hikmat dan didikan (Amsal 1:7) Kupersembahkan buat : Kemulian Tuhan Yesus Kristus sebagai juruselamat hidupku Kedua orang tuaku dan saudariku tercinta Para sahabat dan Almamaterku iv PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI v PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI vi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus oleh karena berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia cujete L.) terhadap Jumlah Neutrofil dan Ekspresi Siklooksigenase 2 pada Mencit Terinduksi Karagenin” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Serjana farmasi (S.Farm.) Fakultas Faramasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penyelesaiaan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun secara tidak langsung. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada : 1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 2. Bapak Enade Perdana Istyatono, Ph.D.,Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama menjalani proses perkuliahan di Fakultas Farmasi hingga saat ini. 3. Ibu drh. Sitarina Widyarini, M.P.,Ph.D., selaku Pembimbing Utama atas kesabaran dan ketabahan untuk selalu membimbing, menyemangati, membantu, dan mengarahkan selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini. 4. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Pembimbing Pendamping atas dukungan, bimbingan, dan masukan selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini. vii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5. Ibu Phebe Hendra, M.Si.,Ph.D.,Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 6. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 7. Bapak, Ibu, Kak Dea yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat, bantuan, dan kasih sayang. 8. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan semua fasilitas laboratorium yang mendukung dalam penelitian ini. 9. Staf laboratorium, Bapak Heru, Bapak Purwanto, Bapak Wagiran, Bapak Suparjiman, Bapak Kayatno, dan Bapak Lilik yang telah membantu dalam proses penelitian di laboratorium. 10. Teman-teman seperjuangan dalam penelitian : Monika, Ruri, Kathrin, Farra, Sinta, atas bantuan, kerja sama, perjuangan serta suka duka yang dialami selama penelitian. 11. Penghuni kontrakan Dangau Kamuda Diri (DKD) : Bang Egi, Om Alim, Vensi, Sambu, Iwan, serta Taufik yang selalu ada dikontrakan untuk mendukung, menyemangati, membantu dan memberi masukan kepada penulis dalam menyusun skripsi. 12. Teman-teman FSM B dan FST A 2012 atas kebersamaan, suka duka selama menempuh pendidikan di Falkutas Farmasi. 13. Teman-teman team dota : Andrew, Daniel, Aris, Gotaro, Maco, dan Rei atas saran dan mainnya selama penyusunan skripsi ini. viii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata, semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan. Yogyakarta, Januari 2016 Penulis ix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL ……………………………………………………….. i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………………… ii HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………………… iii HALAMAN PERSEMBAHAN ……………………………………………. iv SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ....................................... v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ……………………………………. vi PRAKATA …………………………………………………………………. vii DAFTAR ISI ……………………………………………………………….. x DAFTAR TABEL ………………………………………………………….. xiii DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………. xiv DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….. xvi INTISARI ………………………………………………………………….. xviii ABSTRACT ..................................................................................................... xix BAB I. PENGANTAR …………………………………………………… 1 A. Latar Belakang …………………………………………………………. 1 1. Rumusan Masalah ………………………………………………….. 5 2. Keaslian Penelitian …………………………………………………. 6 3. Manfaat Penelitian ………………………………………………….. 7 B. Tujuan Penelitian ……………………………………………………….. 8 BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………… 9 x PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI A. Tanaman Cresc3ntia cujete L. ............................................................... 9 B. Metode Penyarian ..……………………………………………………... 13 C. Kulit ......………………………………………………………………... 14 D. Inflamasi ........................………………………………………………... 16 E. Antiinflamasi ….......……………………………………………………. 20 F. Sistem Imun...........……………………………………………………... 22 G. Flavonoid .................................................................................................. 23 H. Hematoksilin dan Eosin .......................................................................... 24 I. Imunohistokimia ..................................................................................... 25 J. Karagenin ...............…………………………………………………….. 26 K. Hidrokortison ...............................……………………………………… 27 L. Landasan Teori …………………………………………………………. 27 M. Hipotesis ……………………………………………………………… 29 BAB III. METODE PENELITIAN ………………………………………… 30 A. Jenis dan Rancangan penelitian ………………………………………… 30 B. Variael dan Definisi Operasional ………………………………………. 30 C. Bahan Penelitian ……………………………………………………… 32 D. Alat Penelitian ………………………………………………………….. 33 E. Tata Cara Penelitian ……………………………………………………. 35 F. Teknik Analisis Data .....……………………………………………… 39 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………… 41 A. Hasil Determinasi Tanaman …………………………............................. 41 B. Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete……............................................ 41 xi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI C. Uji Pendahuluan ….......………………………………………………… 43 D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete......................................................................................................... 45 E. Metode pengecatan hematoksilin eosin (HE)............................................ 46 F. Metode Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 ....................... 55 G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait.............. 64 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………… 68 A. Kesimpulan ……………………………………………………………... 68 B. Saran ……………………………………………………………………. 68 DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………… 69 LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 74 BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………………. 110 xii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan ................................................................................... Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney .................... Tabel III. 49 52 Rerata ekspresi enzim COX-2 (dalam %) oleh e ekstrak etanol daun maja dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi karagenin 3%.............................................................................. 58 Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi enzim COX-2 (dalam %) masingmasing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney...................................................................................... xiii 61 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescantia cujete L...............………… 9 Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal. …………….........………… 16 Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis....... 17 Gambar 4. Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi …..... 21 Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid............................................ 23 Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam. ….... 44 Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran merah).................................. Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun maja masing-masing perlakuan dan kontrol ……… Gambar 9. 48 50 Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b). Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2....... Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan xiv 56 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran merah). …………………….............. Gambar 11. Diagram batang ekspresi enzim COX-2 masing-masing kelompok perlakuan beserta kontrol..................................... Gambar 12. 57 59 Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-κB, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL6......................................................................................... 65 Gambar 13. Daun Crescantia cujete ………………………………… 76 Gambar 14. Serbuk daun Crescantia cujete ………………………….. 76 Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescantia cujete ……….......... 76 Gambar 16. Mencit betina galur Swiss..................................................... 77 Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran.………………. 77 Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10%…………................ 77 Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak …………….......... Gambar 20. Kontrol Hidrocortisone sebagai kontrol positif..................... 78 Gambar 21. Alat spuit injeksi.................................................................... 78 xv 78 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman majapait (Crescentia cujete L).............................................................. Lampiran 2. 74 Serbuk daun Crescentia cujete beserta ekstrak etanol Crescentia cujete .................................................................... 76 Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit........... 77 Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi ………..... 78 Lampiran 5. Surat Etical Clirens ……………………………………… 79 Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin eosin (HE) .............................................................................. Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro Wilk …………….................................................................... Lampiran 8. 82 Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan KruskalWallis...................................................................................... Lampiran 9. 80 83 Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan MannWhitney................................................................................... 86 Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2....................... 94 Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2....................... 96 Lampiran 12. Hasil uji normalitas persen penekanan enzim COX-2 dengan uji Shapiro Wilk ..................................................................... xvi 98 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 13. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan Kruskal-Wallis........................................................................ 101 Lampiran 14. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan Mann Whitney ....................................................................... xvii 102 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI INTISARI Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji invitro ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan. Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah 8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2. Kata kunci: antiinflamasi, topikal, Crescentia cujete, neutrofil, siklooksigenase xviii PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI ABSTRACT Majapait (Crescentia cujete L.) is a plant that has pharmacological effect. From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete possessed anti-inflammatory. The research aims is to investigate topical antiinflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3% subcutaneously. The study was pure experimental with completely randomized design direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif control group, positif control group, Biocream® control group and group of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and 3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued by Kruskal– Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitney test with 95% confidence level. The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13. 44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2 (in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of antiinflammatory. Keywords : antiinflammatory, topical, Crescentia cujete, neutrophils, cyclooxygenase xix PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB I PENGANTAR A. LATAR BELAKANG Keanekaragaman hayati (biodiversity) yang dimiliki Indonesia, baik tumbuhan tropis dan biota lautnya, menduduki peringkat kedua di dunia setelah Brazil. Sekitar 30.000 jenis tumbuhan dan 7.000 di antaranya ditengarai memiliki khasiat sebagai obat. Kekayaan keanekaragaman hayati ini diteliti, dikembangkan dan dimanfaatkan untuk peningkatan kesehatan maupun tujuan ekonomi dengan tetap menjaga kelestariannya ( Sampurno, 2015). Tumbuhan berkhasiat obat atau herbal medicine merupakan produk obat yang berasal dari bagian akar, batang, daun, kulit batang, biji, buah dan bunga yang digunakan untuk pencegahan dan atau penyembuhan penyakit (Kamboj, 2000). Dewasa ini penggunaan obat herbal cenderung terus meningkat, baik di negara-negara berkembang maupun di negara-negara maju. Peningkatan penggunaan obat herbal ini terkait kompatibilitas yang lebih baik dengan tubuh manusia dan efek samping yang lebih rendah. Salah satu tumbuhan yang berkhasiat obat adalah tumbuhan majapait (Crescentia cujete L.) yang tumbuh subur di daerah tropis Indonesia. Tumbuhan majapait atau disebut juga dengan maja atau berenuk merupakan tanaman perdu yang termasuk dalam famili Bignoniaceae. Tumbuhan majapait sudah dimanfaatkan sebagai obat pencuci perut, pencahar dan ekspektoran. Selain itu juga digunakan sebagai obat cacing, analgesik, antiinflamasi dan obat penurun 1 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2 panas. Kayunya digunakan untuk pengobatan demam dan sakit telinga sedangkan daun digunakan untuk menurunkan tekanan darah. Tanaman ini sudah digunakan sebagai pencahar oleh masyarakat di Kosta Rika, sedangkan di Kolombia digunakan untuk penderitaan gangguan pernapasan (Khan, 2015). Konstituen fitokimia tanaman majapait dilaporkan oleh Mahbub, Hoq, Ahmed, dan Sarker (2011) terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Dalam penelitian yang dilakukan Das, Islam, Jahan, Saiful, Khan, Rafikul, dan Parvin (2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Ejelonu, Lasisi, Olaremu, dan Ejelonu (2011) juga melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoid, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin. Proses inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi. Respon tersebut penting untuk memungkinkan tubuh bertahan selama infeksi atau cedera dan mempertahankan homeostasis jaringan saat kondisi berbahaya. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan) (Corwin, 2008). Respon inflamasi biasanya disertai dengan rasa tidak nyaman, sehingga mendorong penderita untuk segera mengatasi dan mengobati inflamasi yang terjadi. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3 Setiap agen atau obat yang bekerja melawan atau menekan proses peradangan disebut antiinflamasi (Dorlan, 2002). Obat antiinflamasi dapat digunakan secara oral maupun topikal. Pada penggunaan topikal, antiinflamasi dioleskan pada daerah yang mengalami inflamasi. Penggunaan anttiinflamasi topikal semakin banyak dicari terkait keuntungan penggunaan sediaan topikal yang dapat mempercepat aksi obat ditempat kerja karena tidak melalui sistem percernaan dan menghindari rusaknya zat aktif disebabkan oleh aktifitas enzim dan interaksi dengan makanan pada terapi antiinflamasi secara oral (Ansel, 1989). Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan respon imum melalui metabolisme asam arakidonat (Widiastuti, 2011). Protein COX yang merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non Steroid (OAINS) terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 bersifat konstitutif, diekspresikan pada hampir semua jaringan untuk fisiologi normal dan homeostasis, sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulus inflamasi dan bertanggung jawab pada biosintesis PG yang terlibat pada reaksi inflamasi dan rasa nyeri (Ikawati, 2006). Sementara ini dapat disimpulkan bahwa aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan peranan penting dalam proses inflamasi. Fase seluler awal proses inflamasi ditandai dengan migrasi sel neutrofil polimorfonuklear (PMN), sel leukosit pertama, yang secara kimia tertarik ke daerah inflamasi. PMN neutrofil muncul dalam jumlah yang besar pada hari-hari pertama peradangan. Banyaknya PMN neutrofil tersebut disebabkan karena PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 4 adanya peningkatan permeabilitas vaskular dan vasodilatasi pada proses peradangan. Penghambatan migrasi sel neutrofil menjadi salah satu kunci menghambat terjadinya inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin (Rahayu, 2009). Mengingat besarnya peran sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, maka keduanya dapat dijadikan sebagai target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang berperan sebagai agen yang mempengaruhi migrasi sel neutrofil dan regulasi protein COX-2, melalui penekanan ekspresi protein COX-2. Hasil uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Aktifitas antiinflamasi pada ekstrak daun majapait diyakini berasal senyawa flavanoid serta tanin. Flavonoid seperti quercetin yang diketahui efektif dalam mengurangi peradangan akut. Adapun efek antiinflamasi dari senyawa flavonoid tertentu bekerja melalui penghambatan kuat terhadap berbagai enzim seperti proteinkinase C, protein kinase tirosin, fosfolipase A2, fosfodiesterase (Parvin et al.,2015). Kusuma, Sulistyo, Susanti, dan Sabikis (2014) melaporkan bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik dibandingkan kontrol. Flavonoid serta tanin yang terkandung pada ekstrak etanol daun majapait diduga berperan dalam penghambatan sintesis lokal dan produksi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 5 dari prostaglandin I2 vasodilatasi (prostasiklin) sehingga menyebabkan proses kontraksi luka (vasokontriksi) menjadi lebih cepat. Das et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests. Senyawa antioksidan seperti phenol dan flavonoids mengikat radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang menyebabkan penyakit degeneratif dan lainnya. Aktifitas antioksidan telah memiliki peran sangat penting dalam pengobatan penyakit akibat terpapar radikal bebas, seperti kanker, penyakit jantung, diabetes, inflamasi, penyakit degeneratif, anemia, penuaan, dan iskemia. Adanya aktifitas antiinflamasi senyawa antioksidan dari uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan peluang bagi penggunaan ekstrak etanol daun majapait secara topikal. Penelusuran mengenai mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait perlu dilakukan lebih lanjut melalui perhitungan jumlah neutrofil menggunakan metode hematoksilin dan eosin (HE) dan penekanan ekspresi protein COX-2 menggunakan metode imunohistokimia. Penelitian efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun majapait (Crescentia cujete L.) dilakukan dengan pengujian terhadap kulit punggung mencit galur Swiss yang diinduksi karagenan 3%. 1. Rumusan masalah a. Apakah ekstrak etanol daun tumbuhan Crescentia cujete L. memiliki efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss ? PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI b. 6 Bagaimana mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin 3% ? 2. Keaslian penelitian Penelitian mengenai majapait yang pernah dilakukan antara lain: a. Penelitian yang dilakaukan Mahbub et al. (2011) melaporkan kandungan kimia tanaman majapait, yaitu tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. b. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. c. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) juga melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests. Penelitian yang dilakukan Kusuma dkk. (2014) juga melaporkan bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik dibandingkan kontrol. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI d. 7 Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas antiinflamasi pada uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization. Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi COX-2 pada mencit yang diinduksi karagenin 3% melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) belum pernah dilaporkan. 3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi dan bukti ilmiah tentang penggunaan ekstrak etanol daun majapait sebagai antiinflamasi topikal melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) . b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa tumbuhan majapait merupakan bahan obat dengan aktifitas antiinflamasi, sehingga dapat mendukung penggunaan dan pengembangan tanaman majapait sebagai antiinflamasi topikal. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8 B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. 2. Tujuan Khusus a. Mengetahui efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss. b. Mengetahui mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin 3%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Crescentia cujete L. Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescentia cujete L. 1. Taksonomi tanaman Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Viridiplantae Infrakingdom : Streptophyta Divisi : Tracheophyta Sub Divisi : Spermatophytina Classs Superorder : Magnoliopsida : Asteranae Ordo : Lamiales Famili : Bignoniaceae 9 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. Genus : Crescentia Spesies : Crescentia cujete L. 10 ( Anonim, 2015). Sinonim Calabash Ayale, Calabacero, Miracle fruit, Vilayati Bel, Beggars bowl (Khan, 2015). 3. Nama daerah Sumatera : Tabu kayu (Melayu) Jawa : Berenuk (Jawa) Sulawesi : Bila balanda (Makasar), Maluku : Buah no (Ternate) Indonesia : Majapait (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012). 4. Penyebaran Crescentia cujete L. (Gambar 1.) merupakan tanaman yang banyak dijumpai di daerah tropis. Distribusikan secara luas di kawasan Karibia, Meksiko, Utara dan Selatan Amerika, Asia, Malesia dan kemudian diperkenalkan ke Afrika, dari Senegal ke Kamerun kemudian ke bagian lain dari Afrika. Pohon ini banyak ditanam di bagian utara negara Nigeria (Ejelonu et al., 2011). Tanaman ini merupakan jenis tanaman dikotil berbunga yang berasal dari Amerika Tengah dan Selatan. Tanaman ini dapat hidup dengan baik di PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 11 tempat-tempat yang terbuka dan kena sinar matahari langsung, baik di dataran rendah maupun dataran tinggi, yakni pada ketinggian 1 – 1.400 m di atas permukaan laut. Ditanam di tempat yang agak ternaung atau sedikit terlindungi pun masih dapat juga berbunga dan berbuah. Untuk mendapatkan tanaman yang sehat, media tanam atau lahan yang akan ditanami harus subur, gembur dan drainase diatur dengan baik (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012). 5. Morfologi Pohon majapait tumbuh hingga 6-10 m, daun hijau terang, panjang 5 sampai 15 cm dan lebar dan lebar 2,5-5,5 cm , bunganya mekar di malam hari, berwarna kuning atau hijau dengan merah atau ungu urat, berbentuk cangkir, dan muncul langsung dari cabang. Buah berbentuk bola (bulat) dengan diameter 12 cm sampai 30 cm, cangkang keras yang halus, mengkilat atau licin yang menggantung tepat di bawah cabang-cabang. Kulit kayu hijau keras (BTFP, 2005). Bunganya adalah bunga tunggal atau dalam berkas yang terdiri dari 2-3 bunga, yang muncul pada batang dan cabang, bertangkai, menggantung, panjang lebih kurang 5 cm, berwarna kuning kehijau-hijauan dengan urat berwarna merah. Kelopak bunga mula-mula menutup, kemudian terbelah berbentuk upih atau berbentuk 2-3 taju yang sampai pangkal tidak beraturan, panjang lebih kurang 1 cm. Tabung mahkota bunga membengkok, berbentuk lonceng, berperut dengan lipatan melintang. Benangsari berjumlah 4, dua di antaranya panjang, terdapat PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 12 sisa-sisa benang sari yang ke-5. Buahnya berbentuk bola, tertekan sedikit, licin, berwarna hijau mengkilat, kulit buah berkayu, keras, diameter 25 cm. Setiap buah berbiji banyak, bentuk biji pipih, terdapat dalam daging buah yang lumat (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012). 6. Kegunaan Semua bagian dari tanaman majapait dapat dimanfaatkan. Kayunya dapat digunakan untuk kayu bakar, gagang perkakas, tulang rusuk di perahu, bangunan dan belenggu ternak, dan labu untuk cangkir, tas dan alat musik. Buah dan daunnya dilaporkan memiliki khasiat obat (Mahbub, 2011). Daun Crescentia cujete berkhasiat sebagai obat luka baru dan daging buahnya untuk urus-urus. Untuk obat luka baru dipakai sebanyak +10 gram daun Cresentia cujete, dicuci dan diturnbuk sampai halus, ditempelkan pada bagian yang luka dan dibalut dengan kain bersih (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012). Penggunaan secara tradisional, daging buah majapait dapat digunakan untuk masalah pernapasan seperti asma dan juga digunakan sebagai pencahar. Kulit kayu digunakan untuk diare berlendir. Rebusan kulit kayu digunakan untuk membersihkan luka dan ditumbuk daun digunakan sebagai tapal untuk sakit kepala. Internal, daun digunakan sebagai diuretik dan juga digunakan untuk mengobati hematoma dan tumor. Buah rebusan digunakan untuk mengobati diare, sakit perut, dingin, bronkitis, batuk, asma, dan uretritis. Daun juga digunakan untuk hipertensi (Julia, 1968). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 7. 13 Kandungan Kimia Mahbub et al. (2011) melaporkan bahwa konstituen utama tanaman majapait terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Senyawa naphtoquinones, iridoid glycosides, aucubin, plumieride,and asperuloside telah dilaporkan sebagai konstituen dari daun tanaman ini (Das et al., 2014). Dalam penelitian yang dilakukan Das et al.(2014) juga melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Mereka melaporkan bahwa semua fraksi dan ekstrak mentah etanol kulit dan daun memiliki aktifitas antioksidan melalui tes DPPH, FRP dan TAC. Ejelonu et al. (2011) melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin. Senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai antioksidan dan melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas. B. Metode Penyarian Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut (Harbone, 1987). Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 14 kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (DepKes RI, 1986) Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000). Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil diaduk sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi kembali dengan cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna lagi, lalu dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan (DepKes RI, 1986). C. Kulit Kulit adalah suatu organ pembungkus seluruh permukaan luar tubuh, merupakan organ terberat dan terbesar dari tubuh. Seluruh kulit beratnya sekitar PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 15 16 % berat tubuh, pada orang dewasa sekitar 2,7 – 3,6 kg dan luasnya sekitar 1,5 – 1,9 meter persegi. Tebalnya kulit bervariasi mulai 0,5 mm sampai 6 mm tergantung dari letak, umur dan jenis kelamin. Kulit tipis terletak pada kelopak mata, penis, labium minus dan kulit bagian medial lengan atas. Kulit tebal terdapat pada telapak tangan, telapak kaki, punggung, bahu dan bokong (Perdanakusuma, 2007). Kulit merupakan “selimut” yang menutupi permukaan tubuh dan memiliki fungsi utama sebagai pelindung dari berbagai macam gangguan dan ransangan luar (Tranggono, 2007). Kulit menjaga bagian dalam tubuh dari gangguan fisik atau mekanik (tarikan, gesekan,dan tekanan), gangguan kimia (zat-zat kimia yang iritan), gangguan yang bersifat panas (radiasi,sinar ultraviolet) serta gangguan infeksi luar dari bakteri atau jamur. Kulit juga menjalankan fungsi absorbsi, termolegulasi, ekskresi, persepsi, pembentukan pigmen, keratinisasi, dan pembentukan vitamin D (Djuanda, 2007). Pembagian kulit secara garis besar tersusun atas tiga lapisan utama yaitu lapisan epidermis, lapisan dermis, dan lapisan subkutis (Gambar 2.). Tidak ada garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, subkutis ditandai dengan adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak Epidermis adalah lapisan luar kulit, terdiri atas stratum korneum, stratum lusidum, stratum granulosum, stratum spinosum, dan stratum basale. Lapisan dermis adalah lapisan dibawah epidermis yang jauh lebih tebal daripada epidermis. Lapisan ini mengandung pembuluh darah, akar rambut, kelenjar keringat, kelenjar minyak serta mengandung sejumlah besar ujung saraf yang berkontribusi terhadap sensasi PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 16 nyeri, suhu, gatal, dan tekanan. Subkutis adalah lapisan di bawah dermis. Tidak ada garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, Subkutis ditandai dengan adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak (Perdanakusuma, 2007). Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal (Perdanakusuma, 2007) D. Inflamasi 1. Definisi Inflamasi Inflamasi adalah respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Ketika proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemenelemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme perlindungan di mana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agenagen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaaan selama proses perbaikan jaringan (Kee dan Hayes, 1996). Respon inflamasi sering dikategorikan sesuai dengan durasi, yaitu inflamasi akut atau kronis. Inflamasi akut terjadi sebagai tanggapan langsung PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 17 terhadap trauma (cedera atau pembedahan) dengan durasi relatif singkat dari hitungan menit sampai hari. Sedangkan inflamasi kronis mencerminkan respon inflamasi yang berkelanjutan untuk kondisi jangka panjang dari hitungan hari sampai tahun (Anonim, 2015). Inflamasi akut memiliki durasi relatif singkat, yang berlangsung dari menit sampai dengan hari, dan tergantung dari keparahan cedera yang terjadi. Karakteristik utama dari peradangan akut adalah eksudasi cairan dan plasma protein (edema) dan imigrasi leukosit (terutama neutrofil). Setelah respon inflamasi akut mereda, monosit dan limfosit mendominasi di daerah cedera dan menjadi ciri dari peradangan kronis. Monosit akan bermigrasi dari darah, berdiferensiasi menjadi makrofag dalam jaringan di sisi implan. Makrofag ini akan berfusi atau menyatu menjadi sel raksasa bersama benda asing. Makrofag dan sel raksasa bersama benda asing yang menonjol pada antarmuka jaringan/implan (Black and Hastings, 1998). Adapun karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis terhadap waktu dapat dilihat pada gambar 3. Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis (Black and Hastings, 1998) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. 18 Gejala Inflamasi menghasilkan gejala-gejala berikut: (1) rasa sakit karena kerja bahan sitotoksik yang dilepaskan dari elemen-elemen humoral, selular, dan microbial pada ujung saraf; (2) pembengkakam disebabkan karena filtrasi makromolekul dan cairan ke dalam jaringan yang terpegaruh; (3 dan 4) kemerahmerahan dan panas, disebabkan karena vasodilatasi pembuluh-pembuluh dan aliran darah ke jaringan yang terpengaruh; dan (5) gangguan fungsi, disebabkan oleh perubahan pada Jaringan yang terpengaruh (Wilmana, 1995). 3. Mekanisme inflamasi Ketika jaringan terluka, kehadiran infeksi atau kerusakan akan dirasakan oleh sel tubuh, terutama makrofag termasuk juga sel-sel dendritik, sel mast, dan sel lainnya. Sel-sel ini mensekresikan molekul (sitokin dan mediator) yang menginduksi dan mengatur respon inflamasi selanjutnya. Jalur metabolisme arakidonat bertanggung jawab dalam kegiatan enzimatik untuk menghasilkan metabolit yang bertindak sebagai mediator dari banyak sisi penting dari proses inflamasi. Mediator-mediator ini yang menyebabkan vasodilatasi, emigrasi neutrofil, kemotaksis, dan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Mansjoer, 1999). Asam arakidonat dilepaskan dari fosfolipid di membran sel untuk menanggapi rangsangan, baik mekanik ataupun kimia. Pelepasan asam arakidonat oleh fosfolipase memulai serangkaian reaksi kompleks yang menyebabkan produksi dari keluarga eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin, leukotrien, dan metabolit terkait). Sintesis eicosanoid mengikuti salah satu dari PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 19 dua jalur yaitu: jalur siklooksigenase, yang berpuncak pada sintesis tromboksan A2, prostacylin (PGI2) dan prostaglandin (PGF). Dan jalur lipoksigenase, yang memuncak pada sintesis leukortrienes (LTs) dan lipoxins (LX) (Williams and Wilkins, 2011). Siklooksigenase merupakan asam lemak (COX-1 dan COX-2), yang mengaktifkan arakidonat untuk membentuk prostaglandin endoperoxide (PGG2), PGG2 secara enzimatis diubah menjadi PGH2 dan dengan bantuan oksigen radikal, PGH2 selanjutnya membentukan 3 metabolit sebagai berikut: a) Prostaglandin (PGD2, PGE2 dan PGF2-α). PGD2 dan PGE2 menyebabkan peningkatan permeabilitas vanular, vasodilatasi dan bronkodilatasi dan menghambat fungsi sel inflamasi. PGF2-α menginduksi vasodilatasi dan bronkodilatasi b) Tromboksan A2 (TXA2), dibentuk aktif dalam agregasi plateletyang menginduksi vasokonstriksi. Trombosit hanya mengepresikan COX-1, sehingga Laufer (2003) menegaskan bahwa TXA2 hanya dapat dibentuk oleh COX-1 c) Prostasiklin (PGI2), PGI2 menginduksi vasodilatasi dan bronkodilatasi dan menghambat agregasi platelet (Mohan, 2011). Enzim lipooksigenase merupakan enzim yang dominan di neutrofil, yang mengaktifkan asam arakidonat untuk membentuk asam eicosatetraenoic PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 20 hydroperoxy (5-HPETE) yang diperoksidasi lebih lanjut membentuk 2 metabolit, yaitu: a) Leukotrien (LT), leukotrien A4 (LT4) merupakan hasil enzimatik dari 5- HPETE untuk membentuk LTB4 (Kemotaktik untuk sel fagosit dan merangsang sel fagositik adhereence) dan LTC4, LTD4 dan LTE4 yang menyebabkan vasokonstriksi, bronkokonstriksi dan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah b) Lipoxins (LX), merupakan mediator antiinflamsi hasil derivat dari leukotrien (LT4) yang menghambat kemotaksis neutrofil dan adhesi ke endotelium dan dengan demikian berfungsi sebagai antagonis endogenenous leukotrien. Trombosit tidak dapat mensintesis LXA4 dan LXB4 tetapi mereka dapat membentuk mediator ini dari intermediet LTA4 yang berasal dari neutrofil yang berdekatan, oleh jalur biosintesis transelular (Mohan, 2011). E. Antiinflamasi Obat-obat antiinflamasi non-steroid, atau NSAID (Nonsteroidal antiinflammatory drugs) merupakan obat-obat yang menghambat sintesa prostaglandin, mempunyai efek analgesik dan antipiretik yang berbeda-beda tetapi terutama dipakai sebagai agen antiinflamasi untuk meredakan inflamasi dan nyeri (Kee dan Hayes, 1994). Mekanisme utama untuk efek mereka adalah penghambatan ekspresi protein yang disebut siklooksigenase. Protein COX mengkatalisis pembentukan prostanoids (termasuk PG, Prostacyclins, dan tromboksan) dari asam arakidonat. Ketika NSAID menghambat protein COX, PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 21 sintesis prostanoids akan berhenti sehinggaakan mengurangi peradangan. NSAID selektivitas akan menghambat salah satu dari dua isoform COX, COX -1 dan COX-2 sedangkan NSAID non-selektif akan menghambat COX-1 dan COX-2 (Porth, 2011). Adapun metabolisme asam arakidonat melalui jalur siklooksigenase dan lipoksigenase dan tempat aksi kerja obat kortikosteroid dan obat-obat antiinflamasi non-steroid dapat dilihat pada gambar 4. Gambar 4.` Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi (Porth, 2011). Kortikosteroid menghambat aktifitas fosfolipase A2, yang mengurangi pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat pembentukan prostaglandin, tromboksan dan leukotrien. Steroid anti-inflamasi menghambat fosfolipase A2 secara tidak langsung dengan pelepasan protein penghambatan, yaitu lipocortin-1. Protein ini merupakan anggota dari superfamili protein yang akan mengikat kalsium dan fosfolipid anionik. Rekombinan PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 22 lipocortin-1 ini akan mencegah pelepasan eikosanoid dari paru-paru dan merupakan agen anti-inflamasi yang kuat (Vane, 1996). F. Sistem Imun Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh manusia melalui interaksi yang kompleks pada tingkat molekul, sel, dan jaringan baik lokal dan sistemik. Sistem imun hanya dapat diaktifkan oleh antigen, baik molekul dan ataupun organisme, sehingga menimbulkan respon imun. Sistem imun terdiri atas sistem imun alamiah atau non-spesifik (natural/innate/native) dan didapat atau spesifik (adaptive/acquired) (Bhagavan, 2011). Sistem imun non-spesifik (sudah ada sejak lahir) merupakan suatu respon cepat yang efektif terhadap serangan patogen dan zat asing. Respon imun yang diperlihatkan selalu respon yang sama. Mekanisme sistem imun non-spesifik bisa melalaui fagositosis yang menyerang partikel asing oleh sel-sel sistem kekebalan tubuh (makrofag dan granulosit) dan inflamasi yang berkerja untuk memulihkan jaringan yang rusak yang ditandai dengan peningkatan aliran darah, peningkatan permeabilitas kapiler, dan melarikan diri dari cairan dan sel-sel dari kapiler membesar ke dalam ruang jaringan (Kent, 2000). Sistem imun spesifik meliputi sel dan protein dalam darah dan getah bening yang menyerang, menghancurkan, dan mengeluarkan dari tubuh. Respon yang ditimbulkan terbilang lambat dan hanya efektif melawan patogen yang spesifik. Respon yang cepat bila terjadi infeksi berulang dengan patogen yang sama (fenomena yang disebut memori imunologi) (Kent, 2000). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 23 Neutrofil adalah sel fagosit yang menjaga kulit dan selaput lendir. Fungsinya melindungi terhadap antigen yang dirasakan, bermigrasi pada tempat infeksi serta menghancurkan antigennya. Neutrofil beredar dalam darah selama sekitar 6-10 jam tapi bisa tetap dalam jaringan dalam keadaan tidak aktif selama 2-6 hari. Migrasi neutrofil dalam inflamasi akut disertai dengan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Bhagavan, 2011). G. Flavonoid Senyawa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6. Kerangka flavonoid terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin aromatik B, dan cincin tengah berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya (Redha, 2010). Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi karbon di sekitar molekul flavonoid dapat dilihat pada gambar 5. Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid (Redha, 2010) Senyawa flavonoid adalah senyawa fenol terbesar yang terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah,ungu, dan biru dan sebagian zat kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoids PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 24 dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan dan mempunyai bioktifitas sebagai obat. Manfaat flavonoids antara lain adalaha untuk melindungi stuktur sel, meningkatkan efektifitas vitamin C, antiinflamasi, mencegah keropos tulang dan sebagai antibiotik (Rathee, 2009). Jaringan dan sel didalam tubuh akan mengalami kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas dari aktifitas RSO (reactive oxygen species) yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Meningkatnya produksi ROS dapat memicu kerusakan pada jaringan sehingga akan memperparah proses inflamasi. Senyawa flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah (Gomes, 2008). Mekanisme lain flavonoid dalam menghambat terjadinya radang yaitu melalui dua cara, yang pertama menghambat pelepasan asam arakidonat dan sekresi enzim lisosom dari sel neutrofil dan sel endotelial, dan yang kedua menghambat fase proliferasi dan fase eksudasi dari proses radang. Terhambatnya pelepasan asam arakidonat dari sel radang akan menyebabkan kurang tersedianya substrat arakidonat bagi jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin, prostasiklin, endoperoksida, tromboksan di satu sisi dan asam hidroperoksida, asam hidroksieikosatetraienoat, leukotrien di sisi lainnya (Rahayu, 2009). H. Hematoksilin dan Eosin Pewarnaan hematoksilin dan eosin merupakan metode pewarnaan yang banyak digunakan dalam pewarnaan jaringan sehingga banyak digunakan dalam PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 25 diagnosa medis dan penelitian. Jaringan yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin akan menunjukkan sitoplasma berwarna merah jambu-jingga dan nukleus berwarna gelap, biru atau ungu. Hematoksilin merupakan ekstrak dari pohon logwood (Haematoxylum campechianum) yang digunakan sebagai bahan pewarna pada pewarnaan histoteknik (Junquera, 2007). Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur basofilik jaringan. Produk oksidasi hematoksilin berupa hematin bertindak sebagai bahan aktif dalam larutan pewarnaan. Hematin akan membentuk kompleks berwarna sangat kuat dengan ion logam tertentu, yang paling menonjol adalah garam Fe (III) dan Al (III). Kompleks logam-haematein digunakan untuk mewarnai inti sel sebelum diperiksa di bawah mikroskop. Hematoksilin menandai inti dan struktur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Eosin yang bersifat asam akan mewarnai komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda (IHC World, 2015). I. Imunohistokimia Imunohistokimia merupakan metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya protein atau antigen tertentu dalam sel menggunakan antibodi spesifik (IHC, 2015). Imunohistokimia menggabungkan teknik anatomi, imunologi dan biokimia yang memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam jaringan yang tepat sehingga dapat dilihat di bawah mikroskop (Taylor, 2015). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 26 Tahapan metode imunohistokimia terdiri atas empat tahap yaitu (1) penanaman sel, (2) fiksasi dan perwarnaan dengan antibodi, (3) visualisasi sel dengan mikroskop, dan (4) analisis ekspresi protein yang telah divisualisasikan. Tahapan fiksasi menggunakan pelarut organik seperti alkohol dan aseton untuk melepaskan lipid, mendehifrasi sel,dan mengendapkan protein (The Human Protein Atlas, 2015). Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan sel yang tidak mengekspreiskan protein memberikan warna ungu/biru. Sel yang mengekspresikan protein tertentu dari keseluruhan sel dinyatakan dalam satuan persen (%) (Ikawati, 2006). J. Karagenin Iritan yang digunakan untuk pengujian efek antiinflamasi beraga jenisnya, satu diantaranya adalah karagenin. Karagenin merupakan polisakarida hasil ekstraksi rumput laut dari famili Eucheuma, Chondrus, dan Gigartina. Bentuknya berupa serbuk berwarna putih hingga kuning kecoklatan, ada yang berbentuk butiran kasar hingga serbuk halus, tidak 24 berbau, serta memberi rasa berlendir di lidah. Karagenin juga memiliki sifat larut dalam air bersuhu 80ºC (Rowe et all., 2009). Karagenan terdiri dari tiga tipe, yaitu kappa (κ), lambda (α), dan iota (ι), yang diekstrak dari rumput laut merah. Mereka terutama diambil dari spesies Gigartina dan Chondrus crispus, yang menghasilkan tipe kappa dan labda dan spesies Eucheuma cottonii dan spinosum, yang menghasilkan kappa dan iota jenis. Setiap jenis karagenan memiliki karakteristik tersendiri, meliputi kekuatan gel, viskositas, stabilitas suhu, sinergisme, dan kelarutannya (Soma et. all, 2013). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 27 Karagenin berperan dalam pembentukan edema dalam model inflamasi akut. Karagenin dipilih karena dapat menstimulasi pelepasan prostaglandin setelah disuntikkan ke hewan uji. Oleh karena itu, karagenin dapat digunakan sebagai iritan dalam metode uji yang bertujuan untuk mencari obat-obat antiinflamasi, tepatnya yang bekerja dengan menghambat sintesis prostaglandin (Winter et all., 1962). K. Hidrokortison Hidrokortison merupankan anti inflamasi steroid yang secara dramatis menurunkan manifetasi dari inflamasi. Hidrokortison menghambat manifestasi awan dan akhir inflamasi,yaitu tidak hanya tanda-tanda radang (kemerahan, panas, sakit, edema, dan gangguan fungsi), tetapi juga stadium lebih lanjut penyembuhan luka dan perbaikan dan reaksi proliferasi yang terlihat pada inflamasi kronis. Hidrokortison mempengaruhi semua tipe reaksi inflamasi yang disebabkan baik oleh invasi patogen, rangsangan kimia atau fisik, ataupun oleh respon immun yang tidak tepat seperti terlihat pada hipersensitivitas atau penyakit autoimmun (Tjay, 2007). L. Landasan Teori Inflamasi merupakan respons protektif setempat yang ditimbulkan oleh cedera atau kerusakan jaringan. Respon yang muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri), dan tumor (pembengkakan). Penyebab inflamasi antara lain mikroorganisme, trauma mekanis, zat-zat kimia, dan pengaruh fisika. Selama proses inflamasi terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemen-elemen PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 28 darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Metabolisme asam arakidonat bertangung jawab sebagai substrat Prostaglandin dan utama dalam tromboksan produksi dihasilkan mediator-mediator melalui jalur inflamasi. siklooksgenase. Leukotriene, lipoksin, dan komponen penginduksi inflamasi lainnya dihasilkan melalui jalur lipooksigenase. Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan respon imum melalui metabolisme asam arakidonat. Respon imun berupa migrasi sel neotrofil ke daerah inflamasi merupakan fase seluler awal proses inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin. Tanaman majapait merupakan salah satu tanaman yang memiliki efek terapetik dengan kandungan kimia didalamnya teriidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Pendekatan penelitian ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) yang melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests. Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) juga melaporkan bahwa hasil uji invitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Adanya aktifitas antiinflamasi dari PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI pemberian ekstrak daun majapait secara in-vitro, diduga juga 29 akan memperlihatkan adanya efek antiinflamasi apabila diberikan secara topikal. Kandungan flavonoid pada daun majapait diduga bertanggung jawab dalam memberi efek antiinflamasi. Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah akibat aktifitas radikal bebas dari RSO yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Flavonoid juga menghambat pelepasan asam arakidonat dari sel radang sehingga menyebabkan berkurangnya ketersedian substrat arakidonat, baik jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, untuk membentuk mediator inflamasi. Sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, keduanya merupakan target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang berperan sebagai agen antiinflamasi. Pengujian terhadap efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait dilakukan melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3%. Migrasi sel neutrofil dapat dideteksi dengan menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) untuk melihat penghambatan migrasi sel neutrofil. Pengukuran ekspresi protein COX-2 dapat dilakukan dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 untuk melihat penekanan ekspresi COX-2. M. Hipotesis Ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. memberikan efek antiinflamasi topikal dengan berkurangnya migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada kulit punggung mencit diinduksi karagenin 3%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss diinduksi karagenan merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola searah. B. Variabel Penelitian dan Definifi Operasional 1. Variabel Penelitian a. Variabel utama 1) Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. 2) Variabel tergantung : a) Jumlah sel-sel neutrofil yang bermigrasi b) Penekanan ekspresi siklooksigenase-2 didaerah subkutan. b. Variabel pengacau 1) Variabel pengacau terkendali a) Subyek uji b) Umur : Mencit betina galur Swiss : 6 – 8 minggu (2-3 bulan) c) Berat badan : 20-30 gram d) Keadaan subyek : Sehat 2) Variabel pengacau tidak terkendali yang digunakan dalam penelitian. 30 : kondisi patofisiologis mencit PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 2. 31 Definisis oprasional a. Inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan). b. Migrasi Neutrofil merupakan sel leukosit yang bermigrasi dari pembuluh darah ke daerah subkutan (punggung mencit) dalam 3 bentuk berbeda yaitu, berinti satu, berinti dua dan beriti ladam kuda pada pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%. c. Ekspresi COX-2 merupakan ekspresi COX-2 oleh sel neutrofil yang berwarna coklat/gelap pada daerah subkutan jaringan kulit mencit selama pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%. d. Daun Crescentia cujete yang digunakan merupakan daun yang berwarna hijau segar, tidak berlubang, serta tidak terdapat kotoran dari binatang kecil yang didapat dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta. e. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan hasil ekstraksi simplisia daun Crescentia cujete seberat 15 gram yang dimaserasi pada 100 mL etanol 70% selama dua hari. Kemudian diremaserasi dalam jumlah pelarut yang sama selama satu hari, disaring dengan kertas saring, dan dipekatkan pada waterbath hingga menjadi ekstrak kental. f. Konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan berat ekstrak kental etanol daun Crescentia cujete (gram) dalam basis (gram) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 32 dengan satuan b/b. Konsentrasi ekstrak kental daun Crescentia cujete yang digunakan adalah 1,67; 2,5; dan 3,75 %. g. Efek antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete adalah kemampuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete untuk mengurangi migrasi sel-sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada daerah subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3 %. h. Injeksi subkutan merupakan injeksi yang dilakukan pada jaringan di bawah kulit pada punggung mencit yang sudah dicukur rambutnya terlebih dahulu. i. Pemberian topikal ekstrak daun Crescentia cujete dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang menutupi area seluas 2,25 cm2 (1,5 cm x 1,5 cm) pada kulit punggung kulit mencit yang telah diinduksi karagenin 3% secara subkutan. C. Bahan penelitian Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : 1. Hewan uji pada penelitian ini mengunakan mencit betina galur Swiss yang berumur sekitar 6 – 8 minggu (2-3 bulan) dengan bobot sekitar 20- 30 gram dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Imuno Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Prosedur penelitian ini telah memperoleh kelayakan etik dari Ministry of Nasional Education Faculty of PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 33 Medicine dan Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC) dengan nomor KE/61/05/2015. 2. Bahan uji daun majapait diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta. 3. Karagenin tipe I (Sigma Chemical co.) sebagai inflamatogen diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta. 4. Etanol 70% diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70, Ngampilan, Yogyakarta 5. NaCl 0,9% teknis sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta. 6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70, Ngampilan, Yogyakarta. 7. Biocream® diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta. 8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison Asetat 2.5% diproduksi oleh Galenium, diperoleh dari dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta. 9. Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser, diperoleh dari Alfamart Paingan Sleman. D. Alat atau Instrument Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 1. Alat Ekstraksi a) Oven b) Mesin Penyerbuk c) Ayakan no. 40 d) Alat-alat Gelas ( Labu ukur, gelas beker, erlemeyer, gelas ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk dan gelas arloji) 2. 3. 34 Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain a) Neraca analitik b) Gunting c) Gelas arloji d) Stopwatch e) Spuit injeksi 1 mL f) Stopwatch g) Mikroskop cahaya Olympus CX21 h) Jangka sorong digital i) Mortir dan Stamper Alat dan bahan yang digunakan pemotongan organ kulit a) Formalin 10% b) Karton c) Gunting bedah d) Container e) Pinset f) Papan lilin dan pines PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 35 E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman Crescentia cujete dengan cara mencocokkan ciriciri makroskopik yang terdapat pada tanaman yang dilakukan secara benar menurut Steenis (1992) di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Pengumpulan Bahan Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Daun Crescentia cujete didapat dari warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta dan dipanen serta dikumpulkan. Daun yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau, segar, tidak berlubang dan tidak terdapat kotoran binatang. 3. Pembuatan Simplisia Pembuatan simplisia daun Crescentia cujete diawali dengan mencuci bersih daun majapait yang telah dipanen menggunakan air mengalir dan ditiriskan untuk meniadakan airnya. Kemudian dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 30-45 derajat celcius hingga benar-benar kering ditandai dengan warna daun hijau kecoklatan dan mudah dihancurkan. Selanjutnya daun diserbuk dengan mesin penyerbuk. Serbuk yang diperoleh diayak menggunakan ayakan nomor 40. 4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete Ekstraksi etanol daun Crescentia cujete dilakukan dengan mengambil 15 gram serbuk kering daun Crescentia cujete direndam dengan 100 mL etanol PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 36 70% pada erlemeyer bersumbat. Ekstraksi dilakukan secara maserasi selama 2 hari terlindungi dari cahaya pada temperatur kamar di atas shaker mekanik. Setelah 2 hari, hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dan endapannya. Kemudian ampasnya diremaserasi dengan melarutkanya kembali dalam jumlah dan volume pelarut yang sama selama 1 hari. Kemudian disaring untuk mendapatkan filtrat. Hasil filtrat maserasi dan remaserasi disatukan. Selanjutnya pelarut ekstrak diuapkan menggunakan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental dengan bobot yang tetap. 5. Pembuatan Krim Ekstrak Daun Crescentia cujete Konsentrasi krim ekstrak etanol daum majapait ditentukan bedasarkan konsentrasi zat aktif hidrokortison asetat 2,5 % sebagai kontrol positif. Konsentrasi tersebut dijadikan konsentrasi tengah (konsentrasi ke-2) untuk sediaan krim ekstrak etanol daun Crescentia cujete. Konsentrasi pertama diturunkan 1,5 kalinya dan konsentrasi ke-3 dinaikan 1,5 kalinya. Maka didapat tiga konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete dalam krim yaitu 1,67; 2,5; dan 3,75 % b/b. Pembuatan krim ekstrak etanol daun Crescentia cujete dengan menimbang ekstrak etanol daun Crescentia cujete seberat 0,167; 0,25; dan 0,375 g yang dilarutkan dalam 10 g basis Biocream®. 6. Penyiapan Hewan Uji Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 33 ekor mencit betina galur Swiss, berumur 2-3 bulan, dengan bobot 20-30 gram. Hewan uji dibagi secara acak menjadi 2 kelompok. Kelompok untuk pra-pelakuan sebanyak 3 ekor mencit PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 37 dan kelompok perlakuan sebanyak 30 ekor mencit. Kelompok perlakuan terdiri dari enam kelompok yang masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Hewan uji terlebih dahulu dicukur bulu punggungnya dengan gunting, kemudian dioleskan Veet® untuk merontokkan bulu yang belum tercukur sempurna. Kulit punggung yang telah dicukur bulunya dibiarkan selama 1 hari untuk menghindari adanya inflamasi yang disebabkan oleh pencukuran dan pemberian Veet®. 7. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkan konsentrasi karagenin optimal yang akan digunakan sebelum peneliti melakukan uji efek antiinflamasi topikal. Konsentrasi karagenin 1,5; 2 dan 3% dibuat dengan menimbang masing-masing karagenin sebanyak 1,5; 2; dan 3g karagenin dan melarutkanya dengan larutan fisiologis NaCl 0,9% dalam gelas beker yang kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan larutan NaCl 0,9% hingga batas tanda. Tiga ekor mencit yang digunakan dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan konsentrasi karagenin, yaitu karagenin 1,5; 2; dan 3% masingmasing kelompok diinjeksi sebanyak 0,1 mL secara subkutan pada kulit punggung mencit yang telah dicukur bulunya. Tebal lipat kulit diukur setelah pemberian karagenin setiap 1 jam selama 6 jam. Kelompok karagenin yang dipilih, apabila edema yang timbul menunjukkan penebalan lipatan kulit sebesar 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal . PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 8. 38 Pembuatan larutan Karagenin Karagenin 3% dibuat dengan melarutkan 3 g karagenin dalam larutan NaCl 0,9% hingga 100 mL sehingga diperoleh larutan Karagenin 3% b/v. 9. Pengujian Ekstrak Etanol daun Crescentia cujete Sebanyak 30 ekor mencit betina dibagi secara acak menjadi enam kelompok perlakuan : a. Kelompok 1 Terdiri dari lima ekor mencit sebagai kontrol negatif (karagenin). Mencit diinjeksi karagenin dengan konsentrasi 3% secara subkutan. b. Kelompok 2,3,4, 5, dan 6 Masing-masing terdiri dari lima ekor mencit sebagai perlakuan Biocream®, Hidrokortison, dan ekstrak etanol daun Crescentia cujete 1,67%; 2,5%; dan 3,75% b/b. Ekstrak Seberat 1,67; 2,5; dan 3,75 gram masing-masing dicampur dengan basis krim (Biocream®) seberat 10 gram sehingga didapat konsentrasi 1,67; 2,5%; 3,75% b/b. Mencit terlebih dahulu diinjeksi karagenin dengan kosentrasi 3% secara subkutan. Selanjutnya Biocream®, Hidrokortison, dan masing-masing konsentrasi ekstrak dalam basis krim diambil sebanyak 0,1 gram untuk dioleskan seluas 2,25 cm2 disekitar suntikan segera setelah injeksi karagenin 3%. 10. Pengambilan bagian kulit punggung mencit untuk data histopatologi Dua puluh empat jam setelah diinjeksi karagenin 3% mencit dikorbankan dengan cara dislokasi tulang leher mencit dan dilakukan pengambilan kulit PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 39 punggung mencit dengan cara dibedah yang dilakukan dipapan bedah. Area pengambilan kulit disekitar daerah injeksi subkutan dengan ukuran 1 x 1cm. Hasil pemotongan jaringan kulit diletakkan di container yang telah berisi larutan fiksatif yaitu formalin 10% hingga potongan kulit terendam sempurna yang kemudian dibawa ke bagian Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada untuk pembuatan preparat histologi. Pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dikerjakan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RS Dr. Sardjito, Yogyakarta. Hasil pengecatan dianalisis di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada. F. 1. Teknik Analisis Data Analisis hasil dilakukan dengan menghitung jumlah sel neutrofil yang bermigrasi dan sel yang mengekspresikan COX-2 pada daerah subkutan jaringan kulit punggung mencit pada 5 sudut pandang yang berbeda di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x. 2. Nilai persentase ekspresi COX-2 masing-masing perlakuan dihitung dengan persamaan: (Ikawati, 2006) PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 3. 40 Menghitung persentase penekanan ekspresi COX-2 (Ikawati, 2006) 4. Data yang diperoleh terlebih dahulu dianalisis secara statistik dengan Shapiro-Wilk untuk melihat kenormalan dan homogenitas distribusi data. Data yang terdistribusi dengan normal dan homogenitas sama dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA (taraf kepercayaan 95%) karena skala variabel penelitian adalah skala numerik, data tidak berpasangan dan lebih dari dua kelompok. Analisis dilanjutkan dengan Post Hoc Test dengan Scheffe tes. Namun jika syarat uji One Way ANOVA tidak dapat dipenuhi maka digunakan uji alternatif non-parametrik Kruskal Wallis. Apabila uji Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05) maka dilanjutkan dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Tanaman majapait yang digunakan pada penelitian efek antiinflamasi topikal diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta. Tanaman majapait selanjutnya dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan tujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan peneliti. Bagian tanaman majapait yang digunakan peneliti untuk determinasi yaitu batang, daun, bunga dan buah. Hasil determinasi berdasarkan buku acuan menurut Steenis (1992) menunjukan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar tanaman Crescentia cujete L. yang dikenal dengan nama tanaman majapait atau berenuk (Lampiran 1). B. Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete Ekstrak etanol daun Crescentia cujete diperoleh dari penyarian serbuk simplisia daun Crescentia cujete secara maserasi. Daun majapait yang telah kering sempurna diserbuk mengunakan mesin penyerbuk. Penyerbukan bertujuan untuk memperluas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut sehingga mempermudah penyarian kandungan fitokimia dari daun majapait. Serbuk daun majapait ditimbang seberat 15 gram dan ditambahkan 100 mL etanol 70% pada Erlenmeyer bersumbat selama dua hari di atas shaker mekanik. Perendaman dilakukan bertujuan untuk menarik senyawa kimia yang 41 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 42 terkandung dalam serbuk agar larut dalam cairan penyarinya. Prinsipnya, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000). Untuk mempercepat kesetimbangan larutan di dalam dan di luar sel, dilakukan pengadukan yang kostan dengan bantuan mechanical shaker sehingga proses ekstraksi hanya memakan waktu dua hari kerja. Selanjutnya dilakukan proses remaserasi untuk mengoptimalkan penarikan senyawa kimia yang terkandung dalam serbuk daun majapait dengan menggunakan pelarut baru karena pelarut pertama sudah jenuh sehingga tidak dapat melarutkan semua senyawa kimia tersebut. Hasil filtrat maserasi dan remaserasi disatukan dan selanjutnya diuapkan di atas waterbath menggunakan cawan porselin pada suhu 50-600C hingga bobotnya tetap sehingga didapatkan ekstrak kental. Hasil ekstrak kental yang didapatkan yaitu seberat 2,2 gram ekstrak kental, sudah tidak dapat dituang lagi, dan tidak berbau etanol. Ekstrak kental yang diperoleh dengan rendemen sebesar 14,67% digunakan untuk pengujian antiinflamasi dalam penelitian ini. Pemilihan metode penyarian secara maserasi karena mempunyai keuntungan dari metode penyarian lainnya. Prosedur dan peralatan yang digunakan pada metode penyarian ini sederhana dan murah, pelarut yang digunakan juga terbatas (Walton, 1999). Metode maserasi juga dapat menurunkan resiko terurainya bahan alam karena pemanasan, mengingat kandungan bahan alam dari daun majapait tidak diketahui secara pasti tahan panas atau tidak. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 43 Metode ini dirasa cukup aman untuk dilakukan tanpa harus khawatir rusaknya bahan alam, khususnya yang mempunyai aktivitas antiinflamasi. C. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkan konsentrasi karagenin optimal yang akan digunakan sebelum peneliti melakukan uji efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait. Karagenin bertindak sebagai agen penginduksi inflamasi yang diinjeksikan secara subkutan pada kulit punggung mencit. Parameter yang dilihat dari uji pendahuluan yaitu tebal lipat kulit (udema) punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin. Uji pendahuluan dimulai dengan melakukan orientasi penetapan konsentrasi karagenin. Konsentrasi karagenin yang digunakan dalam orientasi ini adalah karagenin 1,5; 2; dan 3% yang dibagi menjadi tiga kelompok. Setelah diinjeksikan dengan karagenin, mencit diamati dengan mengukur tebal lipat kulit punggung mencit menggunakan jangka sorong digital setiap satu jam sekali selama enam jam. Konsentrasi karagenin dikatakan optimal bila menunjukkan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit sekitar 2-3 kali dari tebal lipat kulit pada awalnya, sehingga konsentrasi tersebut yang dipilih menjadi konsentrasi karagenin penginduksi inflamasi. Pada uji pendahuluan efek antiinflamasi topikal ekstrak daun majapait pada kulit punggung mencit diinduksi karagenin menunjukkan adanya edema pada setiap jamnya selama enam jam yang dibuktikan dengan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit (gambar 6). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Karagenin 1,5% 4 Karagenin 2% 44 Karagenin 3% Edema (mm) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1 2 3 4 5 6 waktu (jam) Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam Pada kelompok perlakuan konsentrasi karagenin 1,5 % peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 1,17 kali. Pada konsentrasi karagenin 2% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 2,31 kali. Dan pada konsentrasi karagenin 3% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 4,52 kali. Dari hasil pengukuran menunjukan bahwa konsentrasi karagenin 1% belum memperlihatkan peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal. Pada konsentrasi karagenin 2% sudah menunjukan peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal, tetapi edema ysng terbentuk terdapat gelembung berisi cairan dan edema yang terbentuk tidak bertahan selama enam jam pengamatan. Konsentrasi karagenin yang digunakan sebagai penginduksi inflamasi pada penelitian ini adalah konsentrasi karagenin 3% karena pada konsentrasi karagenin 3% sudah menunjukan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit pada jam pertama yaitu lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal dan masih menunjukan edema lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal selama enam jam pengamatan. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 45 D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk menguji efek antiinflamasi dan mekanisme efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait. Ekstrak kental daun majapait dibuat dalam bentuk sediaan krim. Sediaan krim dipilih karena mempunyai keuntungan yaitu sederhana dalam pembuatannya, mudah dalam penggunaan dan penyebarannya pada kulit juga mudah, serta memberikan rasa dingin pada kulit (Depkes RI, 1995). Pembuatan krim ekstrak daun majapait menggunakan Biocream® sebagai basisnya sehingga dapat diaplikasikan secara topikal pada kulit punggung mencit. Pencukuran rambut pada bagian punggung mencit bertujuan untuk membersihkan tempat aplikasi (tidak terdapat rambut halus) agar mempermudah pembedahan kulit mencit. Setelah pencukuran mencit didiamkan selama satu hari yang betujuan untuk menghindari iritasi yang disebabkan selama proses pencukuran sehingga saat diinjeksikan dengan karagenin 3% secara subkutan, reaksi inflamasi yang terjadi murni disebabkan oleh induksi karagenin 3%. Penelitian efek antiinflamasi topikal ekstrak daun majapait menggunakan tiga konsentrasi berturut-turut, yaitu konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75 %. Pembuatan tiga seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada setiap seri konsentrasi tersebut menunjukan adanya efek antiinflamasi topikal yang berbeda dan untuk mengetahui masing-masing perbandingan khasiat dari ekstrak etanol daun majapait terhadap kontolnya sebagai antiinflamasi topikal. Inflamasi yang terbentuk dilihat dari jumlah sel-sel neutrofil yang bermigrasi dan peningkatan ekspresi protein siklooksigenase-2 di daerah PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 46 subkutan. Dan efek antiinflamasi ditunjukkan melalui penurunan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan dan penekanan ekspresi siklooksigenase-2 pada daerah subkutan. Pengujian efek antiinflamasi yang digunakan dalam penelitian ini mengunakan metode uji pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 pada jaringan subkutan kulit punggung mencit secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah diinduksi dengan karagenin 3%. Hasil pengecatan diamati di bawah mikroskop binokuler (Olympus®) untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali. E. Metode Pengecatan Hematoksilin dan Eosin (HE) Pengujian dengan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) bertujuan untuk memberikan gambaran kemampuan ekstrak etanol daun majapait dalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan. Hematoksilin dan eosin merupakan teknik pewarnaan yang berdasarkan pada prinsip asam basa. Sifat basa pada larutan hematoksilin akan memungkinkan hematoksilin berikatan terutama dengan komponen sel yang bersifat asam. Kita dapat mengamati bahwa warna biru yang ditimbulkan hematoksilin akan banyak ditemukan pada nukleus. Hal ini terjadi karena nukleus mengandung DNA dan RNA, suatu zat yang bersifat asam. Sementara itu, eosin akan mengikat komponen sel yang bersifat asam. Kita dapat menemukan cukup banyak komponen sel yang bersifat asidofilik seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen pada sitoplasma sel (IHC World, 2015). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 47 Metode ini diawali dengan membedah kulit punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin 3% serta pemberian perlakuan pada pengamatan selama 24 jam. Bagian kulit yang diambil diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Pengawetan bertujuan untuk mengawetkan morfologi sel dan jaringan sesuai dengan kondisi pada saat hewan uji masih dalam keadaan hidup. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung (direct counting) dengan mikroskop binokuler (Olympus®) untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali. Sel neutrofil merupakan sel darah putih pertama yang bermigrasi dari pembuluh ke daerah cedera yang dijumpai pada waktu tingkat akut atau fase awal inflamasi. Sel neutrofil ditarik ke daerah inflamasi oleh faktok kemotaktik, yang dihasilkan oleh bakteri, produk perombakan jaringan, faktor komplemen aktif dan faktor lainnya (Tambayong, 2000). Neutrofil disebut juga sebagai polimorfonuklear (PMN), karena intinya memiliki berbagai jenis bentuk dan bersegmen. Neutrofil matang atau dewasa yang berada dalam peredaran darah perifer memiliki bentuk inti yang terdiri dari dua sampai lima segmen, sedangkan neutrofil yang belum matang (neutrofil band) akan memiliki bentuk inti seperti ladam kuda (Schmeltzer and Norsworthy, 2012). Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama, kemudian digantikan oleh monosit setelah 24 jam sampai 48 jam (Kumar, dkk., 2005). Profil pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) antar kelompok perlakuan beserta kontrol dapat dilihat pada gambar 7 dan tabel I. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 48 Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran merah) Keterangan : 1. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali 2. Kulit normal dengan perbesaran 400 kali 3. Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali 4. Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 400 kali 5. Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5% dengan perbesaran 100 kali 6. Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5% dengan perbesaran 400 kali PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 49 Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan Kelompok Perlakuan Perlakuan Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE I II III IV Kontrol negatif Kontrol Biocream® Kontrol positif Ekstrak etanol daun majapait 1,67% Ekstrak etanol daun majapait 2,5% Ekstrak etanol daun majapait 3,75% 111,36 ± 6,98 109,32 ± 13,26 67,68 ± 7,50 31,20 ± 1,56 V VI 26,36 ± 1,71 16,76 ± 3,11 Berdasarkan tabel I, menunjukan bahwa pada kelompok kontrol negatif (injeksi karagenin 3%) dan kelompok Biocream® (basis) menghasilkan rerata jumlah sel neutrofil yang paling besar dibandingkan dengan kelompok perlakuan lainya yaitu 111,36 ± 6,98dan 109,32 ± 13,26. Hal tersebut menunjukan bahwa karagenin menyebabkan inflamasi. Inflamasi yang diinduksi oleh karagenin dapat digunakan sebagai model peradangan akut. Pada penelitian ini digunakan tipe κkaragenin yang merupakan polisakarida sulfat yang dapat menginduksi respon inflamasi dengan mengaktifkan respon imun. Adapun migrasi sel neutrofil merupakan respon dari inflamasi akut (Wade, 2014). Penurunan migrasi sel neutrofil paling besar ditunjukan pada kelompok perlakuan ekstrak etanol 3,75% dengan rerata jumlah sel neutrofil sebesar 16,76 ± 3,11. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5%, kelompok perlakuan ekstrak etanol 1,67%, dan kelompok kontrol positif dengan rerata jumlah sel neutrofil sebesar 26,36 ± 1,71; 31,20 ± 1,56; dan 67,68 ± 7,50. Hasil ini menunjukkan bahwa kelompok kontrol positif dan masing-masing kelompok PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 50 ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi yang dibuktikan dari penurunan migrasi sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan dibandingkan dengan kontor negatif karagenin 3 % dan kontrol Biocream®. Profil rerata jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada gambar 8. Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait masing-masing perlakuan dan kontrol Profil kurva kontrol negatif dan kontrol Biocream® memiliki migrasi jumlah neutrofil pada daerah subkutan paling besar dibanding dengan kelompok lainnya. Hal ini menunjukan bahwa karagenin merupakan zat inflamatogen yang dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel neutrofil di daerah subkutan. Dan basis yang digunakan untuk ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 51 menurunkan migrasi sel neutrofil yang ditunjukan dari profil garis kurvanya hampir mirip dengan garis kurva kontrol negatif. Kontrol positif pada penelitian ini mengunakan Hidrokortison asetat 2,5%. Hidrokortison merupakan antiinflamasi steroid yang secara dramatis menurunkan manifetasi dari inflamasi. Kortikosteroid menghambat aktivitas fosfolipase A2, yang mengurangi pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat pembentukan prostaglandin, tromboksan dan leukotrien (Tjay, 2007). Efek dari antiinflamasi kortikosteroid juga mempengaruhi berbagai sel imuno kompeten seperti sel T, makrofag, sel dendritik, eosinofil, neutrofil, dan sel mast, dengan cara menghambat respon inflamasi (Sitompul, 2011). Hasil perhitungan jumlah neutrofil antar kelompok dianalisis menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk menentukan kenormalan data yang diperoleh. Uji ShapiroWilk menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p setiap kelompok lebih besar dari p=0,05. Namun hasil uji varian menunjukan nilai p=0,01 (p<0,05) sehingga diambil kesimpulan bahwa varian data tidak sama. Syarat melakukan uji Anova apabila distribusi data harus normal dan varian data harus sama (Dahlan, 2009). Pada penelitian ini, karena distribusi data normal dan varian data tidak sama sehingga uji Anova tidak dapat dilakukan. Menurut Harinaldi (2005) apabila syarat-syarat yang dibutuhkan oleh metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi, maka peneliti dapat menggunakan metode alternatif sebagai pengganti analisis varian satu arah (One way ANOVA) yaitu Kruskal-Wallis Test. Hasil statistik uji Kruskal-Wallis PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 52 memberikan nilai p=0,000 (< 0,05) yang berarti paling tidak terdapat satu kelompok yang berbeda secara signifikan dengan taraf kepercayaan 95%. Kemudian dilanjutkan uji Mann Whitney untuk melihat perbedaan bermakna atau tidak antar tiap kelompok perlakuan. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada tabel II. Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney Kelompok I II III IV V VI Rerata Sel Neutrofil ± SE 111,36 ± 6,98 109,32 ± 13,26 67,68 ± 7,50 31,20 ± 1,56 26,36 ± 1,71 16,76 ± 3,11 I TB BB BB BB BB II III IV V VI TB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB TB BB BB BB BB BB BB BB BB BB TB Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif (karagenin 3 %) II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan positif (hidrokortison 2,5 %) IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 % V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 2,5 % VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 % SE : Standar eror BB: Berbeda bermakna (p<0,05) TB: Berbeda tidak bermakna (p>0,05) Berdasarkan tabel II, menunjukan rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3% berbeda tidak bermakna dengan rerata sel neutrofil kelompok Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek antiinflamasi. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3% pada PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 53 penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator inflamasi. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% lebih besar dibandingkan kontrol positif. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% juga memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih besar dibandingkan kontrol positif. Hasil rerata sel neutrofil kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% juga lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 54 antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% lebih besar dibandingkan kontrol positif. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5%, namun menunjukan perbedaan tidak bermakna secara statistik (p>0,05). Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5%. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% menunjukan perbedaan yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%. Hal ini berarti bahwa efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait 3, 75% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% memiliki rerata sel neutrofil yang lebih kecil dibandingkan dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% dan secara statistik (p<0,05) berbeda bermakna. Rerata sel neutrofil ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih besar dibandingkan dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75%, namun secara statistik (p>0,05) berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimum dari ekstrak etanol daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur Swiss yaitu sebesar 2,5%. Pada ekstrak etanol daun majapait 2,5% sudah menujukkan efek antiinflamasi yang disebabkan oleh karagenin 3% dan efek antiinflamasi yang diberikan sudah lebih baik dari perlakuan ekstrak daun majapait konsentrasi 1,67% serta efek antiinflamasinya sebanding dengan ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 3,75%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 55 F. Metode Imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 Pengujian dengan metode immunohistokimia dengan antibodi antiCOX-2 bertujuan untuk mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak etanol daun majapait melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Prinsip dari metode ini adalah adanya pengikatan antigen pada antibodi yang yang dilekatkan dengan suatu penanda yang bereaksi dengan kromogen DAB (Diaminobenzidin) sehingga menjadi substrat berwarna cokelat. Pemeriksaan ekspresi COX-2 ekstrak etanol daun majapait dilakukan dengan melakukan pengecatan mengunakan antibodi monoklonal primer COX-2. Antibodi ini berikatan dengan reseptor COX-2 yang ada di sel radang sehingga sel yang mengekspresikan COX-2 berwarna coklat ketika diberi pewarna DAB dari reagen imunohiostokimia. Visiulisasi warna yang dihasilkan dari ekspresi COX-2 dapat memberikan gambaran kualitatif maupun gambaran kuantitatif (IHC, 2015). Pewarnaan secara enzimatis oleh peroksidase menyebabkan adanya warna yang berbeda antara sel yang mengekspresikan COX2 dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2. Sel yang mengekspresikan COX-2 akan berwarna kecokelatan yang pekat atau gelap (panah warna hitam) dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2 akan berwarna keunguan (panah warna kuning) (Gambar 9). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 56 Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b). Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2. Protein siklooksigenase (cyclooxygenase = COX) menghidrolisis asam arakidonat (AA) menjadi prostaglandin dengan kedua bentuk isoformnya, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 hampir pada semua jaringan, terutama pada saluran cerna dan ginjal, yang mempertahankan fungsi fisiologi normal jaringan (Akmal, dkk., 2007). COX-2 tidak terdeteksi dalam semua sel dan jaringan normal, akan tetapi COX-2 akan cepat terinduksi apabila sel menerima stimulus inflamasi (Widiastuti, 2011). Migrasi sel darah putih (leukosit) pada daerah cedera jaringan atau infeksi merupakan respon imun tubuh yamg menjadi karakteristik utama pada inflamasi akut adalah migrasi leukosit (terutama neutrofil). Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama sehingga ekspresi COX-2 pada penelitian ini diekspresikan oleh sel neutrofil. Hasil pengecatan immunohistokimia dengan antibodi anti COX-2 masing-masing perlakuan beserta kontrol dapat dilihat pada gambar 10 dan tabel III. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 57 Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran merah) Keterangan : 1. 2. 3. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali Kulit normal dengan perbesaran 400 kali Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali 4. 5. 6. Kulit kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 400 kali Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5% dengan perbesaran 100 kali Kulit ekstrak etanol daun majapait 2,5% dengan perbesaran 400 kali PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 58 Tabel III. Rerata ekspresi protein COX-2 (dalam %) oleh ekstrak etanol daun majapait dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi karagenin 3% Kelompok I II III IV V VI Rerata ekspresi protein COX-2 (dalam %) ± SE 98,55 ± 0,37 97,98 ± 0,22 23,40 ± 0,89 91,67 ± 0,41 86,56 ± 1,09 85,87 ± 1,18 Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif (karagenin 3 %) II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan positif (hidrokortison 2,5 %) IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 % V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 2,5 % VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 % Data pada tabel III menunjukan bahwa kelompok perlakuan kontrol negatif (karagemim 3%) dan kontrol Biocream® memiliki rerata persen ekspresi protein COX-2 paling besar dibanding dengan kelompok lainnya yaitu 98,55 ± 0,37 dan 97,98 ± 0,22. Hal tersebut menunjukan terjadi proses peradangan dengan adanya injeksi karagenin pada daerah subkutan yang ditandai dengan peningkatan persen ekspresi protein COX-2, serta basis yang digunakan untuk ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam menurunkan ekspresi protein COX-2. Penurunan rerata persen ekspresi protein COX-2 paling besar ditunjukan pada kelompok kontrol positif dengan rerata persen ekspresi protein COX-2 sebesar 23,40 ± 0,89. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 3,75%, kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5%, dan kelompok perlakuan ekstrak etanol 1,67%, dengan rerata persen ekspresi protein COX-2 sebesar 85,87 ± 1,18; 86,56 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 59 ± 1,09; dan 91,67 ± 0,41. Profil rerata ekspresi protein COX-2 pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada gambar 11. Gambar 11. Diagram batang ekspresi protein COX-2 masing-masing kelompok perlakuan beserta kontrol Berdasarkan gambar 11 diatas, memperlihatkan terjadi peningkatan jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 setelah pemberian injeksi subkutan karagenin pada semua kelompok perlakuan. Jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 paling tinggi ditunjukkan oleh kelompok kontrol negatif (karagenin 3%) dan kelompok kontrol Biocream®. Protein COX-2 merupakan protein yang bertanggung jawab terhadap respon inflamasi dan produksi prostaglandin (Leahy et al., 2000). Hal ini menunjukkan bahwa PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 60 kelompok perlakuan karagenin 3% menginduksi inflamasi sel pada daerah subkutan. Profil kelompok kontrol positif (Hidrokortison) dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait menunjukkan jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 lebih kecil dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif dan kelompok kontrol Biocream®. Penurunan ekpresi protein COX-2 menunjukan bahwa kontol positif dan kelompok perlakuan memberikan aktivitas antiinflamasi. Hidrokortison memiliki aktivitas antiinflamasi melalui banyak mekanisme molekuler. Salah satunya melalui jalur reseptor glukokortikoid yang langsung mengatur ekspresi gen. Dalam mekanisme ini, hidrokortison bebas akan mengikat dan mengaktifkan reseptor glukokortikoid sitosol tertentu (GR). Kompleks tersebut secara selektif menekan gen inflamasi tertentu yang mengkodekan sitokin (misalnya IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α), kemokin, molekul adhesi (misalnya molekul adhesi E-selektin, ICAM-1, VCAM-1), protein inflamasi (misalnya fosfolipase A2, COX-2, iNOS), mediator lipid inflamasi (misalnya prostaglandin) (Derendorf & Meltzer, 2008;. Fernandes et al, 2008). Hasil perhitungan persen ekspresi protein COX-2 dari masing-masing kelompok perlakuan digunakan untuk menentukan persen penekanan inflamasi untuk setiap perlakuan. Pengujian distribusi data rata-rata persen penekanan ekpresi protein COX-2 setiap kelompok perlakuan mengunakan uji Shapiro-Wilk menunjukan distribusi data normal (p>0,05), sehingga dilanjutkan dengan uji homogenitas variasi. Data yang diperoleh memiliki variasi data yang tidak homogen dengan nilai p=0,023 (p<0,05) sehingga uji One Way ANOVA tidak dapat digunakan. Uji Kruskal-Wallis merupakan metode alternatif sebagai PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 61 penganti analisis varian satu arah (One way ANOVA) apabila syarat-syarat yang dibutuhkan oleh metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi. Hasil statistik uji Kruskal-Wallis memberikan nilai p=0,000 (<0,05) sehingga diambil kesimpulan paling tidak terdapat satu kelompok yang berbeda yang kemudian dilanjutkan uji Mann Whitney. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada tabel IV. Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi protein COX-2 (dalam %) masingmasing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney Kelompok I II III IV V VI Rerata penekanan ekspresi protein COX-2 (dalam%)±SE 1,45 ± 0,37 2,02 ± 0,22 76,60 ± 0,88 8,33 ± 0,41 13, 44 ± 1,09 14,13 ± 1,18 I TB BB BB BB BB II III IV V VI TB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB TB BB BB BB BB BB BB BB BB BB TB Keterangan: I : Kelompok perlakuan kontrol negatif (karagenin 3 %) II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan basis Biocream® III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan positif (hidrokortison 2,5 %) IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 % V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 2,5 % VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 % SE : Standar eror BB: Berbeda bermakna (p<0,05) TB: Berbeda tidak bermakna (p>0,05) Dari tabel IV menunjukan rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok karagenin 3% berbeda tidak bermakna dengan kelompok Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek antiinflamasi. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 karagenin 3% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 62 konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3% pada penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator inflamasi, sedangkan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% yang lebih kecil dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% juga memiliki rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% yang lebih kecil dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 63 menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% juga lebih besar dibandingkan kelompok kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% yang lebih kecil dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% dan 2,5%, namun menunjukan perbedaan tidak bermakna secara statistik (p>0,05) terhadap kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5%. Hal ini berarti bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5%. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3, 75% menunjukan perbedaan yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%. Hal ini berarti bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun 3, 75% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67%. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 64 Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% memiliki rerata persen penekanan lebih besar dibandingkan kelompok ekspresi protein COX-2 daun majapait 1,67%. Hal ini menunjukan bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun 2,5% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67%. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih kecil dibandingkan dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75%, namun secara statistik (p>0,05) berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimun dari ekstrak etanol daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur Swiss yaitu sebesar 2,5% karena sudah menujukan efek antiinflamasi yang disebabkan oleh karagenin 3% dan sebanding dengan ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 3,75%. G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait Aktivitas antiinflamasi pada ekstrak daun majapait diduga berasal senyawa flavanoids serta tanin. Ejelonu et al., (2011) menegaskan bahwa senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai antioksidan dan melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas. Aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal bebas dapat menggangu sinyal yang memediasi respon imun seluler melalui modulasi ROS (reactive oxygen species) / RNS (Reactive nitrogen species). Kedua spesies reaktif ini memiliki peran penting dalam peradangan yang pada dasarnya menjadi elemen pemicu sistem imun (Gomes, 2008). Flavonoid akan menangkap radikal bebas dari kedua spesies reaktif ini sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah (Gomes, 2008). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 65 Mekanisme antiiflamasi oleh senyawa flavonoid dari daun majapait dalam penelitian ini diduga dengan menghambat migrasi sel neutrofil yang secara langsung mengurangi pelepasan asam arakidonat oleh neutrofil dan sel-sel kekebalan lainnya. Dengan demikian akan memutus metabolisme dari keluarga eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin, leukotrien, dan metabolit terkait). Sifat anti-inflamasi dari flavonoid telah dibuktikan melalui sejumlah besar tes pada molekul yang beragam dari kelas flavonoid yang berbeda, untuk mengeksplorasi efek mereka pada berbagai jalur yang terlibat dalam proses inflamasi. Sifat anti-inflamasi dari senyawa flavonoid tidak hanya berasal dari aktivitas antioksidan. Peran flavonoid dalam memodulasi ekspresi protein COX-2 dan iNOS telah didokumentasi dengan jelas (gambar 12). Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktorfaktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-κB, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL-6 (Gomes, 2008). PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 66 Mekanisme aktivitas antiinflamasi senyawa flavonoid dengan cara menggangu aktivitas NF-κB aktivator sehingga menghambat pengekspresian protein COX-2. NF-κB adalah salah satu faktor transkripsi dari empat faktor transkripsi yang telah diidentifikasi untuk mengikat cis-acting elemen di wilayah promotor dan mengatur transkripsi protein COX-2 (Gomes, 2008). Selain itu efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait juga diduga berasal dari senyawa alkaloid dan saponin. Beberapa alkaloid telah digunakan pada pengobatan analgesik, anti-spasmodik dan bakterisida di dunia kedokteran. Alkaloid yang terkandung pada ekstrak daun majapait mungkin dapat menjelaskan mengapa dapat bertindak sebagai agen anti-inflamasi. Saponin pada daun majapait dapat berfungsi sebagai agen anti-inflamasi dan antibiotik dalam mengobati penyakit (Ejelonu et al., 2011). Hasil uji HE dan immunohistokimia menunjukan efek antiinflamasi topikal dari ketiga seri konsentrasi ekstrak etanol mengalami peningkatan seiringan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol daun majapait yang diberikan. Namun pada ekstrak daun majapait konsentrasi 2,5% dan 3,75% secara statistik peningkatan efek antiinflamasi tersebut berbeda tidak bermakna . Hal tersebut menunjukan bahwa pada penelitian ini tidak adanya pengaruh peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. Range konsentrasi yang digunakan diduga terlalu kecil sehingga tidak memperlihatkan pengaruh peningkatan efek antinflamasi seiringan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Aktivitas antiinflamasi dari ekstrak etanol daun majapait ini di dukung melalui uji antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait secara PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 67 makroskopik menggunakan metode Inflammation-assosiated edema (Monika, 2016) dimana parameter efek antiinflamasi dilihat dari penurunan edema yang terbentuk setiap 1 jam selama 6 jam dengan jangka sorong digital. Hasil ekstrak daun majapait pada penelitian ini tidak menggunakan senyawa aktif tunggal sehingga senyawa aktif lain yang terkandung di dalamnya dapat mempengaruhi hasil penelitian. Penelitian ini merupakan skrining awal untuk menunjukan bahwa daun majapait memiliki efek antiinflamasi topikal. Hal tersebut membuktikan bahwa daun majapait menjadi salah satu tanamana alternatif pengobatan inflamasi, tidak hanya berpotensi sebagai obat antiinflamasi oral tetapi sebagai obat antiinflamasi topikal juga. Oleh karena itu diharapkan adanya penelitian lebih lanjut yang berkaitan untuk memastikan senyawa aktif yang bertanggung jawab memberikan efek antiinflamasi dari ekstrak daun majapait. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete mempunyai efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase-2 pada mencit betina galur Swiss. 2. Mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstak etanol Crescentia cujete diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi enzim COX-2 pada daerah inflamasi. B. Saran Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa yang bertanggung jawab dalam ekstrak etanol daun Crescentia cujete yang menunjukkan adanya efek antiinflamasi topikal. 68 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Akmal, M., Aulanni’am,dan riawan, Wibi, 2007, Ekpresi Cyxlooxygenase2(COX-2) pada jaringan Testis Tikus (Ratus norvegicus) Akibat Paparan Ekstrak Biji Pinang (Areca catechu), Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol.XXIII, No.3,pp.121-124. Anonim, 2015, Key Words : Acute Inflammatori, American College of Foot and Ankle Surgeons https://www.lakeviewhealth.org/upload/docs/Acute%20 Inflammation.pdf) diakses tanggal 12 September 2015 /15:57 WIB Anonim, 2015, Key Words: Taxonomi Crescentia cujete http://www.itis.gov/ servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=34332, diakses tanggal 21 November 2015/ 7:45 WIB Ansel,H.C., 1989, Pengatar Bentuk sediaan Farmasi, Edisi 4, UI Press, Jakarta,pp. 96,147. Bhagavan, N.V., Ha, Chung-eun, 2011, Essetials of Medical Biochemistry with Clinical Cases, Academic Press, London, pp. 449-450. Blank, J., Hastings, G., 1998, Handbook of Biomaterial Properties, Springer Science and Business Media, Berlin, pp. 492-493. BTFP, 2005, Market Brief in the European Union for selected natural ingredients derived from native species: Crescentia cujete, UNCTAD, Netherlands, pp. 6. Corwin, E.J., 2008, Handbook Of Pathophysiology, Third Edition, The Ohio State University. Columbus, p. 303. Dahlan, M.A., 2009, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Edisi IV, Salemba Medika, Jakrta, pp.84-95. Das, N., Islam, M. E., Jahan, N., Islam, M.S., Khan, A., Islam, M. R.,and Parvin, M. S., 2014, Antioxidant activities of ethanol extracts and fractions of Crescentia cujete leaves and stem bark and the involvement of phenolic compounds, BMC Complementary and Alternative Medicine, Bangladesh, 14(45), 1-9. Derendorf, H. & Meltzer, E. O., 2008, Review article Molecular and clinical pharmacology of intranasal corticosteroids: clinical and therapeutic implications, Allergy, Vol.63, pp. 1292-1300. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sedian Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 10-11, 436. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, p.649. 69 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 70 Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012, Crescentia cuyete L., Informasi Singkat Benih, No. 134. Ditjen POM, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan pertama, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 10-12. Djuanda, A., 2007, Ilmu Penyakit Kulit Dan Kelamin, Edisi Kelima, Balai Penerbit FKUI, Jakarta, pp. 138-147. Dorland, W.A.N., 2002, Kamus Kedokteran Dorland, Edisi 29. EGC, Jakarta, p. 68. Ejelonu, Lasisi, Olaremu, and Ejelonu, 2011, The Chemical Constituents of Calabash (Crescentia cujete L.), African Journal of Biotechnology, Vol. 10(84), pp. 19631-19636. Febrianti, Monika, 2016, Uji Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescantia cujete L.) pada Mencit Terinduksi Karagenin, Tugas Akhir , Fakultas farmasi Universitas sanata Dharma, Yogyakarta. Fernandes, AM.; Cardoso, F.; Valera, P. & Anselmo-Lima, WT., 2008, Mechanism of actionof glucocorticoids in nasal polyposis, Rev Bras Otorrinolaringol, 74(2), 279-283. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J.L.F.C., Mira, L., Corvo, M.L., 2008, Molecular Mechanisms of Anti-inflammatory Activity Mediated by Flavonoids, Current Medicinal Chemistry, Vol. 15, 1586-1605. Harinaldi, 2005, Prinsip-prinsip Statistik untuk Teknis dan Sains, Penerbit Erlangga, Jakarta, p. 224. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan (Alih bahasa : Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro), ITB Press, Bandung, pp. 5, 69-76. IHC World, 2015, Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining Protocol, https://www.ihcworld.com/ _protocols/special_stains/h&e_ellis.htm diakses pada tanggal 14 desember 2015/ 22:44 WIB Ikawati, Z., Nugroho, A.E., Werdhinindah, W., 2006, Efek Ekstrak Etanol Daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap Penekanan Ekspresi Enzim Siklooksigenase–2 pada Kultur Sel Raji, Majalah Farmasi Indonesia,17(2), 85-90. Julia, F.M., 1968, The Calabash (Crescentia cujete) in folk medicine, Botanical Garden Pres, New York, Vol. 22 p. 273–80. Junqueira, L.C., 2007. Histologi Dasar: Teks & Atlas. Ed. 10. Jakarta, EGC, p. 451. Kamboj V. P., 2000, Herbal medicine, Current Science, Vol. 78 (1), 35. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 71 Kent, M., 2000, Advanced Biology, Oxford univerdity Press, New York, pp. 326327. Kee, J.L., dan Hayes, E. R., 1994, Farmakologi Pendekatan Proses Keperawatan, Edisi 5, diterjemahkan Peter, A., Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp.310317. Khan, 2015, Exotic Arboreal Plants of Bhopal, Their Therapeutic Potential and Conservation, Indian J. Applied & Pure Bio. Vol. 30(1), 89-95. Kumar, V., Abbas, A.K., and Fausto, N., 2005, Pathologic Basic of Diseases, 7th ed, Elsevier Saunders, Philadelphia, pp. 70-73. Kusuma, A.M., Sulistyo, A.N., Susanti, dan Sabikis 2014, Aktivitas Penghentian Pendarahan Luar Ekstrak Etanol Daum Berenuk (Crescentia cujete L.) Secara In-Vivo, Pharm Sci Res, Vol.1(2), 2407-2354. Laufer, S., Gay S., Brune K., 2003, Inflammation and rheumatic Diseases : The Molecular basic of Novel Trerapies, Thieme, New York, pp. 22-23. Leahy, K.M., Ornberg, R.L., Wang, Y., Zweifel, B.S., Koki, A.T., dan Masferrer, J.L., 2002, Cyclooxygenase-2 Inhibition by Celecoxib Reduces Proliferation and Induces Apoptosis in Angiogenic Endothelial Cells in Vivo, Cancer Res., 62, 625–631 Mansjoer, Arif, dkk. 1999. Kapita Selekta Kedokteran, Edisi Ketiga, Jilid 1, Media Aesculapius Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, p. 158. Mahbud, K.R., Hoq M.M., Ahmed, M.M., dan Sarker, A., 2011, In Vitro Antibacterial of Crescentia cujete and Moringa oleifera, Bangladesh Research Publications Journal , Vol. 5(4), 337-343. Mohan H., Mohan S., 2011, Essential Pathology for Dental Students, JP Medical, India, pp. 98-99. Parvin, M.S., Das, N., Jahan, N., Akhter, M.A., Nahar, L., and Islam, M.E., 2015, Evaluation of in vitro anti‑inflammatory and antibacterial potential of Crescentia cujete leaves and stem bark, BMC Res Notes, 8:412, 1-7. Perdanakusuma, David S., 2007, Anatomi Fisiologi Kulit dan Penyembuhan Luka, Plastic Surgery Departement Airlangga University School of Medicine, Surabaya, pp. 1-3. Rahayu, Yani C., 2009, Respons Antiinflamasi Serbuk Biji Alpukat (Persea americana mill) terhadap Jumlah PMN Neutrofil Mencit yang Diinduksi Bakteri E. Coli, Jurnal Kedokteran Meditek, Vol.16(42). Rathee, P., Chaudhary, H., Rathee, S., Rathee, D., Kumar V., and Kohli, K., 2009, Mechanism of Action of Flavonoids as Anti-inflammatory Agents: A Review, Inflammation & Allergy - Drug Targets, Vol. 8, 229-235. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 72 Rismayani, Puslitbangbun, 2013, Manfaat Buah Maja sebagai Pestisida Nabati untuk hama Penggerek Buah Kakao (Conopomorpha cramerella), Warta Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industry, Volume 19, No 3, p.25. Rowe, R.C., Sheskey, P.J. and Quinn M., E.,2009, Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press, London, pp. 418, 685. Sampurno, 2015, Obat Herbal dalam Prespektif Medik dan Bisnis http://www. mot.farmasi.ugm.ac.id/files/13OBAT%20HERBAL_Sampurno.pdf diakses tanggal 19 Desember 2015/18:55 WIB Schmeltzer, Linda E., and Norsworthy, Gary D., 2012, Nursing The Feline Patient, John Wiley and Sons, UK, pp. 104-108. Serhan, C. N., Ward, P. A., Gilroy, D.W., 2010, Fundamentals of Inflammation, Cambridge University Press, New York, pp. 161-162. Sitompul, ratna, 2011, Kortikosteroid Dalam Tata Laksana Uveitis: Mekanisme Kerja, Aplikasi Klinis dan efek samping, Vol.61, J Indon Med Assoc, 265-9. Soma, P.K., Williams, P.D., Moon, B., Lo,Y.M., 2013, Advancement in Microbial Polysaccharide Research for Frozen Food and Microencapsulation of Probiotics, Advences in Food Process Engineering Research and Applications, Springer Science and Business Media, New York, pp. 274-275). Steenis, C.G.G.J. van, 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT Pradnya Paramita, Jakarta, pp.35-37,49-57, 372-374. Tambayong, Jan, 2000, Patofisiologi untuk Keperawatan, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 50. Taylor, Clive R., 2015, IHC Guidebook, Dako, USA, pp. 11-18. The Human Protein Atlas, 2015, Immunocytochemistry, http://www.proteinatlas. org/learn/method/immunocytochemistry diakses pada tanggal 15 Desember 2015/ 00:19 WIB. Tjay, Tan Hoan dan Rahardja, Kirana, 2007, Obat-Obat Penting : Khasiat, Penggunaan dan Efek-efek Sampingnya, Elex Media Komputindo, Jakarta, p.647. Tranggono, R.I.S dan Latifah, F., 2007, Buku Pegangan Ilmu Pengetahuan Kosmetik.: Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, pp. 7-8, 93-96. Vane, J., Botting, J., Botting, R., 1996, Improved Non-steroid Anti-inflammatory Drugs : COX-2 Enzyme Inhibitors, William Harvey Press, London, pp.1-6. Wade, C. L., Koob, G.F., and Vendruscolo, L.F., 2014, Drug Addiction and Chronic Pain: A Review of Animal Models, Neurobiological Studies of Addiction in Chronic Pain States, Springer, New York, Chapter 5, pp. 6166. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 73 Walton, N.J., Brown, D.E., 1999, Chemicals from Plants : Perspectives on Plant Secondary Products, Imperial College Press, London, pp.101-102. Widiastuti, dkk., 2011, Ekspresi Protein Cox-2 pada Karsinoma Nasofaring Respons Tinggi dan Respon Rendah Pasca-Radioterapi, JBP, Vol.13, No.12, pp. 105-114. Porth, Carol M., 2011, Essentials of Pathophysiology : Conceps of Altered Health States, China, Williams, L. and Wilkins pp. 59-60. Wilmana, P.F., 1995, Analgesik Anti-inflamasi Nonsteroid dan Obat Pirai, dalam Ganiswara, S.G.(Editor), Farmakologi dan Terapi, edisi V, Bagian Farmakologi-Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, p. 207 Winter, C.A., Risley, E.A., dan Nuss, G.W., 1962. Carrageenin - induced Udem in Hind Paw of the Rat as an Assay for Antiinflammatory Drugs, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, Vol 111, p. 544. PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 74 LAMPIRAN PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 1. Surat keterangan hasil (Crescentia cujete L.) determinasi tanaman 75 majapait PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 2. Serbuk daun Crescentia Crescentia cujete cujete beserta ekstrak Gambar 13. Daun Crescentia cujete Gambar 14. Serbuk daun Crescentia cujete Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescentia cujete 76 etanol PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit Gambar 16. Mencit Betina Galur Swiss Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10% 77 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak Gambar 20. Kontrol Hidrokortison sebagai kontrol positif Gambar 21. Alat spuit injeksi 78 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 5. Surat Etical Clirens 79 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 80 Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin eosin (HE) a. Kontrol Negatif Bidang pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 84 125 94 138 128 113,8 Preparat II III IV 103 78 164 129 86 133 108 72 111 118 111 142 79 92 102 107,4 87,8 130,4 V 93 105 107 127 155 117,4 b. Kontrol Biocream® Bidang Pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 185 187 109 204 98 156,6 Preparat II III 183 100 144 103 89 85 103 75 84 101 120,6 92,8 IV 108 90 72 88 80 87,6 V 70 93 84 102 96 89 c. Kontrol Positif Bidang Pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 77 43 38 49 62 53,8 II 68 79 54 50 51 60,4 Preparat III 41 30 73 61 63 53,6 IV 94 96 92 89 83 90,8 V 61 77 84 90 87 79,8 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI d. Ekstrak etanol daun majapahit 1,67% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 36 32 34 41 33 35,2 II 30 29 23 26 22 26 Preparat III IV 28 42 39 32 33 38 25 28 26 27 30,2 33,4 V 48 30 23 38 17 31,2 e. Ekstrak etanol daun majapahit 2,5% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 28 33 21 22 25 25,8 II 30 35 33 30 36 32,8 Preparat III 14 21 28 28 22 22,6 IV 18 31 25 26 24 24,8 V 27 27 22 29 24 25,8 IV 25 13 12 15 21 17,2 V 7 14 17 13 16 13,4 f. Ekstrak etanol daun majapahit 3,75% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 Rerata I 41 24 21 29 28 28,6 II 11 9 17 14 6 11,4 Preparat III 11 12 7 17 19 13,2 81 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 82 Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro Wilk Descriptives Perlakuan Statistic Mean Sel Kontrol Mean 111.3600 Neutrofil Negatif 95% Confidence Interval for Lower Bound 91.9675 Mean Upper Bound 130.7525 5% Trimmed Mean 111.6111 Median 113.8000 Variance Std. Error 6.98467 243.928 Std. Deviation 15.61819 Minimum 87.80 Maximum 130.40 Range 42.60 Interquartile Range 26.30 Skewness -.656 .913 Kurtosis 1.268 2.000 109.3200 13.26689 Kontrol Mean Biocream 95% Confidence Interval for Lower Bound 72.4852 Mean Upper Bound 146.1548 5% Trimmed Mean 107.9000 Median 92.8000 Variance 880.052 Std. Deviation 29.66567 Minimum 87.60 Maximum 156.60 Range 69.00 Interquartile Range 50.30 Skewness 1.340 .913 Kurtosis .846 2.000 Kontrol Mean 67.6800 Positif 95% Confidence Interval for Lower Bound 46.8536 Mean Upper Bound 88.5064 5% Trimmed Mean 67.1778 Median 60.4000 Variance 281.332 Std. Deviation 16.77295 Minimum 53.60 Maximum 90.80 7.50109 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Range 37.20 Interquartile Range 31.60 Skewness .732 Kurtosis 83 .913 -1.895 2.000 31.2000 1.56333 Ekstrak Mean daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 26.8595 majapait Mean Upper Bound 35.5405 1,67% 5% Trimmed Mean 31.2667 Median 31.2000 Variance 12.220 Std. Deviation 3.49571 Minimum 26.00 Maximum 35.20 Range 9.20 Interquartile Range 6.20 Skewness -.653 .913 Kurtosis .468 2.000 Ekstrak Mean 26.3600 daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 21.6046 majapait Mean Upper Bound 31.1154 2,5% 5% Trimmed Mean 26.2111 Median 25.8000 Variance 1.71278 14.668 Std. Deviation 3.82988 Minimum 22.60 Maximum 32.80 Range 10.20 Interquartile Range 5.60 Skewness 1.556 .913 Kurtosis 3.190 2.000 16.7600 3.10702 Ekstrak Mean daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 8.1335 majapait Mean Upper Bound 25.3865 3,75% 5% Trimmed Mean 16.4000 Median 13.4000 Variance Std. Deviation 48.268 6.94752 Minimum 11.40 Maximum 28.60 Range 17.20 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Interquartile Range 10.60 Skewness 1.768 .913 Kurtosis 3.141 84 2.000 Tests of Normality a Kolmogorov-Smirnov Perlakuan Statistic df Sig. Shapiro-Wilk Statistic df Sig. * .968 5 .860 Mean Sel Kontrol Negatif .200 5 .200 Neutrofil Kontrol Biocream .311 5 .128 .813 5 .102 5 .200 * .854 5 .207 * .970 5 .878 Kontrol Positif .268 Ekstrak daun majapait 1,67% .187 5 .200 Ekstrak daun majapait 2,5% .358 5 .035 .840 5 .165 5 * .796 5 .075 Ekstrak daun majapait 3,75% .286 .200 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. Test of Homogeneity of Variance Levene Statistic df1 df2 Sig. Mean Sel Based on Mean 5.768 5 24 .001 Neutrofil Based on Median 1.455 5 24 .241 1.455 5 7.736 .306 5.258 5 24 .002 Based on Median and with adjusted df Based on trimmed mean PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 8. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Kruskal-Wallis Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Kontrol Negatif 5 25.60 Kontrol Biocream 5 24.80 Kontrol Positif 5 18.60 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 12.20 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 7.80 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 4.00 Total 30 b,c Test Statistics Mean Sel Neutrofil Chi-Square 25.847 df 5 Asymp. Sig. Monte Carlo Sig. .000 Sig. 95% Confidence Interval .000 Lower Bound .000 Upper Bound .000 a. Based on 10000 sampled tables with starting seed 2000000. b. Kruskal Wallis Test c. Grouping Variable: Perlakuan a 85 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 9. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Mann-Whitney a. Kontrol Negatif vs kontrol Biocream® Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 5 5.80 29.00 Kontrol Biocream 5 5.20 26.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 11.000 Wilcoxon W 26.000 Z -.313 Asymp. Sig. (2-tailed) .754 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .841 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan b. Kontrol Negatif vs Kontrol Positif Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 5 7.80 39.00 Kontrol Positif 5 3.20 16.00 Total Test Statistics 10 b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 1.000 Wilcoxon W 16.000 Z -2.402 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .016 .016 a 86 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 87 c. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 1.67% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan d. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 2,5% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.00 15.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.619 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 88 e. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 3,75% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Negatif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.00 15.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan f. Kontrol Biocream® vs Kontrol Positif Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Biocream 5 7.60 38.00 Kontrol Positif 5 3.40 17.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 2.000 Wilcoxon W 17.000 Z -2.193 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .028 .032 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 89 g. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 1.67% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Biocream 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan h. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 2,5% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Biocream 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.00 15.00 Total Test Statistics 10 b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.619 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 90 i. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 3,75% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Biocream 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.00 15.00 Total 10 Test Statistics b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan j. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 1.67% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 91 k. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 2,5% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.00 15.00 Total 10 Test Statistics b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.619 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan l. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 3,75% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.00 15.00 Total 10 Test Statistics b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 92 m. Ekstrak daun majapait 1.67% vs Ekstrak daun majapait 2,5% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Ekstrak daun majapait 1,67% 5 7.40 37.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.60 18.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 3.000 Wilcoxon W 18.000 Z -1.991 Asymp. Sig. (2-tailed) .047 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .056 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan n. Ekstrak daun majapait 1.67% vs Ekstrak daun majapait 3,75% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Ekstrak daun majapait 1,67% 5 7.80 39.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.20 16.00 Total 10 Test Statistics b Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 1.000 Wilcoxon W 16.000 Z -2.402 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .016 .016 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 93 o. Ekstrak daun majapait 2,5% vs Ekstrak daun majapait 3,75% Ranks Perlakuan Mean Sel Neutrofil N Mean Rank Sum of Ranks Ekstrak daun majapait 2,5% 5 7.20 36.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.80 19.00 Total 10 b Test Statistics Mean Sel Neutrofil Mann-Whitney U 4.000 Wilcoxon W 19.000 Z -1.781 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .075 .095 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 94 Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 a. Kontrol Negatif Bidang Pandang I 1 2 3 4 5 126 136 122 136 156 Preparat II III IV Sel Hitung 217 257 179 161 274 159 165 260 186 182 229 143 184 167 192 V I 241 258 257 271 258 125 134 121 135 155 Preparat II III IV Sel expresi COX-2 216 246 178 158 267 157 163 254 185 180 222 141 183 163 189 V 237 255 254 268 254 b. Kontrol Biocream® Bidang Pandang I 1 2 3 4 5 228 249 211 195 178 Preparat II III IV Sel Hitung 221 222 239 261 210 242 247 184 165 239 220 285 268 203 220 V I 207 210 208 204 140 222 245 206 189 171 Preparat II III IV Sel expresi COX-2 217 217 234 255 205 238 243 182 164 237 215 280 265 199 216 V 203 204 203 200 137 c. Kontrol Positif Bidang Pandang I 1 2 3 4 5 197 206 218 208 223 Preparat II III IV Sel Hitung 230 228 225 218 228 209 195 198 131 230 256 192 218 250 144 V I 211 179 164 154 154 40 36 47 58 58 Preparat II III IV Sel expresi COX-2 55 55 58 48 49 51 48 48 22 44 61 42 56 53 27 V 58 40 44 45 43 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 95 d. Ekstrak daun majapait konsentrasi 1.67% Bidang Pandang I II 1 2 3 4 5 58 81 92 92 103 91 83 69 87 78 Preparat III IV Sel Hitung 42 68 60 72 65 61 62 50 50 101 V I 45 46 90 53 64 52 76 87 86 94 Preparat II III IV Sel expresi COX-2 86 39 61 76 54 67 65 60 55 78 54 44 72 48 97 V 41 43 82 46 57 e. Ekstrak daun majapait konsentrasi 2,5% Bidang Pandang I II 1 2 3 4 5 66 80 77 87 50 62 63 74 68 71 Preparat III IV Sel Hitung 32 37 50 51 44 50 43 49 50 60 V I 34 39 54 54 58 59 68 70 72 43 Preparat II III IV Sel expresi COX-2 49 29 30 53 46 45 67 39 42 61 39 40 67 44 51 V 28 34 45 44 51 f. Ekstrak daun majapait konsentrasi 3,75% Bidang Pandang I 1 2 3 4 5 Preparat Preparat II III IV V I II III IV V Sel Hitung Sel expresi COX-2 65 55 42 46 16 51 49 34 43 13 79 62 59 57 14 68 55 49 50 12 62 46 48 68 16 56 40 37 58 13 52 53 49 67 21 43 45 41 58 17 44 59 43 69 27 39 54 38 63 25 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 a. Kontrol negatif Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 0,79 1,47 0,82 0,74 0,64 II 0,46 1,86 1,21 1,10 0,54 Preparat III 4,28 2,55 2,31 3,06 2,40 IV 0,56 1,26 0,54 1,40 1,56 V 1,66 1,16 1,17 1,11 1,55 II 1,81 2,30 1,62 0,84 1,12 Preparat III 2,25 2,38 1,09 2,27 1,97 IV 2,09 1,65 0,61 1,75 1,82 V 1,93 2,86 2,40 1,96 2,14 II 76,09 77,98 75,38 80,87 74,31 Preparat III 75,88 78,51 75,76 76,17 78,80 IV 74,22 75,60 83,21 78,13 81,25 V 72,51 77,65 73,17 70,78 72,08 b. Kontrol Biocream® Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 2,63 1,61 2,37 3,08 3,93 c. Kontrol Positif Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 79,70 82,52 78,44 72,12 73,99 pada 96 uji PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI d. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,65% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 10,34 6,17 5,43 6,52 8,74 Preparat II III IV 5,49 7,14 10,29 8,43 10,00 6,94 5,80 7,69 9,84 10,34 12,90 12,00 7,69 4,00 3,96 V 8,89 6,52 8,89 13,21 10,94 e. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 10,61 15,00 9,09 17,24 14,00 Preparat II III 20,97 9,38 15,87 8,00 9,46 11,36 10,29 9,30 5,63 12,00 IV 18,92 11,76 16,00 18,37 15,00 V 17,65 12,82 16,67 18,52 12,07 f. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75% Bidang Pandang 1 2 3 4 5 I 21,54 13,92 9,68 17,31 11,36 II 10,91 11,29 13,04 15,09 8,47 Preparat III IV 19,05 6,52 16,95 12,28 22,92 14,71 16,33 13,43 11,63 8,70 V 18,75 14,29 18,75 19,05 7,41 97 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 98 Lampiran 12. Hasil uji normalitas persen penekanan enzim COX-2 dengan uji Shapiro Wilk Descriptives Perlakuan Persen Kontrol Mean Penekanan negatif 95% Confidence Interval for Lower Bound Mean Upper Bound Enzim COX-2 Statistic Std. Error 1.4460 .37532 .4039 2.4881 5% Trimmed Mean 1.3950 Median 1.0600 Variance .704 Std. Deviation .83924 Minimum .89 Maximum 2.92 Range 2.03 Interquartile Range 1.17 Skewness 2.044 .913 Kurtosis 4.267 2.000 2.0180 .22051 Kontrol Mean Biocream 95% Confidence Interval for Lower Bound 1.4058 Mean Upper Bound 2.6302 5% Trimmed Mean 2.0056 Median 1.9900 Variance .243 Std. Deviation .49307 Minimum 1.54 Maximum 2.72 Range 1.18 Interquartile Range .93 Skewness .580 Kurtosis .913 -.909 2.000 76.6040 .88520 Kontrol Mean Positif 95% Confidence Interval for Lower Bound 74.1463 Mean Upper Bound 79.0617 5% Trimmed Mean 76.6867 Median 77.0200 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI Variance 3.918 Std. Deviation 1.97938 Minimum 73.24 Maximum 78.48 Range 5.24 Interquartile Range 2.83 Skewness Kurtosis -1.663 .913 3.466 2.000 8.3280 .40798 Ekstrak Mean daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 7.1953 majapait Mean Upper Bound 9.4607 1,67% 99 5% Trimmed Mean 8.3017 Median 8.3500 Variance .832 Std. Deviation .91226 Minimum 7.44 Maximum 9.69 Range 2.25 Interquartile Range 1.65 Skewness .756 .913 Kurtosis .006 2.000 Ekstrak Mean 13.4400 daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 10.4059 majapait Mean Upper Bound 16.4741 2,5% 5% Trimmed Mean 13.4878 Median 13.1900 Variance Std. Deviation Ekstrak 1.09280 5.971 2.44358 Minimum 10.01 Maximum 16.01 Range 6.00 Interquartile Range 4.56 Skewness -.428 .913 Kurtosis -.888 2.000 13.7575 1.44399 Mean PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI daun 95% Confidence Interval for Lower Bound 9.1621 majapait Mean Upper Bound 18.3529 3,75% 5% Trimmed Mean 13.7022 Median 13.2600 Variance 100 8.340 Std. Deviation 2.88798 Minimum 11.13 Maximum 17.38 Range 6.25 Interquartile Range 5.44 Skewness .621 Kurtosis 1.014 -2.153 2.619 Tests of Normality Kolmogorova Smirnov Persen Penekanan Perlakuan Statistic Kontrol negatif .355 Kontrol Biocream Enzim COX-2 Kontrol Positif df Shapiro-Wilk Sig. 5 .038 .213 5 .200 .365 5 .028 * Ekstrak daun majapait 1,67% .203 5 .200 * Ekstrak daun majapait 2,5% .206 5 .200 * Ekstrak daun majapait 3,75% .255 4 . Statistic df Sig. .717 5 .014 .925 5 .562 .820 5 .116 .921 5 .539 .940 5 .666 .919 4 .530 a. Lilliefors Significance Correction *. This is a lower bound of the true significance. Test of Homogeneity of Variance Levene Statistic df1 df2 Sig. Persen Based on Mean 3.361 5 23 .020 Penekanan Based on Median 2.472 5 23 .062 2.472 5 14.039 .083 3.278 5 Enzim COX-2 Based on Median and with adjusted df Based on trimmed mean 23 .022 PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 101 Lampiran 13. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan Kruskal-Wallis Ranks Perlakuan N Mean Rank Persen Penekanan Kontrol negatif 5 4.00 Enzim COX-2 Kontrol Biocream 5 7.00 Kontrol Positif 5 28.00 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 13.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 20.20 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 20.80 Total 30 b,c Test Statistics Persen Penekanan Enzim COX-2 Chi-Square 26.915 df 5 Asymp. Sig. Monte Carlo Sig. .000 Sig. 95% Confidence Interval .000 Lower Bound .000 Upper Bound .000 a. Based on 10000 sampled tables with starting seed 1314643744. b. Kruskal Wallis Test c. Grouping Variable: Perlakuan a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 102 Lampiran 14. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan Mann-Whitney a. Kontrol negatif vs kontrol biocream® Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol negatif 5 4.00 20.00 Enzim COX-2 Kontrol Biocream 5 7.00 35.00 Total 10 b Test Statistics Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U 5.000 Wilcoxon W 20.000 Z -1.567 Asymp. Sig. (2-tailed) .117 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .151 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan b. Kontrol negatif vs kontrol positif Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol negatif 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 103 c. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% Ranks Perlakuan N Persen Penekanan Kontrol negatif Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 1,67% Total Test Statistics Mean Rank Sum of Ranks 5 3.00 15.00 5 8.00 40.00 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan d. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% Ranks Perlakuan N Persen Penekanan Kontrol negatif Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 2,5% Total Test Statistics b Enzim COX-2 .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a Sum of Ranks 5 3.00 15.00 5 8.00 40.00 10 Persen Penekanan Mann-Whitney U Mean Rank PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 104 e. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75% Ranks Perlakuan N Persen Penekanan Kontrol negatif Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 3,75% Total Test Statistics Mean Rank Sum of Ranks 5 3.00 15.00 5 8.00 40.00 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan f. Kontrol Biocream® vs kontrol positif Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 105 g. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 8.00 40.00 Total 10 b Test Statistics Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan h. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 106 i. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Biocream 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan j. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 107 k. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.00 15.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan l. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Kontrol Positif 5 8.00 40.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.00 15.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan .009 .008 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 108 m. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 2,5% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan n. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 3,75% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 8.00 40.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U .000 Wilcoxon W 15.000 Z -2.611 Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008 a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 109 o. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% vs 3,75% Ranks Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks Persen Penekanan Ekstrak daun majapait 2,5% 5 5.20 26.00 Enzim COX-2 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 5.80 29.00 Total Test Statistics 10 b Persen Penekanan Enzim COX-2 Mann-Whitney U 11.000 Wilcoxon W 26.000 Z Asymp. Sig. (2-tailed) Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: Perlakuan -.313 .754 .841 a PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI 110 Biografi Penulis Penulis skripsi dengan judul “Uji Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia cujete L.) terhadap Jumlah Neotrifil dan Ekspresi Siklooksigenase 2 pada Mencit Terinduksi Karagenin” memiliki nama lengkap Dui Sostales, merupakan anak bungsu dari dua bersaudara pasangan Sopian dan Illuminata. Penulis dilahirkan di Sidas pada tanggal 26 Agustus 1993, Kalimantan Barat. Pendidikan formal yang telah ditempuh yaitu mengawali masa pendididkannya di SDN 2 Sidas (1999-2005), kemudian melanjutkan pendidikan di SMP Kristen Makedonia Plasma II (2005-2008). Pendidikan Sekolah Menegah Atas ditempuh di SMA Kristen Makedonia (2008-2011). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan serjana di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 di Falkutas Pendidikan Fisika. Tahun 2012, penulis memutuskan untuk pindah ke Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Semasa kuliah penulis cukup aktif dalam kegiatan di fakultas, khususnya pada UKF Basket dan Voli, penulis menjadi anggota aktif (2012-2015). Penulis pernah menjadi asisten pratikum Farmakologi Toksikologi tahun ajaran 2014/2015, serta menjadi peserta di beberapa seminar.
