BIOTEK KULTUR JARINGAN A. Kultur Jaringan Tumbuhan Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian-bagian tanaman seperti sel, jaringan, atau organ serta menumbuhkannya secara aseptis (bebas hama) di dalam atau di atas suatu medium budidaya. Kelebihan : 1. Mempunyai sifat yg sama dengan induknya 2. Masa generatif dicapai lebih cepat 3. Menghasilkan bibit dalam jumlah besar dan sifat seragam dan waktu relatif cepat 4. Tidak dibatasi waktu, tempat dan musim 5. Memperbanyak tanaman yg sulit diperbanyak scr generatif 6. Tingkat propagasi jauh lebih tinggi 7. Menghasilkan tanaman bebas virus 8. Cepat mendpat metabolit sekunder Kekurangan : 1. Bibit hasil kultur rentan thdp penyakit dan udara luar 2. Butuh modal yg tinggi 3. Butuh SDM yang handal TOTIPOTENSI = Kemampuan sel u/ menjadi individu baru jika berada dilingkungan yg sesuai. Sel tumbuhan mampu untuk : 1. De-deffitentiate – terbentuk kalus / callus 2. Re-deffitentiate – mjd organ2 pd tumbuhan Callus : Suatu kumpulan sel amorphous yang terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Callus terbentuk o/ ZPT auksin dan sitokinin Auksin – pertumbuhan ke arah bawah Sitokinin – pertumbuhan ke arah atas TAHAPAN KULTUR JARINGAN 1. Sterilisasi – membuat media yg steril dan sterilisasi alat 2. Inisiasi - pengambilan eksplan dr tanamna yg akan dikulturkan 3. Subkultur / Multiplikasi – memperbanyak calon tanaman dg menanam tanaman pd media. Kegiatan ini dilakukan di LAF. 4. Pengakaran – eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar 5. Aklimatisasi – kegiatan memindahkan eksplan ke luar dari ruang aseptik ke media tumbuh. B. Laboraturium Kultur Jaringan Laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi mudah saling berhubungan dan mudah dicapai. Utamanya terdiri dari: - Dilengkapi dengan: 1. Ruang preparasi 1. Ruang media 2. Ruang Transfer 2. Ruang timbang 3. Ruang Kultur 3. Ruang alat dan bahan Ruang Persiapan Untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium. Alat – alat yang ada di ruangan ini ph meter, autoklaf,oven, magnetic stirer dna hot plate, timbangan, kompor. Ruang Alat dan Bahan Terdapat alat dan bahan yang tersedia untuk kultur jaringan. Ruang Media Ruang media adalah ruang tempat media yang telah siap dan sudah disterilisasi Ruang transfer Merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media. Ruang Kultur Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC, dengan fluktuasi kurang dari ±0.5oC; akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10.000 lux. Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar 20-98%. • Sterilisasi Ruang Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Sterilisasi Alat Sterilisasi Basah = autoklaf, suhu 121, waktu 15- 20 menit, u/ alat dan bahan yg tidak tahan panas Sterilisasi Kering = oven, suhu 130°-170°C selama 2-4 jam, u/ alat dan bahan yg tahan panas C. Media Kultur Media adalah nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhan tumbuhan dalam kultur jaringan. Fungsi Media : 1. Menyediakan air 2. Menyediakan kebutuhan mineral dan nutrisi 3. Mneyediakan vitamin 4. Menyediakan ZPT 5. Menyediakan asam amino 6. Menyediakan gula 7. Pertukaran gas dlm kultur jaringan 8. Membuang produk metabolit yg tdk dibutukan Bentuk Fisik Media : 1. Media Padat - Diberi tambahan bahan pemadat (agar) 2. Media Cair – Tidak diberi tambahan bahan pemadat Kandungan Media : 1. Media mengandung garam anorganik - Makronutrient, nutrisi utama tumbuhan, disediakan dari garam anorganik yang di absorb tumbuhan dalam bentuk ionnya, langkah paling penitng dalam pembuatan media adalah memastikan komposisi dan konsentrasi makromolekulnya seimbang. a. Carbon (C) Hampir semua tidak dapat bertahan tanpa CO2. Oleh karena itu, ditambahkan gula sebagai sumber energi. Sukrosa adalah gula yang umum ditambahkan, konsentrasinya 20 – 40 g/l. - Gula juga berperan dalam regulasi osmotik. Adanya sukrosa dapat menghambat pembentukan klorofil dan fotosintesis. b. Nitrogen (N) Salah satu komponen essensial dalam tumbuhan. Morfogenesis dan pertumbuahna tanmaan dipengaruhi oleh adanya nitrogen. Banyak media yang mengandung nitrat lebih banyak drpd amon ion ammonium. Ammonium dalam konsentrasi tinggi menyebbkan latent toxic. c. Potassium (K) Berkontribusi dalam osmotik sel. Secara cepat ditransport sepanjang membran sel . Dua funsgi utama dari potassium adalah untuk regulasi Ph dan tekanan osmotik.Bnaya proteion yang menunjukkan tingginya potassium yg berperan sbg kofaktor dan menjadi co-enzyme. Potassum juga dapat menetralisir anion organik yg d hasilkan sitoplasma dan menstabilkan ph, potensial osmotik sel. d. Hydrogen (H) e. Calcium (Ca) Membantu keseimbangan anion dlm tumbuhan. Meruapakn kofaktor enzim u/ hidrolisis ATP. It is involved in the structure and physiologically properties of cell membranes and the middle lamella of the cell walls. The enzyme -(1-3)-glucan synthase depends on calcium ion. f. Phosphorus (P) Komponen utama dlm plant bochemistry, banyak trdpt pd makromolekul spt asam nukleat,fosfolipid dan co-enzim. Transfer energy via fosfat dan ikatan ATP. g. Oxygen (O) h. Magnesium (Mg) Komponen esensial dalam molekul klorofil, dapat juga sebagai aktivitas banyak enzim, khususnya u/ transfer fosfat. i. Sulphure (S) Umumnya di absorbsi sebagai sulfat. It is incorporated into chemical compounds mainly as reduced –SH, -S_ or –S-S groups. It is used in lipid synthesis and in regulating the structure of proline through the formation of S-S bridges. It acts as a ligan amd joining ion of iron, zinc, copper to metalloportein and enzymes. Mikronutrient – dpt meningkatkan pertumbuhan callus dan kultur akar a. Iron (Fe) b. Chlorine (Cl) – growth, fotosistem 2, osmo regulasi stomata c. Manganese (Mn) d. Zinc (Zn) e. Copper (Cu) f. Nickel (Ni) g. Sodium (Na) – salt tolerance plant h. Boron (B) i. Molybdenum (Mo) j. Asam Amino - Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan diferensiasi kalus
