bahan dan metode

11
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011.
Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa
Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data
dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi,
FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Objek Penelitian
Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S.
incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase
perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase
dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan
secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas
yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.
Tahapan Analisis DNA S. incertulas
Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam
etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris HClEDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; EDTA 0.2 M; air destilata) untuk
menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang
digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan
presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan
Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan
bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain
(kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril.
Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di
dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk
membekukan jaringan, sehingga mempermudah proses penghancuran toraks.
12
Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks
di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M TrisHCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75
ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml).
Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel
diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi
dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru.
Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol
Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung
dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan
yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya,
supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian
bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit),
lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak
ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240
µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol
(CIAA), lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah
tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit).
Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml
baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA.
Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4
o
C (overnight).
Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit)
pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl
alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit).
Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara
divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM,
lalu disimpan pada suhu -4 0C.
13
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S.
incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan
mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan
primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan
amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298
dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1,
Gambar 4).
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S.
incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis
Primer
Mt D4
Mt D9
A-298
Bt-LYS
Gen COI
TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC
CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC
(Simon et al. 1994)
Gen COII
ATTGGACATCAATGATATTGA
GTTTAAGAGACCAGTACTTG
(Liu & Beckenbach1992, Simon et al. 1994)
1442
tRNA-Tyr
Posisi primer
pada mtDNA
O. furnacalis
(No. Akses
GenBank: NC003368)
Sekuen 5’-3’
2977
1339-1365
2131-2157
3337 - 3357
3739 - 3758
3040
3721
tRNA-Leu
Gen COI
tRNA-Lys
Gen COII
A-298
Mt D4
Mt D9
Bt-LYS
100 pb
Gambar 4
Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk
amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan
primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas.
14
Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi
tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl
primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq
DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM).
Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC
(2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC
(1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada
suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masingmasing 30 siklus.
Elektroforesis dan visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada
polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x
TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M).
Visualisasi DNA
menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).
Sekuen DNA
Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA
menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi
DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan
menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa
kromatogram di-edit secara manual.
Analisis Data DNA S. incertulas
Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas
disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen
DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win
dan program BioEdit Versi 7.0.9.0.
15
Analisis Homologi DNA S. incertulas
Gen COI
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian
ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut
menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLASTN) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI)
(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment
dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang
diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas
yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen
nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan
program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php).
Gen COII
Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi
menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII
S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil
penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment
mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.
Tabel 2
No
Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Sampel
Haplotipe
Sampel
Lep.12062007.H1
Lep.20032007.H1
Lep.16042007.H1
Lep.23032006.H1
Lep.10062005.H1
Lep.10042007.H2
Lep.13042007.H3
Lep.20052006.H4
Lep.10022006.H5
Lep.28052006.H6
1 Lep.12062007
2 Lep.20032007
3 Lep.16042007
4 Lep.23032006
5 Lep.10062005
6 Lep.10042007
7 Lep.13042007
8 Lep.20052006
9 Lep.10022006
10 Lep.28052006
Keterangan:
H = Haplotipe; Jabar = Jawa Barat; Jateng
Jatim = Jawa Timur
Lokasi
Dieng, Wanasaba, Jateng
Pakembinangun, Sleman, DIY
Magetan, Jatim
Karangmangu, Baturaden, Jateng
Garut, Jabar
Baluran National Park, Jatim
Alas Purwo National Park, Jatim
Ciamis, Jabar
Wates, Kulon Progo, DIY
Halimun-Salak National Park, Jabar
No. Akses
GenBank
AB495265
AB495267
AB495268
AB495272
AB495273
AB495269
AB495270
AB495271
AB495266
AB495274
= Jawa Tengah; DIY = Daerah Istimewa Yogyakarta;
16
Tabel 3
Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian
Raffiudin dan Samudra (2010)
Sc7Bg
Sc9Bg
Sc22Kr
Haplotipe
Sampel
Sc7Bg.H1
Sc9Bg H1
Sc22Kr.H1
Bogor, Jabar
Bogor, Jabar
Karawang, Jabar
Sc8Id
Sc10Id
Sc11Bg
Sc8Id.H1
Sc10Id.H1
Sc11Bg.H2
Indramayu, , Jabar
Indramayu, Jabar
Bogor, Jabar
No
Sampel
1
2
3
4
5
6
Lokasi
Titik Koordinat
L: -6,872
A: 109,359
L: -6,256
A: 107,322
L: A: L: -6,872
A: 109,359
L: A: -
7 Sc24Kr
Sc24Kr.H3
Karawang, Jabar
8 Sc1Cb
Sc1Cb.H4
Cirebon, Jabar
Keterangan:
H = Haplotipe; Bg = Bogor; Kr = Karawang; Id = Indramayu; Cb = Cirebon
L= Latitude, A= Altitude; = tidak ada data latitude dan altitude
Analisis Homologi Asam Amino Putataive S. incertulas
Sekuen nukleotida gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini
masing-masing ditranslasi ke dalam asam amino dengan mengunakan program
Genetyx Win versi 4.0. Tahap berikutnya, sekuen asam amino putative gen COI
dan gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi dengan data
GenBank. Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local
Alignment Search Tool-Protein (BLAST-P) dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen
asam amino putative di-alignment terhadap individu S. incertulas untuk masingmasing gen COI dengan gen COII.
Analisis Jarak Genetik
Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI S. incertulas dan S.
innotata (Si; No. Akses GenBank: AB495264). Sedangkan, analisis jarak genetik
gen COII S. incertulas dilakukan antara S. excerptalis asal Papua Nugini dan India
(Se.PNG dan Se.India; berturut-turut No. Akses GenBank: AY320508 dan
AY320507). Proses analisis jarak gen COI dan COII S. incertulas menggunakan
program MEGA 5.
17
Analisis Filogeni
Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI S. incertulas (ingroup)
dan spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. innotata, C.
suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 4). Pada gen COII, konstruksi pohon
filogeni dilakukan antar S. incertulas (ingroup) spesies ngengat lain kelompok
Crambidae (outgroup) yaitu S. excerptalis, C. suppressalis, dan O. furnacalis
(Tabel 5).
Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor
Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 5.
Tabel 4
No
1
2
3
Spesies
S. innotata
C. suppressalis
O. furnacalis
Tabel 5
No
1
Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari
GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
Lokasi
Indonesia
Cina
Cina
Cina
No. Akses GenBank
AB495264
EU362114
EU362115
NC003368
Sampel
Si.AB495264
Cs.H1.EU362114
Cs.H2.EU362115
Of.NC003368
Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari
GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
Spesies
S. excerptalis
2
C. suppressalis
3
O. furnacalis
Lokasi
India
Papua Nugini
Cina
Cina
Cina
No. Akses GenBank
AY320507
AY320508
EU362116
EU362117
NC003368
Sampel
Se.India.AY320507
Se.PNG.AY320508
Cs.H1.EU362116
Cs.H2.EU362117
Of.NC003368