PENUNTUN PRAKTIKUM VIROLOGI PRAKTIKUM VII A. Uji Haemaglutinasi Inhibisi (HI test) untuk identifikasi virus ND metode Alpha Haemaglutinasi inhibisi (HI) merupakan uji yang dapat digunakan untuk identifikasi virus-virus yang dapat mengaglutinasi darah. HI merupakan uji penghambatan aglutinasi sehingga pada uji HI tidak terjadi aglutinasi sel darah merah oleh virus karena adanya penghambatan aglutinasi oleh antibodi anti virus yang ada dalam serum. Pada uji ini virus diikat oleh antibodi yang homolog sehingga tidak dapat melekat pada reseptor dari membran sel darah merah, dengan demikian aglutinasi sel darah merah tidak terjadi. Uji HI mempunyai 2 fungsi, yaitu pertama sebagai sarana untuk mengidentifikasi jenis antigen tertentu dengan mereaksikannya terhadap antibodi homolog yang telah diketahui. Kedua untuk mengetahui jenis antibodi dan titernya, dengan cara mereaksikan serum yang ingin diketahui jenis antibodinya dengan antigen standar yang telah diketahui. Uji HI dapat dilakukan dengan 2 metode yaitu metode alpha (α) dan beta (β). Metode alpha sering digunakan untuk menguji jenis antigen. Pada metode α, antigen yang diuji diencerkan secara seri, dan antibodi standarnya (antibodi yang telah diketahui jenis dan titernya) dalam jumlah tetap. Kelebihan metode ini kita dapat langsung mengidentifikasi antigen tanpa melakukan uji HA terlebih dahulu. Namun demikian pada uji ini diperlukan antibodi dalam jumlah banyak dan titer yang cukup tinggi untuk digunakan sebagai standar. Metode beta dapat digunakan untuk menguji/identifikasi antibodi dan menghitung titer antibodinya dan menguji jenis antigen, Namun bila kita akan melakukan uji antigen dengan metode ini maka harus melakukan uji HA terlebih dahulu untuk membuat virus standarnya. Pada metode β yang diencerkan adalah antibodinya (serum) sedangkan virusnya dalam jumlah tetap. Uji HI dapat dilakukan secara makro atau mikro titrasi tergantung volume reagenreagen yang digunakan. Pada uji HI mikro titrasi hanya menggunakan masing- masing reagen sebanyak 0,025 ml atau 0,050 ml. menggunakan reagen masing-masing volumenya 0,5 ml. Pada uji HI makrotitrasi Uji HI Makrotitrasi untuk identifikasi Virus (metode Alpha) Bahan dan alat: a. Virus (hasil panen cairan alantois yang telah dipooling dan dibuat dalam satuan 50 HAU/ml) b. Serum kebal ND (antibodi standar) c. Suspensi sel darah merah ayam 1% d. NaCl fisiologis (0,85%) e. Tabung-tabung reaksi f. Pipet 1 ml dan 5 ml g. Rak tabung reaksi Cara Kerja: A. Uji HI makro titrasi 1. Tempatkan tabung reaksi sebanyak 6 buah pada rak tabung. Beri tanda urutan nomor 1-6 pada tabung tersebut. Dengan menggunakan pipet 5 ml, masukkan 0,8 ml NaCl fisiologis pada tabung pertama dan 0,5 ml pada tabung ke-2 sampai 5, lalu sebanyak 1 ml dimasukan pada tabung ke 6. 2. Dengan pipet 1 ml ambil 0,2 ml cairan alantois yang akan diuji dan masukkan ke dalam tabung pertama. 3. Lakukan pencampuran suspensi virus dengan NaCl pada tabung pertama dengan cara menghisap dan meniup cairan tersebut. Lakukan cara ini paling tidak lima kali (jangan sampai berbuih). 4. Ambil 0,5 ml dari tabung pertama kemudian pindahkan ke tabung 2 dan lakukan pencampuran seperti langkah no. 3. Selanjutnya pindahkan 0,5 ml dari tabung 2 ke tabung 3 dan lakukan pencampuran, begitu seterusnya sampai tabung 5. Dari tabung 5 diambil 0,5 ml dan dibuang, yakni bersama pipet ditempatkan ke wadah dekontaminasi. 5. Tambahkan 0,5 ml serum standar pada tabung 2 sampai tabung ke 6 menggunakan pipet 1 ml yang baru. Tabung ke-1 digunakan sebagai kontrol negatif uji (terjadi aglutinasi) sedangkan tabung ke-6 sebagai kontrol positif uji (terjadi pengendapan RBC/tear drop). 6. Tambahkan 0,5 ml NaCl fisiologis pada tabung ke-1 untuk menyamakan volume menjadi 1 ml. Adakan pengocokan dengan menggoyang-goyangkan rak, lalu diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit. 7. Selanjutnya suspensi sel darah merah 1 % ditambahkan ke dalam seluruh tabung menggunakan pipet 5 ml yang sebelumnya sudah digunakan untuk NaCl. 8. Kocok tabung dengan menggoyang-goyangkan rak, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama kurang lebih 30 menit. Kemudian baca hasilnya. Tabel 1. Diagram uji HI makro titrasi. Reagen (ml) Tabung 1 2 3 4 5 6 NaCl fis. 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 1 Cairan 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 alantois dibuang 50 HAU/ml Serum - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - - - - - standar ND NaCl fis. Kocok dan diamkan selama 30 menit suhu ruang RBC 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Kocok dan diamkan selama 30 menit suhu ruang Hasil K(-) ? ? ? Keterangan: + = tidak ada aglutinasi ? K(+) -= ada aglutinasi Pembacaan hasil uji dapat dilakukan apabila eritrosit pada tabung kontrol positif uji (tabung 6) telah mengendap ke dasar tabung (tidak terjadi aglutinasi). Hasil dikatakan positif bila tidak terjadi aglutinasi yang komplit dari sel darah merah yakni tampak adanya pengendapan/bentuk tear drop dengan cara memiringkan rak yang berisi tabung. B. Uji Haemaglutinasi Inhibisi (HI test) untuk identifikasi antibodi dan perhitungan titer dengan metode Beta Praktikum metode beta telah dipelajari melalui video pembelajaran prosedur uji HI untuk identifikasi antibodi AI dari OIE. C. Perhitungan rata-rata titer antibodi dengan Geometric Mean Titer (GMT) Titer antibodi yang diperoleh dari uji HI metode beta kemudian dihitung rataannya pada suatu populasi dan dinyatakan dalam Geometric Mean Titer (GMT) dengan rumus : GMT = rataan log 10 titer = (log10 t l)(S1) + (log10 t2)(S2) + ... + (log10tn)(Sn) N Keterangan: N = jumlah contoh serum yang diamati t = tinggi titer antibodi pada pengenceran tertinggi S = jumlah contoh serum yang bertiter t n = titer antibodi pada sampel ke-n Contoh soal: Pada sebuah peternakan ayam telah dilakukan vaksinasi ND. Untuk menguji keberhasilan vaksinasi dilakukan pengujian titer antibodi dengan mengambil sampel serum 2 minggu setelah vaksinasi dari sebuah flok sebanyak 10 sampel. Hasil uji HI metode beta diperoleh titer antibodi terhadap ND sebagai berikut: No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Titer 10 20 10 40 80 5 5 0 40 10 Ditanyakan :- berapakah rataan titer antibodi terhadap ND? Berdasarkan rataan tersebut apakah vaksinasi ND yang telah dilakukan berhasil menginduksi kekebalan protektif di kandang tersebut? Jawab : No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Titer 8 16 8 32 64 4 4 0 32 8 Log 3 4 3 5 6 2 2 0 5 3 10 titer GMT = rataan 2 log titer = (log2 t l)(S1) + (log2 t2)(S2) + ... + (log2tn)(Sn) N = (0 x 1) + (2 x 2) + (3 x 3) + (4 x 1) + (5 x 2) + (6 x 1) 10 = 33/10 = 3,3 Berdasarkan rataan titer antibodi (GMT) sebanyak 3,3 maka vaksinasi yang telah dilakukan tidak berhasil menginduksi kekebalan karena titer antibodi kelompok tersebut dibawah titer minimal dikatakan kebal yaitu 4 log2 (GMT 16) Nama : …………………………………………………………………….. NPM : …………………………………………………………………….. TUGAS PRAKTIKUM VII 1. Hitunglah rataan titer antibodi GMT avian influenza dari sebuah peternakan ayam dengan populasi 20. Apakah vaksinasi AI yang telah dilakukan dapat dikatakan berhasil menginduksi antibodi protektif pada peternakan tersebut, bila minimal antibodi protektif adalah 4 log2 (GMT 16)? No. Titer No. Titer 1 32 11 4 2 128 12 8 3 64 13 64 4 128 14 32 5 512 15 128 6 16 16 0 7 64 17 512 8 0 18 128 9 32 19 8 10 32 20 8
