Aspek Kimiawi, Fisiologis, dan Patologis dari pH pada Kanker PENDAHULUAN ION HIDROGEN (H+/Proton) Ion yang paling reaktif dalam tubuh organisme hidup. Semua larutan biologis memiliki konsentrasi ion H+ tertentu yang muncul dari keseimbangan antara reaksi deprotonasi dan protonasi dari air, asam lemah, dan basa lemah. Keseimbangan antara ion H+ dan bentuk molekul yang tidak terprotonasi (A) dan terprotonasi (HA) digambarkan dengan disosiasi asam (Ka = [H+] x [A]/[HA]) Nilai Ka memiliki rentang cukup lebar dan, konsekuensinya, H+ dapat sangat bervariasi antar larutan yang berbeda. 1 PENDAHULUAN • • Pada pH tertentu, lokasi yang protonable dengan pKa yang sangat tinggi atau sangat rendah akan hampir seluruhnya tertitrasi atau tidak terikat. Kondisi ini memiliki peran penting, dimana: Sebaliknya Konsentrasi dari lokasi terprotonasi dan tidak terprotonasi (dalam kondisi makroskopis) akan seimbang bila pKa dekat dengan pH sekitarnya. 2. Perubahan yang menetap dalam pH akan mengubah rasio [HA]/[A], yang mungkin memiliki pengaruh sekunder bila sifat biologis HA dan A berbeda secara substansial. 1. Availabilitas HA dan A melindungi larutan (sebagai buffer) dari perubahan pH besar sebagai respon dari tantangan asam-basa. Sensitivitas protein terhadap pH memiliki pengaruh pada sel karena protein bertindak sebagai buffer pH, dan fungsinya dapat berubah secara substansial jika keadaan ionisasi diubah oleh pengikatan atau pelepasan ion H+ 2 PENDAHULUAN Jaringan hidup juga dibagi ke dalam kompartemen ruang intra- dan ekstraseluler yang dipisahkan oleh sel membran JARINGAN HIDUP Berhadapan dengan produksi/konsumsi asam (dan basa) lewat reaksi-reaksi kimia. Karena respirasi seluler, sebagian besar sel adalah penghasil asam mengingat pH intraselulernya memiliki kecenderungan untuk turun. Membran Transport Tantangan asam basa yang menetap dan substansial ini tidak dapat dikoreksi dengan buffer pH saja karena kapasitas buffer yang terbatas 3 Rendahnya tekanan O2 lingkup mikro dan pH sebagai ciri khas kanker • Gradien O2 dibuat dalam persamaan reaksi difusi steady-state, di mana DO2 adalah koefisien difusi O2 dan fungsi R menggambarkan reaksi DO2 x ∇2 [O2 ] + R([O2 ]) = 0 • Keberadaan area dengan tekanan O2 rendah (<1%) berhubungan dengan peningkatan metastasis dan tingkat survival pasien yang buruk, memberikan gagasan bahwa hipoksia merupakan ciri khas kanker yang malignan • Penemuan bahwa hipoksia mengubah sifat biologi sel (contoh via faktor HIF1α yang terinduksi hipoksia) menawarkan sebuah mekanisme terjadinya perubahan adaptif, seperti perubahan menjadi metabolisme glikolitik (pengaruh Warburg) Hipoksia tumor sejak itu menjadi topik dari banyak penelitian • Dari antara faktor-faktor lingkungan mikro lainnya yang dikenali dalam tumor, keasaman esktraseluler muncul sebagai ciri khas kanker lainnya. 4 Rendahnya tekanan O2 lingkup mikro dan pH sebagai ciri khas kanker Ditemukan dua kondisi yaitu: 1. Berbeda dengan ekspektasi awal, kompartemen intraseluler menunjukkan kondisi alkalin meskipun pH ekstraseluler rendah. 2. Selain pada tumor solid, distribusi trans-membran dari [H+] (asam di ekstraseluler/alkalin di intraseluler) tidak umum terlihat dalam jaringan. Sehingga muncul 2 pertanyaan pertama, Bagaimana tumor padat memproduksi pH rendah namun tetap mampu memelihara pH pada batas normal yang diinginkan?, dan kedua, Bagaimana distribusi pH transmembran ini mempengaruhi progresivitas penyakit? 5 Produksi dan Pelepasan Asam Metabolik SEL KANKER • Sel kanker membutuhkan masukan energi untuk mendukung pertumbuhan mereka yang intensif. Hal ini menjelaskan kecepatan penggunaan glukosa yang tinggi, diukur paling banyak pada rentang antara 0,1 – 1 μmol (g jaringan)-1menit-1 • Di bawah kondisi aerobik, respirasi glukosa terhadap CO2 dipasangkan dengan produksi ATP, yang mengonsumsi sebuah ion H+: 3ADP + HPO 4 2- 4ATP + OH 6 SEL KANKER • Gangguan asam basa ini kemudian dinetralkan oleh pemecahan ATP di tempat lain dalam sel tersebut, hasilnya, sumber keasaman dari metabolisme aerobik adalah CO2, ketika terhidrasi menjadi H+ dan ion HCO3• Di bawah kondisi anaerobik, produksi ATP glikolitik dipasangkan dengan dengan konversi kimiawi glukosa menjadi laktat anionik: Glukosa + 2 x + 2 x laktat 3ADP + 2 x HPO 4 2- 2x 4ATP 7 Reaksi ini tidak menghasilkan (atau mengkonsumsi) ion H+, mengindikasikan bahwa glikolisis sendiri pada pH netral. Namun, pemecahan ATP selanjutnya akan melepaskan ion H+, menjelaskan bagaimana metabolisme anaerobik menghasilkan asam. Bergantung pada apakah respirasi glikolitik atau mitokondria, sel kanker dapat memproduksi sekitar 13mmol . (1sel)-1menit-1 asam besarnya beban asam ini akan mengubah pHi bila tidak dikoreksi. Namun, sebagian besar sel memiliki kapasitas untuk membuang produk akhir respiratorik secara pasif melewati membran permukaan. - CO2 memiliki koefisien partisi lemak:air yang lebih tinggi, sehingga mudah untuk melewati lipid bilayer secara bebas. - Asam laktat, meskipun koefisien partisi lemak:air lebih rendah, dapat melewati membran sebagai H+-laktat 8 • Penyangga molekul berat rendah seperti asam amino, fosfat, atau CO2/HCO3- dapat memfasilitasi difusi H+ dan meningkat pelepasan H+laktat (a) • Difusi CO2 terfasilitasi CA juga membutuhkan buffer yang mobile dan adekuat untuk membawa ion H+ secara paralel terhadap CO2 dan HCO3- (b) Produksi dan Pelepasan Asam Metabolik 9 Kecepatan pelepasan CO2 dan pasif dari sel bergantung pada gradien konsentrasi trans-membran. + H -laktat Pada jaringan yang perfusinya baik, gradien transmembran yang mengarah ke luar dipelihara oleh coupling difusif yang baik antara permukaan sel dan darah kapiler. Sebaliknya, perfusi kapiler pada tumor yang sering tidak adekuat memberikan peningkatan terhadap jarak difusi panjang dan resistensi yang mempengaruhi aliran cairan tersebut. 10 Buffer yang mudah bergerak (mobile) biasanya berdampingan dengan buffer yang menetap Konsekuensi dari kondisi ini adalah: Gradien yang relatif curam H+ diperlukan untuk mendorong fluks ion difusif H+ untuk menyesuaikan dengan fluks dari CO2, HCO3-, atau laktat. Hal ini dapat menjelaskan mengapa penting untuk [H+ ]e di inti tumor padat untuk mencapai kadar sebesar 250nM, contoh pHe = 6,6. 11 Dalam skema yang dikembangkan sejauh ini, H+ - laktat dan CO2 adalah sumber utama dari asam dalam sel, dan pelepasan ion ini dibatasi oleh tahanan yang diberikan kepada membran (permeabilitas) dan ruang intersisial yang berliku-liku (difusi). Intraseluler keadaan steady-state dapat diperkirakan dengan: Pada beberapa sel, seperti eritrosit, pHi kondisi steady-state yang diprediksi oleh persamaan ini masih viabel karena plasma [H+ ], [HCO3-] dan [laktat-] secara normal terkontrol baik dalam tubuh. Namun, sebagian besar sel tidak memiliki kemampuan untuk mengakses langsung terhadap lingkungan yang terkontrol baik, konsekuensinya pHi ekuilibrium yang diprediksi mungkin tidak sesuai dengan kebutuhan biologis. 12 Regulasi pH oleh transport membran Regulasi pH oleh transport membran Transport ion H+ Transport ion ekuivalen H+ • Dalam larutan di mana konsentrasi dan Ka buffer menetap, satusatunya cara untuk mengubah pH adalah dengan menambahkan asam atau basa. • Ketika produksi H+/H+ ekuivalen (atau konsumsi) dalam metabolisme tidak cukup mencapai homeostasis pHi, sel dapat mengontrol pHi mereka sendiri dengan meregulasi transport aktif dari ion H+ atau ekuivalen kimiawi nya yang melewati membran. • Melalui eksperimen, dapat dibedakan antara protein regulasi pHi yang mentranslokasikan ion H+ (atau OH-) dari protein yang mentranslokasi ion HCO3- (atau CO32-) dengan mengukur fluks dengan keberadaan dan ketiadaan dari penyangga CO2 / HCO3- 13 Regulasi pH oleh transport membran • Untuk sistem regulatori yang lengkap, transporter membran harus ‘merasakan’ pHi dan berespon dengan memproduksi net efluks atau influks dari H+ / H+ ekuivalen ketika pHi terlalu tinggi atau terlalu rendah. • Dalam praktiknya, sebagian besar sel mengekspresikan protein transporter pemuatan dan ekstrusi asam yang telah sesuai 14 a. Dengan bekerja berlawanan dengan satu sama lain, ektrusi asam dan loading asam dapat memperbaiki gangguan pHi dan memelihara pHi sekitar titik keadaan steady-state b. Contoh analisis fluks dari sel kanker kolon HCT116 yang dikultur di bawah kondisi normoksia. c. NHE1, contohnya sensitif terhadap sinyal dengan rentang yang cukup lebar. Pertukaran Na+/ H+dalam sel HCT116 sensitif terhadap kinase. 15 SEBAGAI RANGKUMAN: 1 pHi istirahat dari sebuah sel dapat didefinisikan sebagai titik keadaan steady-state yang mana produksi net asam metabolik seimbang dengan transport H+ / H+ ekuivalen membran. 2 Fluks ini sangat mungkin menunjukkan variasi regional yang cukup banyak dalam tumor solid, menghasilkan gradien pHi yang besar yang potensial sepanjang pHe non-uniformitas. 3 Aspek penting dari regulasi pH jaringan tidak dapat diinvestigasi dengan mengukur pH dalam suspensi atau monolayer 2-dimensi yang disediakan dari sel kultur. 16 SEBAGAI RANGKUMAN: 4. Pendekatan yang lebih instruktif untuk mempelajari non-uniformitas pH dalam jaringan adalah untuk menggambarkan sferoid 3 dimensi multiseluler yang diturunkan dari kanker untuk pHi dan pHe 17 • Transport aktif H+ / H+ ekuivalen adalah sebuah cara di mana sel kanker dapat menjaga pHi alkalin, dengan adanya produksi asam metabolik substansial dan pHe rendah. • Namun, kapasitas transpor membran untuk melakukan kontrol penuh dan autonomi pHi terbatas oleh sedikitnya dua faktor, yaitu: 1. Transpor aktif dapat memberikan beban energi substansial pada sel; Konsekuensinya, transport H+ / H+ ekuivalen membran harus ada pada beberapa mmol .1-1min-1 untuk mengubah pHi sebesar sebagian unit per menit. 2. Pengaruh yang dimiliki regulator pHi pada pH ekstraseluler. Cth: Pada sferoid, kapasitas buffer ekstraseluler intrinsik diperkirakan ekuivalen sebesar 5-10mmol. (l interstitium)-1.(pH unit)-1 menyebabkan perubahan pHe yang cukup besar dan menambah asidosis yang disebabkan oleh pelepasan CO2 dan H+laktat (menjelaskan mengapa tumor defisien-glikolisi menghasilkan pHe rendah). 18 ‘Merasakan’ pH, seleksi didorong pH, dan perspektif klinis Merasakan (sensing) pH SEL KANKER Sel kanker dapat mendeteksi dan berespon terhadap faktor lingkungan mikro, yang kemudian menjadi panduan sel sel ini untuk evolusi somatik. Namun sulit untuk mengidentifikasi Sensor pH yang terlibat dalam progresi penyakit kanker, kemungkinan karena sulitnya membedakan sensor pH bonafide dari plethora protein yang mengikat ion H+ 19 Kelompok imidazole histidin • Di antara situs yang dapat dititrasi pada protein, kelompok imidazole histidin adalah kandidat yang menarik dari bagian yang merasakan pH. • Meskipun histidin hanya menyumbang kurang dari 3% dari sebagian besar protein, histidin umum ditemukan pada lokasi aktif atau pengikatan. Histidin tidak bersubtitusi baik dengan asam amino lain. • Dengan mempertimbangkan keunggulannya di lokasi aktif/pengikatan, mutasi histidin diduga dapat mengubah fungsi protein. 20 Selama progresivitas penyakit kanker sel mengakumulasi perubahan genetik yang menetap ketika terpilih secara positif oleh lingkungan mikro. Setidaknya beberapa mutasi mungkin berhubungan dengan gen atau regulator gen untuk transporter ekuivalen H+ / H+, sensor pH, atau protein yang terlibat dalam alur metabolik penghasil asam. 21 Prognosis buruk dari tumor dengan pHe rendah dapat mengindikasikan keasaman dapat mengidentifikasi sebuah populasi sel yang memiliki sensor pH yang sesuai dan struktur regulator yang dibutuhkan untuk berkembang, dan bahkan dapat menjadi resisten terhadap obat. Karena sel kanker (dan mungkin sel stroma) memiliki kontrol yang cukup besar pada pHe, arah, kecepatan perubahan dari tekanan seleksi ini dapat diadaptasi sehingga meningkatkan progresivitas penyakit. 22 • Bukti yang berkembang tentang pentingnya pH dalam biologi kanker telah mendorong banyak ide ambisius untuk terapi yang menargetkan protein yang mengatur pH dengan inhibitor berat molekuler rendah atau antibodi monoclonal. • Strategi penghambatan ekstrusi asam dari sel kanker dan memperbolehkan asam intraseluler untuk berakumulasi hingga kadar letal dapat dicapai dalam kondisi in vitro, namun efikasinya in vivo harus melewati hambatan besar. 23 Protein yang menangani asam basa juga penting untuk sel normal dan inhibisi dapat berakhir pada toksisitas sistemik yang tidak dapat diterima. Hambatan yang dapat terjadi yaitu bahwa: Redundansi dalam mekanisme ekstrusi asam yang dapat mengkompensasi protein yang ditargetkan, terutama dalam sel kanker yang memiliki cara untuk mengubah dan beradaptasi secara dinamis. 24 Jaringan dapat meregulasi dan beradaptasi terhadap distribusi pH tertentu lewat interaksi dua arah antara pH dan protein. KESIMPULAN Lewat evolusi fenotipe superior secara kontinu, sel kanker dapat mengeksploitasi interaksi ini untuk mengalahkan sel inang dalam kompetensi dan metastasis. Belum jelas bagaimana konsentrasi ion H+ diregulasi dan dirasakan oleh sel kanker. Namun, kombinasi pendekatan fisiologis, biokimia, genetik, dan komputasional menyuplai ide baru tentang bagaimana menggunakan interaksi pH/biologi dalam manajemen kanker 25 THANK YOU! ANY QUESTIONS?
