BAB 1 LATAR BELAKANG Senyawa amphetaminic dianggap sebagai stimulan kuat untuk sistem saraf pusat. Senyawa amphetaminic paling umum tersedia adalah amfetamin (AM) dan metamfetamin (MA) yang sering digunakan oleh atlet, pecandu narkoba dan pengguna rekreasi seperti penyalahgunaan obat. Senyawa ini juga digunakan untuk mengobati depresi ringan, obesitas, dan narkolepsi. derivatif metilendioksi dari AM dan MA seperti 3,4methylenedioxyamphetamine (MDA) dan 3,4methylenedioxy methamphetamine (MDMA) juga digunakan sebagai obat penyalahgunaan untuk meningkatkan sosialisasi dan membebaskan hambatan yang memungkinkan pengguna untuk pengalaman perasaan euforia. Untuk menganalisis AM, MA, dan stimulan yang terkait dalam sampel biologis dengan menggunakan berbagai metode analisis seperti kromatografi gas (GC), Kinerja tinggi kromatografi cair (HPLC), Kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), Spektrometri massa kromatografi cair (LC-MS atau LC-MS / MS), Dan kapiler. Di antara metode ini, GC-MS secara luas digunakan metode analisis karena sensitivitas dan selektivitas dan kemudahan kation identiï¬ senyawa dari spektrum massa sementara GC dan GC-MS umumnya perlu derivatisasi sebelum menganalisis dalam rangka meningkatkan sifat kromatografi dan mendapatkan pola fragmentasi massa yang lebih tinggi dalam aplikasi MS. Dalam rangka untuk mencapai yang cepat, sederhana dan metode yang dapat diandalkan untuk analisis senyawa amphetaminic seperti AM, MA, dan turunannya methylenedioxy mereka dalam sampel biologis, perlu untuk meningkatkan metode persiapan sampel secara substansial. Dalam hal ini, banyak perhatian telah dibayarkan kepada sampel bersih-bersih biologis melalui menerapkan beberapa metode seperti Liquida “ekstraksi cair dan ekstraksi fase padat sementara metode ini terbatas karena memakan waktu, memerlukan volume besar sampel dan pelarut, dan memerlukan instrumen tambahan untuk otomatisasi. Pawliszyn dan rekan kerja mengembangkan metode ekstraksi, fase padat microextraction (SPME) yang telah banyak digunakan untuk sampel biologis bersih-bersih. Dalam tulisan ini, kami melaporkan cepat, sederhana dan metode yang dapat diandalkan untuk penentuan simultan obat amphetaminic senyawa seperti AM, MA, dan turunannya methylenedioxy mereka yaitu, MDA, MDMA dalam urin menggunakan headspace DBDI ditambah metode MS. Senyawa amphetaminic adalah senyawa alifatik amina bantalan sekunder dan eksis sebagai bentuk hidroklorida dalam tablet obat. Molekul-molekul amphetaminic basa bebas yaitu, AM, MA yang tidak stabil. Derivatif methylenedioxy yaitu, MDA, MDMA adalah semivolatile dan / atau kurang volatile di alam. Oleh karena itu perlakuan alkali melalui metode headspace bisa menjadi pendekatan yang lebih baik untuk menganalisis senyawa obat ini dari urin manusia. Dalam larutan alkali, hidroklorida-bentuk senyawa obat amphetaminic menguapkan ke fase gas sebagai amina basa bebas dan kemudian terionisasi oleh helium sumber ion DBD buatan sendiri sebelum memperkenalkan ke detektor MS. Karbonat solusi alkali.Telah menunjukkan LODs lebih baik untuk empat senyawa amphetaminic dibandingkan dengan solusi alkali non-karbonat (misalnya, KOH). Penggunaan amonia meningkatkan sensitivitas deteksi untuk kedua solusi alkali. BAB II METODE PENELITIAN 2.1 Alat dan Bahan Amphetamine, methamphetamine, 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) and 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), larutan standar, sampel urin, sodium hydroxide, sodium chloride, sodium carbonate, potassium hydroxide, potassium chloride, potassium carbonate and aqueous ammonia (28– 30%), Vial headspace 5 mL 2.2 Prosedur 2.2.1 Preparasi sampel Konesntrasi dari Amphetamine dan Methamphetamine adalah 10 μ g/mL dan untuk MDA dan MDMA adalah 20 μg/mL. Masing-masing dari senuyawa obat ini dilarutkan dalam air dan disimpan dalam lemari es bersuhu 10°C. Sampel urin diambil 10 μL dari 100 μg/mL dan di tambahkan kedalam masing-masing senyawa obat. Masing-masing sampel diambil sebanyak 5 ml dan dimasukkan kedalam vial. Kemudian, masing-masing sampel ditambahkan larutan alkali ammonia 100 μL. Vial ditutup dan disimpan selama 6-7 menit untuk melepaskan basa pada senyawa amina amfetamin. Setelah 6-7 menit, vial dibuka dan sampel dapat dideteksi dengan spektrofotometer massa dengan sumber ion Dielectric Barrier Discharge (DCD) 2.2.2 Tahapan experiment Sumber ion Dielectric Barrier Discharge (DCD) ditempatkan didepan inelt spektrofotometer massa. Tegangan radioofrequency (RF) 15 kHz dengan 3,0 kV (Vpp) diaplikasikan pada elektroda luar, yang bertujuan untuk menghasilkan helium dengan laju alir 250 mL selama 1 menit. Vial sampel di buka dan disimpan diantara tempat masukknya spektrofotometer massa dan sumber ion Dielectric Barrier Discharge (DCD), sehingga molekul amfetamin terionisasi dan ion-ion tersebut akan terdeteksi oleh spektrofotometer massa. Selanjutnya, data yang didapat diolah dengan menggunakan perangkat lunak Xcalibur. BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Analisis obat amphetaminic senyawa dalam air Analisis menurut penelitian sebelumnya, proses analisi senyawa amfetamin dilakukan dengan derivatisasi senyawa amina dengan metode headspace-SPME dan tambahan instrumen HPLC/ GC/LC-MC. Metode SPME dapat dilakukan untuk senyawa analit yang sulit menguap dan terpisah dar matriks yang komplek. Metode head space terbukti sebagai metode adsorpsi yang sangat efisien untuk senyawa target amfetamin yang di ambil dari sampel biologis yaitu cairan/ urin manusia dengan penambahan alkali. DBD (sumber ion) dibuat untuk mengionisasi molekul amfetamin yang menguap bebas tanpa proses derivatisasi terlebih dahulu. Teknik yang cocok untuk membentuk DBD adalag teknik Tekanan Ionisasi Atmosfer, DBD memiliki kemampuan ionsasi yang halus, terbuat dari berbagai senyawa dan helium. Senyawa amphetaminic yang menguap dari larutan standar mereka (masing-masing amphetaminic senyawa 1 ng dalam air) pada penambahan volume yang sama dari solusi K2CO3 ammoniated dan kemudian terionisasi oleh sumber ion DBD buatan sendiri sebelum memperkenalkan ke MS. Seperti yang ditunjukkan dari Gambar. 2a-d, empat molekul amphetaminic bentuk terprotonasi ion molekul, (M + H) +. MA menunjukkan intensitas tertinggi (1.99E5) (M + H) + puncak pada m / z = 150 yang sedikit lebih tinggi dari itu untuk AM (1.38E5) (m / z = 136). Hal ini wajar karena proton afinitas yang lebih tinggi nya (PA) dari MA (965 kJ / mol) dibandingkan AM meskipun tekanan uap AM (3.07E-1 mm Hg) yang cukup tinggi dibandingkan dengan MA (5.40E -3 mm Hg). Di sisi lain, ion molekul terprotonasi, (M + H) +, MDA (m / z = 180) dan MDMA (m / z = 194) yang muncul dengan intensitas yang relatif rendah (MDA: 4.48E3; MDMA: 1.57E4). Meskipun PA dari MDMA adalah lebih tinggi dari MA (965 kJ / mol) dan PA untuk MDA adalah lebih tinggi dari AM tetapi tekanan uap dari dua derivatif methylenedioxy ini relatif lebih rendah (MDA: 1.0E-3 mm Hg; MDMA : 1. 6E-3 mm Hg) dibandingkan dengan AM dan MA, ini bisa menjadi alasan intensitas yang lebih rendah dari puncak mereka terprotonasi dalam spektrum massa. Seperti ditunjukkan dari Gambar 3, dalam analisis simultan dari empat senyawa amphetaminic dalam air pada penambahan ammoniated solusi K2CO3 (K2CO3 (4M): NH3 (28%) = 85:15. Jumlah masing-masing senyawa 1 ng / mL , baik AM dan MA telah menunjukkan dominan puncak ion molekul terprotonasi, (M + H) + (kelimpahan relatif (RA): 1.58E5), namun MDA dan MDMA juga menunjukkan (M + H) + puncak tapi dengan intensitas rendah (RA untuk MDA, 3.7E3 dan RA untuk MDMA 6.13E3). Sensitivitas deteksi, alternatif batas deteksi (LOD), senyawa amphetaminic tergantung pada jenis dari larutan alkali yang digunakan. Lebih baik LOD untuk empat senyawa amphetaminic ditemukan dengan menggunakan karbonat alkali solusi yaitu, K2CO3 dan berbagai LOD adalah 0,60-3,00 ng / mL, di sisi lain, itu 2,0-5,0 ng / mL oleh non-karbonat larutan alkali (misalnya, KOH). Sensitivitas deteksi juga telah ditingkatkan dengan menggunakan larutan amonia dengan baik larutan alkali (85% (4 M larutan alkali) + 15% (28% larutan NH3). Peningkatan efek oleh larutan alkali karbonat mungkin karena pembentukan CO2 dari reaksi molekul amphetaminic hidroklorida asam dengan alkali dan CO2 insitu terbentuk bertindak sebagai gas pembawa untuk menguapkan molekul dasar amina bebas secara efektif dari fase solusi. penggunaan larutan amonia juga meningkatkan laju penguapan in the insitu membentuk molekul amphetaminic bertindak sebagai gas pembawa. LOD dari AM dan MA berada di kisaran 0,10 ke 0. 80 ng / mL dengan menggunakan Amoniasi larutan alkali karbonat sementara rentang itu 1,00-3,50 ng / mL untuk Amoniasi larutan alkali non-karbonat. Hal ini mengejutkan untuk mengamati nilai-nilai LOD miskin dengan Amoniasi noncarbonate larutan alkali meskipun NH3 bertindak sebagai gas pembawa untuk molekul amphetaminic basa bebas. Di samping peran CO2 sebagai gas pembawa, pembentukan in-situ CO2 memainkan peran penting untuk LOD lebih baik dengan menggunakan solusi karbonat-alkali. Hal ini karena pembentukan in-situ CO2 mungkin membantu untuk menguapkan dasar molekul amphetaminic bebas sebagai kondisi in-situ dan kemudian mereka keluar untuk fase gas oleh CO2 dan / atau NH3. Penyangga sifat dari larutan alkali karbonat juga mungkin memainkan peran untuk nilai-nilai LOD yang lebih baik. 3.2 Analisis Senyawa Amphetaminic dalam Sampel Urin Pada percobaan ini, kami menemukan LODs lebih baik untuk empat senyawa amphetaminic dalam urin dalam rentang 0,04-0,40 ng / mL pada penambahan Amoniasi larutan alkali karbonat dibandingkan dengan solusi standar mereka (0,10-0,80 ng / mL). AM dan MA menunjukkan LODs lebih baik dibandingkan dengan MDA dan MDMA dalam urin. Gambar 3.1 Spektrum massa (a) AM, (b) MA, (c) MDA dan (d) MDMA dengan menggunakan headspace-DBDI-MS. Jumlah setiap senyawa obat adalah 1 ng / mL dalam air sebagai standar dan diperlakukan dengan volume yang sama dari larutan K2CO3 amoniasi [85% K2CO3 (4 M) + 15% NH3 (28%)]. Gambar 3.2 Spektrum massa dari campuran AM, MA, MDA dan MDMA dengan menggunakan headspace-DBDI-MS. Jumlah setiap senyawa obat adalah 1 ng / mL dalam air sebagai standar dan diperlakukan dengan volume yang sama dari larutan K2CO3 amoniasi [85% K2CO3 (4 M) + 15% NH3 (28%)]. Dalam percobaan ini, urine manusia dibubuhi standar empat senyawa amphetaminic secara terpisah dan dicampur dengan volume yang sama dari larutan alkali untuk menguapkan molekul amphetaminic basa bebas. Spektrum massa AM, MA, MDA dan MDMA yang diekstraksi dari solusi berduri urine pada penambahan volume yang sama dari solusi K2CO3 ammonia (jumlah masing-masing senyawa amfetamin adalah 1 ng / mL). AM dan MA telah menunjukkan ion molekul terprotonasi (M + H) +, sebagai puncak dasar pada m / z = 86 yang muncul dari urin. Puncak berasal dari fragmentasi kreatinin melalui hilangnya netral CO. Sinyal ion kuat pada m / z = 86 dapat menekan ion-ion lain yang mungkin juga berasal dari urin misalnya, urea terprotonasi dan kreatinin dan dimer terprotonasinya, dll. Kelimpahan relatif (RA) dari (M + H) + puncak untuk AM dan MA adalah masing-masing 2,2 dan 3,78E5, yang 1,63 dan 1,90 kali lebih tinggi dibandingkan dengan mereka untuk solusi standar. Dalam kasus MDA dan MDMA, kami menemukan sekitar 1,38 kali kelimpahan relatif lebih tinggi untuk (M + H) + puncak dalam urin dibandingkan dengan yang ada di air. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa reaksi in-situ setelah penambahan larutan alkali dalam urin bertanggung jawab untuk peningkatan sensitivitas deteksi senyawa amfetamin. Dalam reaksi in-situ, molekul amfetamin basa bebas dan CO2 terbentuk dari reaksi antara senyawa amfetamin hidroklorida dan molekul alkali berkarbonasi. Selain itu, senyawa urin jenis amina (mis., Urea, kreatinin, dll.) Juga terbentuk setelah penambahan larutan alkali. Reaksi di antara komponenkomponen kimia yang disebutkan di atas dalam in-situ membantu pelepasan molekul amfetamin bebas basa semi-volatil bebas yang terbentuk secara efektif. Ini bisa menjadi alasan untuk sensitivitas tinggi dari senyawa obat amfetamin dengan metode alkali headspace-DBDI-MS. 3.3 Validasi metode Dalam rangka untuk mengetahui kemampuan kuantitatif dari metode ini dan aplikasi praktis dalam dunia nyata, beberapa faktor, misalnya, batas deteksi (LOD), presisi, rentang linier, korelasi co-efisien linearitas (R2) , dan tingkat pemulihan analit yang diperhitungkan. Puncak intensitas digunakan untuk evaluasi parameter kuantitatif. Pada tingkat LOD, masing-masing analit menunjukkan sinyal untuk rasio kebisingan minimal 3 (S / N = 3). Anehnya, setidaknya satu urutan besarnya LODs rendah direalisasikan untuk sampel urin dibandingkan dengan solusi standar yang sesuai (Tabel 1 dan 2). Untuk sensitivitas yang lebih baik ini, salah satu alasan yang mungkin bisa di-situ reaksi antara senyawa amphetaminic hidroklorida dan / atau komponen urine dengan alkali yang nikmat untuk menguapkan molekul dasar amina bebas terbentuk dari fase solusi. Pembentukan in-situ CO2 dan senyawa volatil dari urin setelah penambahan larutan alkali berkarbonasi bisa menjadi alasan lain untuk LODs yang lebih baik dalam urin. Ketepatan metode ini dinyatakan dalam persentase relatif standar deviasi (% RSD). The% RSD dihitung pada batas kuantitasi (LOQ) dari analit, di mana konsentrasi LOQ terpilih sebagai tiga kali dari tingkat LOD untuk masing-masing senyawa amphetaminic. Tiga analisis ulangan menunjukkan 14% nilai RSD untuk standar amphetaminic solusi senyawa sedangkan untuk urin berduri ini naik ke 7,89%. The in-situ reaksi dalam urin dan pembentukan CO2 dan / atau komponen yang mudah menguap dari urine bisa menjadi% lebih rendah nilai RSD untuk sampel urin dibandingkan dengan sampel standar yang sesuai. Linearitas dari metode ini dievaluasi dalam berbagai konsentrasi 0,04-20 ng / mL untuk AM dan MA dan 0,20-30 ng / mL untuk MDA dan MDMA. Serangkaian solusi yang disiapkan untuk masing-masing senyawa amphetaminic menggunakan standar internal untuk membuat kurva kalibrasi. Konsentrasi fix (5 ng / mL) dari standar internal berduri di setiap solusi dan konsentrasi senyawa target bervariasi. Kurva kalibrasi linear yang dihasilkan dengan memplot faktor respon terhadap konsentrasi senyawa amphetaminic sasaran di mana faktor respon dihitung sebagai rasio intensitas senyawa target dan standar internal pada setiap tingkat konsentrasi. 9-titik kurva kalibrasi menunjukkan linearitas yang baik untuk semua senyawa amphetaminic dengan korelasi co-efficients, R2 = 0,999 (Gambar. S1, Pendukung Informasi). Pemulihan metode ini ditentukan dengan spiking konsentrasi memperbaiki larutan standar (10 ng / mL) dan standar internal (5 ng / mL) ke urin dan menghitung jumlah dari kurva kalibrasi standar. Persentase pemulihan yang cukup tinggi (dari 94% menjadi 99%) untuk senyawa dipelajari dari urin (Tabel 2). Tingkat pemulihan tinggi wajar karena reaksi in-situ antara urine dan solusi alkali yang nikmat penguapan molekul dasar amina bebas, dan generasi CO2 dan senyawa volatil lainnya dari urin dan / atau NH3 bertindak sebagai gas pembawa untuk basa bebas senyawa amphetaminic. Gambar 3.3 Spektrum massa (a) AM, (b) MA, (c) MDA dan (d) MDMA dengan menggunakan headspace-DBDI-MS. Jumlah masing-masing senyawa obat adalah 1 ng / mL dalam urin manusia dan diperlakukan dengan volume yang sama dari larutan K2CO3 amoniasi [85% K2CO3 (4M) + 15% NH3 (28%)]. Gambar 3.4 Spektrum massa dari campuran AM, MA, MDA dan MDMA dengan menggunakan headspace-DBDI-MS. Jumlah masing-masing senyawa obat adalah 1 ng / mL dalam urin manusia dan diperlakukan dengan volume yang sama dari larutan K2CO3 amoniasi [85% K2CO3 (4M) + 15% NH3 (28%)]. BAB IV KESIMPULAN Jadi dapat disimpulkan bahwa metode ini telah terbukti efisien dan sederhana untuk digunakan dalam mendeteksi senyawa obat amfetamin dalam urin manusia tanpa adanya derivatisasi. Adapun, dalam metode ini telah menunjukkan sekitar satu urutan LOD yang lebih rendah untuk senyawa obat amfetamin dalam sampel urin manusia dibandingkan dengan larutan standar yang sesuai (senyawa dalam air). Aspek yang paling menarik dari metode baru ini adalah penguapan molekul amfetamin terjadi setelah penambahan larutan alkali dan sensitivitas ditingkatkan secara signifikan dengan menggunakan larutan alkali karbonat amoniak. Sensitivitas yang lebih tinggi dari metode ini disebabkan oleh pembentukan in-situ molekul amfetamin basa bebas, CO2 dan molekul volatil lainnya dari sampel urin termasuk NH3, CO2, dan senyawa volatil lainnya yang bertindak sebagai gas pembawa tanpa penekanan ion yang cukup besar. Sehingga, dapat diketahui bahwa pembentukan in-situ CO2 dan senyawa volatil lainnya oleh reaksi antara alkali berkarbonasi dan amfetamin hidroklorida dalam urin manusia dapat berfungsi sebagai gas pembawa yang efektif untuk sensitivitas yang lebih tinggi. Parameter validasi menunjukkan hasil yang cukup menjanjikan untuk deteksi senyawa amfetamin. Sehingga metode saat ini kemungkinan dapat menjadi alternatif yang layak dari metode GC-MS atau LCMS konvensional untuk deteksi yang cepat dan ketepatan yang tinggi dari senyawa obat berbasis amina.
