LAPORAN PRAKTIKUM KULTUR JARINGAN STERILISASI ALAT oleh Rita Nurhasanah 181810401020 Kultur Jaringan AP LABORATORIUM ZOOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2020 I. Tinjauan Pustaka Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap (Sany, 2007). Sterilisasi merupakan hal yang erat dengan pembuatan medium isolasi dan pembiakan mikroorganisme secara murni. Pengertian umum sterilisisasi adalah suatu proses yang berusaha membebaskan bahan atau alat dari mikroorganisme. Namun perlu diketahui bahwa bahan atau alat yang telah melalui proses sterilisasi tidak akan benar-benar bebas dari mikroorganisme. Tujuan utama sterilisasi adalah untuk meminimalkan gangguan oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki (kontaminan), sekaligus meminimalkan gangguan akibat proses sterilisasi itu sendiri sekecil mungkin (Sany, 2007). Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi) (Hadioetomo, 1985). Sebelum dilakukan sterilisasi, pada tahap persiapan alat-alat yang akan digunakan semua peralatan dicuci bersih dengan menggunakan detergen dan larutan pemutih sampai bersih, dan membilasnya sampai bersih. Setelah dibersihkan kemudian alat-alat disterilisasi menggunakan oven atau autoclave. Bahan-bahan yang dapat disterilkan dengan menggunakan Autoclave antara lain tutup botol plastik, peralatan gelas, peralatan diseksi, pipet, air murni, dan media kultur. Semua peralatan diseksi yang akan di sterilkan dibungkus dengan kertas atau aluminium foil. Setelah itu mengatur Autoclave dengan suhu 121°C dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Untuk peralatan yang tebuat dari logam, wadah-wadah, gelas, aluminium foil dan lainnya dapat disterilisasi dengan cara pemanasan dalam oven pada suhu 130-170°C selama 2-4 jam (Tuhuteru, 2012). II. Pembahasan Macam-macam sterilisasi (Machmud, 2008) pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan kimiawi. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005). Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran. Contoh sterilisasi dengan pemanasan adalah a) Pemijaran (dengan api langsung) : membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll. b) Panas kering : Beberapa bahan yang tidak dapat disterilkan dengan uap, paling baik disterilkan dengan panas kering. Misalnya petrolatum jelly, minyak mineral, lilin, wax, serbuk talk. Sterilisasi panas kering membutuhkan pemaparan pada suhu 150°C sampai 170°C selama 1-4 jam. Alat yang digunakan pada umumnya adalah oven. c) Uap air panas : konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. d) Uap air panas bertekanan: Sterilisasi uap menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Biasanya alat yang digunakan ialah Autoclave . Contoh sterilisasi dengan penyinaran adalah dengan penyinaran dengan UV Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet dengan disinari lampu UV. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara lain H2SO4, larutan alkohol, larutan formalin (Machmud, 2008). Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun spora. Untuk sterilisasi alat dan medium digunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan (Fardiaz, 1992). Gambar 1. Autoclave (Sumber : m.kaskus.co.id ) Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang tahan terhadap panas dan untuk sterilisasi aquades dengan suhu 121°C selama 30 menit sedangkan untuk alat yang tidak tahan terhadap panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. Begitu juga dengan media yang akan digunakan juga harus disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan Autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit (Fitri, 2012). Hal yang harus diperhatikan bila mengerjakan sterilisasi menggunakan Autoclave adalah: harus ditunggu selama bekerja, hati- hati bila mengurangi tekanan dalam Autoclave (perubahan temperatur dan tekanan secara mendadak dapat menyebabkan cairan yang disterilkan meletus dan gelas-gelas dapat pecah) (Putranto, 2014). Autoclave bekerja berdasarkan prinsip tekanan panas uap air. Beberapa mikroba akan mati apabila berada pada kondisi lingkungan panas tinggi, tetapi ada pula mikroba yang masih bisa hidup pada kondisi lingkungan yang ekstrim seperti mampu hidup di lingkungan yang suhunya tinggi. Autoclave digunakan pada tekanan 17,5 psi dan suhu 120°C (Gabriel, 1988). Cara Kerja Autoclave antara lain : 1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam Autoclave . Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. 2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan, 3. Tutup Autoclave dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada udara yang keluar dari bibir Autoclave . Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. 4. Atur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121°C, kemudian nyalakan Autoclave . 5. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen Autoclave dan terdesak keluar klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Perhitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. 6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol. Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi Autoclave dengan hati-hati Gambar 2. Laminar air flow (Sumber : robust-chemical.com) Laminar air flow (LAF) merupakan lemari yang digunakan sebagai tempat ketika akan melakukan penanaman eksplan dalam kultur jaringan. Menurut Sriyanti dan Ari Wijayani (2012) prinsip kerja dari Laminar air flow ini adalah dengan mengalirkan arus udara yang laminair ke dalam almari penabur melalui saringan yang besar dengan ukuran mesh 0,22-0,24 mikron. Bakteri dan jamur ditahan oleh saringan ini, sehingga udara yang masuk kedalam Laminar air flow sudah steril dan membuat ruangan menjadi steril pula. Sama seperti peralatan yang lainnya, Laminar air flow pun harus melalui tahap sterilisasi. Laminar air flow terlebih dahulu disemprot dengan alkohol 70 % di bagian dalamnya. Setelah sterilisasi dengan alkohol, pintu Laminar air flow ditutup dan lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama ½ sampai 1 jam. Setelah sterilisasi dengan lampu ultraviolet (UV) pekerjaan dapat segera dimulai. Gambar 3. Hot air oven (Sumber : blogs.uajy.ac.id ) Hot air oven merupakan alat yang digunakan untuk proses sterilisasi menggunakan uap panas kering. Protein mikroba akan mengalami dehidrasi hingga terjadi kekeringan, selanjutnya teroksidasi oleh oksigen di udara sehingga menyebabkan matinya mikroba. Sterilisasi dengan metode ini digunakan untuk benda-benda dari kaca/gelas, petri, tabung Erlenmeyer, tidak boleh bahan yang terbuat dari karet atau plastic. Oven Suhu 160-180°C selama 1,5-3 jam. Alat-alat tersebut terlebih dahulu dibungkus menggunakan kertas sebelum dilakukan sterilisasi (Tille, 2017). Sterilisasi dengan bahan kimia yaitu bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Alkohol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan (Sarwono, 2005). Cairan lain yang umumnya digunakan untuk sterilisasi adalah hidrogen peroksida (H2O2) dalam bentuk aerosol. Hidrogen peroksida adalah senyawa kimia yang ditemukan di alam dalam bentuk cair dan fungsi utamanya adalah sebagai oksidator. Senyawa kimia ini lebih banyak digunakan sebagai bahan untuk sterilisasi dalam industri farmasi karena sifatnya yang lebih ramah lingkungan dan tidak meninggalkan residu yang menempel pada ruangan maupun yang ada di udara bebas. Senyawa kimia ini digunakan untuk memusnahkan bakteria vegetatif, spora, jamur, dan juga virus hingga tingkat 6-log yang merupakan tingkat standar sterilisasi pada industri farmasi. III. Kesimpulan Kesimpulan yang didapat setelah melakukan praktikum sterilisasi ini adalah : 1. Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan suatu media atau bahan dari mikroorganisme yang beru bakteri dan bahan renik lainnya. 2. Sterilisasi dibagi menjadi 3 yaitu sterilisasi mekanik dengan penyaringan, sterilisasi fisik dengan pemanasan & penyinaran, dan sterilisasi kimia dengan senyawa desinfektan antara lain H2SO4, larutan alkohol 70%. 3. Alat yang digunakan dalam praktikum sterilisasi adalah Autoclave, Laminar air flow, dan Hot air oven DAFTAR PUSTAKA Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Fitri, M. Satria, Zairin Thomy, dan Essy Harnelly. 2012. In-Vitro Effect of Combined Indole Butyric Acid (IBA) and Benzil Amino Purine (BAP) on the Planlet Growth of Jatropa curcas L. Jurnal Natural Vol. 12, No. 1. Gabriel, J. F., 1988. Fisika Kedokteran. EGC. Jakarta. Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT.Gramedia: Jakarta. Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor. Putranto, R.H. 2014. Corynebacterium diphtheriae Diagnosis Laboratorium Bakteriologi. Jakarta : Yayasan Pustaka Obor Indonesia Sany. 2007. Pembiakan Tanaman Melalui Kultur Jaringan. Jakarta: Gramedia. Sarwono Prawihardjo Waluyo, Lud. 2005. Mikrobiologi Umum. Malang :UMM Press Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2012. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius, Yogyakarta. Suriawiria,Unus.1986.Buku Materi Pokok Mikrobiologi Modul 1-9. Jakarta : Karunika Tille, P. M. 2017. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. In Basic Medical Microbiology (fourteenth, p. 45). St. Louis Missouri: Elsevier. Tuhuteru, S., M. L. Hehanussa, S. H. T. Raharjo. 2010. Pertumbuhan dan Perkembangan Anggrek Dendrobium anosmum pada Media Kultur In-Vitro dengan Beberapa Konsentrasi Air Kelapa. Agrologia, Vol. 1, No. 1, (1-12).
