DETEKSI GEN VIRULEN BAKTERI Vibrio parahaemolyticus DARI

SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
DETEKSI GEN VIRULEN BAKTERI Vibrio parahaemolyticus DARI
SAMPEL PENSI (Corbicula moltkiana. Prime) DENGAN METODA
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Lola Azyenela1, Marlina2
Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia Perintis Padang
2
Fakultas Farmasi Universitas Andalas
1
ABSTRACT
The isolation and detection of toxR, tdh and trh gene Vibrio parahaemolyticus bacteria had been
done to samples of pensi , wich were taken from Singkarak lake and some of traditional market at Padang
city. The isolation were using selective media CHROMAgarTM Vibrio, and confirmation testing were
done by detecting the existed of gene toxR by using Polymerase Chain Reaction ( PCR ) methode with
vilurence factor tdh and trh gene detection. The result were pensi samples containing V.
parahaemolyticus bacterias which were showed by the appearing of bacteria’s colonies in violet color.
The fourty pure culture of pensi which were detected, gave us results of 10 culture toxR gene positive, 7
culture tdh gene positive, and none of trh gene positive.
Keywords : Vibrio parahaemolyticus, Corbicula moltkiana. Prime, Polymerase Chain Reaction (PCR)
PENDAHULUAN
Bakteri Vibrio parahaemolyticus adalah
bakteri yang banyak hidup dan berkembang di
laut, sungai dan danau. Beberapa strain bakteri
V.
parahaemolyticus dapat menyebabkan
gastroenteritis
pada
manusia
yang
mengkonsumsi makanan terutama yang dimakan
mentah, dimasak tidak sempurna, atau
terkontaminasi oleh bakteri ini. (Su, 2007;
Eugenia, 2004 ; Marlina, 2008)
V. parahaemolyticus merupakan bakteri
Gram-negatif,
berbentuk batang pendek
bengkok dan mempunyai flagel.
V.
parahaemolyticus tumbuh optimum pada kadar
NaCl 3%, suhu 35-43 oC, pH 4,8-11, bakteri
anaerob fakultatif dan bersifat halofilik.
(Bonang, 1979).
Kerang-kerangan adalah kelompok hewan
bertubuh lunak yang mempunyai kandungan
protein yang tinggi. Karena kandungan protein
yang tinggi ini bakteri V. parahaemolyticus
dapat hidup bersimbiosis dengannya. Kerangkerangan yang banyak dikonsumsi masyarakat
adalah pensi (Corbicula moltkiana. Prime)
terutama masyarakat di pinggir danau dan
sungai. Pengolahan pensi yang tidak sempurna
akan menyebabkan diare, dan dalam kondisi
parah
dapat
menyebabkan
infeksi
ISSN : 2087-5045
gastrointestinal. Penyakit ini salah satunya
disebabkan oleh bakteri V. parahaemolyticus.
(Bhuiyan, 2002 ; Pennak, 1978)
V. parahaemolyticus dapat diidentifikasi
dengan beberapa cara, salah satunya dengan
menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain
Reaction). Dengan metode ini dapat dideteksi
gen-gen spesifik dari V. parahaemolyticus yaitu
gen regulator yang disebut toxR dan gen-gen
spesifik lain yaitu thermostable direct hemolysin
(tdh) dan thermostable related hemolysin (trh).
(Gopal, 2005 ; Yuwono, 2006).
Pada penelitian sebelumnya
telah
dilakukan isolasi V. parahaemolyticus dari
sampel pensi (Corbicula moltkiana. Prime),
tetapi tidak dilakukan deteksi gen yang bersifat
patogen pada V. parahaemolyticus tersebut.
Pada penelitian kali ini akan dilakukan deteksi
lebih
lanjut
terhadap
gen-gen
yang
menyebabkan bakteri ini bersifat patogen, yaitu
gen tdh dan trh. (Rinanda, 2008; Yuherman,
2000)
Melalui penelitian ini, maka dapat
dideteksi keberadaan kedua gen virulen V.
parahaemolyticus di dalam spesies tersebut, dan
hasil akhir penelitian ini diharapkan dapat
menjadi masukan untuk mengurangi resiko
kontaminasi V. parahaemolyticus pada bahan
makanan dan resiko keracunan bakteri ini.
42
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Selain itu juga diharapkan peneliti selanjutnya
untuk melakukan identifikasi jenis vibrio lain
seperti Vibrio alginotycus, Vibrio fulminycus
dan Vibrio cholera dengan metode PCR pada
sampel Corbicula moltkiana. Prime.
METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Mesin
PCR
(Eppendorf
Mastercyclergradient®),
tabung
eppendorf,
cawan petri, erlenmeyer, gelas piala, gelas ukur,
batang pengaduk, jarum ose, pipet mikro
(Eppendorf®), lampu spritus, hot plate, vortex
(Mixer® VM-1000), timbangan digital, lampu
UV (Gel Doc), sentrifugator (Eppendorf
Minispin®), inkubator (Gallenkamp®), lemari
pendingin, rotary shaker incubator (Bigger Bill
Digital®), laminar air flow (ESCO®), autoklaf,
botol universal, perangkat elektroforesa,
alumunium foil, film polaroid. Sampel pensi (C.
moltkiana. Prime), media CHROMAgarTM
Vibrio, media Salt Polymixin Broth (SPB), Luria
Burtani (LB) Broth, aquadest steril, primer, Taq
polimerase, gel agarose, 10x buffer PCR, 25
mM MgCl 2, 10 mM dNTP’s, ethidium bromida,
1x buffer TBE, 100 bp DNA ladder, blue dyes,
Kontrol positif V. parahaemolyticus yaitu : VP
Strain No.AQ 3815 dan AQ 4037 untuk gen
toxR, VP Strain No.AQ 3815 dan VP 81 untuk
gen tdh, dan VP Strain No. AQ 4037 dan AT 4
untuk gen trh.
kemudian dilakukan pengenceran mulai dari 10-1
sampai 10-5 dengan cara memipet 0,1 ml sampel
induk dimasukkan ke dalam 0,9 ml media SPB
dalam tabung eppendorf untuk pengenceran 10-1
selanjutnya 0,1 ml dari pengenceran10-1
dimasukkan kedalam 0,9 ml media SPB dalam
tabung eppendorf untuk pengenceran 10-2,
demikian seterusnya sampai pengenceran 10-5.
Setelah itu masing – masing pengenceran
ditanam pada media CHROMAgarTM Vibrio
dalam cawan petri. Lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Biakan dalam cawan petri
akan terlihat koloni ungu tunggal yang
menandakan
adanya
bakteri
V
.
parahaemolyticus.
Pemurnian kultur V. parahaemolyticus
Koloni warna ungu pada media
CHROMAgarTM Vibrio diambil hati-hati dengan
jarum Ose dan dimasukkan ke dalam botol
universal berisi Luria Burtani (LB) Broth,
kemudian diinkubasi pada inkubator shaker 37
o
C dengan kecepatan 160 rpm selama 24 jam.
Biakan tersebut dipindahkan kedalam LBA
(Luria Butani Agar) dan diinkubasi pada suhu
37 oC selama 24 jam dan disimpan untuk stok.
Prosedur Penelitian
Pengambilan sampel
Sampel diambil langsung dari daerah
danau Singkarak dan dari beberapa pasar
tradisional di kota Padang Sumatra Barat,
kemudian diidentifikasi di Laboratorium Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Andalas.
Deteksi gen V. Parahaemolyticus
Ekstraksi genom DNA
Ekstraksi genom DNA dilakukan dengan
metode Boil Cell Extraction (BCE). Kultur
media yang terdapat dalam tabung eppendorf
sebanyak 1 ml disentrifus pada 12.000 rpm
selama 2 menit, supernatan dibuang, endapan
disuspensikan dalam 1 ml NaCl 0,75% steril lalu
divortex. Dipanaskan dalam air mendidih selama
5 menit. Selanjutnya didiamkan 5 menit dalam
lemari pendingin dengan suhu -20º C, kemudian
disentrifus pada 12.000 rpm selama 2 menit,
supernatan dipindahkan ke dalam tabung
eppendorf baru dan siap untuk deteksi gen
menggunakan mesin PCR.
Isolasi bakteri V. parahaemolyticus
Sampel berupa pensi (C. moltkiana.
Prime) yang telah dihaluskan terlebih dahulu,
masing-masing sebanyak 10 gram dimasukkan
ke dalam labu Erlenmeyer steril kemudian
ditambah Salt Polymixin Broth (SPB) ad 100 ml,
diaduk homogen. Kemudian diinkubasi pada
suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah diinkubasi
Elektroforesa
Elektroforesa
dilakukan
dengan
menggunakan gel agarose 1 % menggunakan
TBE 1 x pada tegangan 100 Volt selama 20
menit. Selanjutnya gel diwarnai dengan 0,5
g/ml larutan ethidium bromida selama 5-10
menit dan dilihat gambarannya di bawah alat
pengamat DNA (lampu UV). Gel tersebut difoto
ISSN : 2087-5045
43
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
dengan menggunakan film polaroid. Pada foto
dapat dilihat pola pemisahan pita-pita DNA
yang ukurannya diketahui melalui perbandingan
dengan ukuran pita-pita standar 100 bp DNA
ladder, dimana ukuran pita-pita DNA V.
parahaemolyticus untuk gen toxR 368 bp, gen
tdh 251 bp sedangkan gen trh 250 bp.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi bakteri V. parahaemolyticus dari
spesies pensi (C. moltkiana. Prime) yang
diperoleh langsung dari Danau Singkarak dan
dari beberapa pasar tradisional di Kota Padang
Sumatera Barat dilakukan dengan menggunakan
media pengaya Salt Polymixin Broth (SPB).
SPB mengandung antibiotika Polymixin
B, dimana bakteri V. parahaemolyticus telah
resisten terhadap antibiotika ini, dan masih
memiliki aktivitas terhadap spesies Vibrio
lainnya,
sehingga
pertumbuhan
V.
parahaemolyticus akan tetap berlangsung,
sedangkan spesies Vibrio yang lainnya akan
terhambat. Pada media SPB ini harus
ditambahkan
NaCl
3%
karena
V.
parahaemolyticus bersifat halofilik yaitu bakteri
yang tumbuh optimum dalam kondisi garam
yang tinggi, kondisi garam yang optimum
adalah 3 %. (United State of America food and
Drug Administration, 2001.)
Isolasi ini dilakukan dengan 5 variasi
pengenceran yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5,
masing-masing pengenceran ditanam pada
media CHROM AgarTM Vibrio, dengan cara
mencampurkan 100 µl pengenceran dengan 15
ml media tersebut. CHROMAgarTM Vibrio
adalah media selektif yang mengandung
campuran kromogenik yang memberikan warna
ungu untuk spesies V. parahaemolyticus dan
warna putih untuk spesies Vibrio alginolyticus,
serta warna biru untuk Vibrio fulmynicus.
(http:/chromagar.com/products Vibrio, 2003;
Schlegel, 1994.)
Gen toxR atau toxin Regulator pertama
kali ditemukan pada bakteri Vibrio cholera,
tetapi kemudian ditemukan juga pada jenis V.
parahaemolyticus, dengan susunan basa
nukleotida yang berbeda. Gen toxR ini
merupakan gen spesifik yang terdapat pada
bakteri
V.
parahaemolyticus, gen
ini
mengaktifkan
gen-gen
lainnya
untuk
ISSN : 2087-5045
menghasilkan produk toksin berupa hemolysin
seperti Thermostable Direct Hemolysin (TDH)
dan
TDH-Related
Hemolysin(TRH).
(Provenzano, 1999)
Proses ekstraksi genom DNA dapat
dilakukan dengan beberapa cara di antaranya
dengan metoda Boil Cell Extraction (BCE).
Pada proses BCE ini akan terjadi proses lisisnya
dinding sel bakteri karena perubahan suhu yang
terlalu ekstrim yaitu dari 100 oC menjadi -20 oC,
sehingga protein pada dinding sel bakteri
terdenaturasi
dan
mengkerut, kemudian
sitoplasma dan komponen-komponen dalam sel
akan keluar. (Marlina, 2008)
Pada penggunaan mesin PCR dilakukan
terlebih dahulu optimasi untuk pemakaian yang
lebih ekonomis. Optimasi ini dilakukan dengan
memperkecil jumlah enzim Taq DNA
polymerase dan primer yang digunakan.
Berbeda dengan penelitian sebelumnya yang
menggunakan Perkin-Elmer, Cetus, USA
dengan jumlah enzim Taq DNA polymerase
yang digunakan sebanyak 1,0 µl dan primer
masing-masing 2,0 µl, pada penelitian ini
digunakan
Mastercycler
Gradient
PCR
(Eppendorf®) memakai enzim Taq DNA
polymerase dan primer masing-masing 0,1 µl
dan 1,0 µl. Hasil optimasi dapat dilihat pada pita
DNA gel agarose dimana dengan pemakaian
pereaksi
yang
lebih
sedikit
masih
memperlihatkan penampakan pita yang jelas dan
terang ( Marlina, 2008).
Dalam proses elektroforesa di lakukan
pada gel agarose 1 % dengan menggunakan
TBE (Tris Base Acid EDTA) 1X pada tegangan
100 volt selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan
pewarnaan
gel
agarose
yang
telah
dielektroforesa di dalam 0,5µl/ml larutan
ethidium bromide selama 5-10 menit. Ethidium
bromide
adalah
senyawa
yang
dapat
berflouresensi di bawah sinar UV, sehingga
dengan perendaman dengan ethidium bromide
ini pita-pita DNA dapat terlihat di bawah alat
pengamat DNA dan bisa difoto. Pada gambar 2
dan 3 dapat dilihat foto yang menggambarkan
pita-pita DNA, dimana ukurannya dapat
diketahui melalui perbandingan dengan ukuran
pita-pita DNA standar yaitu “100 bp DNA
ladder”. Ukuran pita DNA gen toxR V.
parahaemolyticus adalah 368 bp, tdh 251 bp dan
trh 250 bp.
44
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Kultur yang telah positif dan membentuk
koloni berwarna ungu pada CHROMAgarTM
Vibrio kadang tidak dapat dideteksi gen toxR
nya, hal ini terjadi karena kemungkinan kultur
tersebut telah terkontaminasi oleh spesies Vibrio
lainnya. Hal ini sangat berpengaruh karena
primer yang digunakan hanya bereaksi spesifik
dengan DNA dari kultur V. parahaemolyticus
saja atau karena DNA template yang digunakan
sudah lama.
Pada deteksi gen virulen didapatkan
perbedaan antara sampel yang diperoleh
langsung dari danau Singkarak dan yang
diperoleh dari beberapa pasar tradisional di kota
Padang, dimana sampel Singkarak, dari 20
kultur V. parahaemolyticus yang diamplifikasi
PCR, diperoleh hasil tidak satupun kultur yang
memiliki gen toxR, berbeda dengan yang
diperoleh dari beberapa pasar tradisional di kota
Padang, dari 20 kultur yang diuji didapatkan 10
kultur positif gen tox R, 7 kultur positif memiliki
gen tdh dan tidak satupun positif gen trh. Hal ini
dapat disebabkan karena kontaminasi dari
lingkungan pasar, sehingga jumlah bakteri yang
terdapat pada sampel menjadi bertambah.
Gambar 1. V. parahaemolyticus sampel C
.moltkiana.
Prime
pada
CHROMAgarTM Vibrio.
gen tdh memberikan reaksi hemolisis pada
-hemolisis pada agar darah. Sedangkan
gen trh memberikan reaksi yang negatif
terhadap media blood agar yang dikenal dengan
fenomena Kanagawa negatif.
Gambar 2. Gel agarose 1 % gen toxR hasil
elektroforesa DNA (C. moltkiana.
Prime).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
spesies pensi (C. moltkiana. Prime) mengandung
17,5 % gen tdh. Hal ini membuktikan bahwa
pada sampel uji) mengandung gen virulen
bakteri V. parahaemolyticus.
Dari hasil yang diperoleh ini dapat
dikatakan bahwa pensi (C. moltkiana. Prime)
cukup memiliki resiko untuk dikonsumsi,
apalagi dikonsumsi dalam jumlah yang banyak
dan dalam keadaan tidak dimasak sempurna.
Tetapi, kelompok kerang-kerangan ini aman
dikonsumsi bila telah dimasak dengan
sempurna. Karena pemanasan makanan pada
suhu 100 oC dalam waktu singkat, atau pada
suhu 60 oC selama 15 menit dapat membunuh
bakteri V. parahaemolyticus. Hasil penelitian
yang
diperoleh
ini
diharapkan
dapat
memberikan informasi kepada masyarakat untuk
mengurangi resiko keracunan karena bakteri V.
parahaemolyticus ini.
Gen tdh dan trh adalah gen yang bersifat
virulen pada bakteri V. parahaemolyticus yang
menyebabkan bakteri ini bersifat patogen. Gen
tdh
juga
dapat
diidentifikasi
dengan
menggunakan reaksi biokimia yaitu dengan test
Kanagawa yang lebih dikenal dengan fenomena
Kanagawa positif. Reaksi biokimia ini
menggunakan media blood agar (Wagatsuma
Agar) yang diperoleh dari eritrosit manusia yang
bergolongan darah O atau darah kelinci, dimana
ISSN : 2087-5045
45
SCIENTIA VOL. 5 NO. 1, FEBRUARI 2015
Gambar 3. Gel agarose 1 % gen tdh hasil
elektroforesa DNA (C. moltkiana.
Prime)
KESIMPULAN
C. moltkiana. Prime yang diperoleh dari
danau singkarak dan beberapa pasar tradisional
di kota Padang, Sumatera Barat terdapat bakteri
V. parahaemolyticus yang ditandai dengan
adanya gen toxR. Empat puluh kultur murni
pensi yang dideteksi memberikan hasil 10 kultur
positif gen toxR, 7 kultur positif gen tdh dan
tidak satupun kultur yang positif gen trh.
DAFTAR PUSTAKA
Bhuiyan, N, Januari 2002. ”Prevalence of
Pendemic
Genotype
of
Vibrio
parahaemolyticus in Dhaka, Bangladesh,
and Significantce of its distribution across
Different Serotype” Journal of Clinical
Microbiology, Vol 40, P 284-286.
Bonang, G., dan E.S. Koeswardono, 1979.
Mikrobiologi
Kedokteran
untuk
Laboratorium dan Klinik, Gramedia:
Jakarta.
CHROMAgarTM,
2003
“CHROMAgarTM
Vibrio”, http:/chromagar.com/products
Vibrio.
Eugenia, M., V. Carlos, I. Elsa. 2004 “ Serologic
and Molecular Characterization of Vibrio
parahaemolyticus Strains Isolated from
Seawater and Fish Product of the Gulf of
Mexico”. Applied and Enviromental
Microbiology, 70, 6401-6406.
ISSN : 2087-5045
Gopal, S., Otta, S., 2005 “The Occurrence of
Vibrio Species in Tropical Shrimp Culture
Enviroment ; Implication for Food
Safety”. International Journal of Food
Microbiology, 102, 151-159.
Marlina, 2008. “ Identifikasi Bakteri Vibrio
parahaemolyticus Dengan Metode Biolog
dan Deteksi Gen ToxRnya secara PCR ”.
Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi, 13
(1) : 349-354.
Pennak, R. W., 1978. Freshwater Invertebrates
of United States, 12nd ed, A Willey
Intercine Publication: United State of
America.
Provenzano,D., DA. Scuhmacher, J.L Barker,
and K.E Klose , 1999, ”The Virulence
Regulatory Protein toxR Mediates
Enhanced Bile Resistence in Vibrio
Cholerae and other Pathogenic vibrio
spesies”,
Journal
of
Clinical
Microbiology,12 ,758 – 763.
Rinanda, Y. , 2008, “Penggunaan Metode MPNPCR(Most Probable Number-Polymerase
Chain Reaction) Untuk Identifikasi
Bakteri Vibrio parahaemolyticus dan Uji
Sensitivitasnya
Terhadap
Beberapa
Antibakteri”, Skripsi Sarjana Farmasi,
Fakultas Farmasi, Universitas Andalas,
Padang.
Schlegel, H.G., 1994. Mikrobiologi Umum,
Edisi ke-6, diterjemahkan oleh Tedjo
Baskoro,UGM Press : Yogyakarta.
Su, Y, C. & Liu, C., 2007 “ Vibrio
parahaemolyticus : A Concern of Seafood
Safety”. International Journal of Food
Microbiology, 24, 549-558.
United State of America food and Drug
Administration,
2001.
Foorborne
Phatogenic Microorganism and Natural
toxins Handbook, center for foodsafety
and Applied nutrition.
Yuherman, 2000 “ Moleculer Characterization
of Vibrio Species Isolated From Water
Sea, Faculty of Food and Biotechnology“,
University Putra Malaysa, Selangor,
Malaysia.
Yuwono, T., 2006. Teori dan Aplikasi
Polymerase Chain Reaction, Andi:
Yokyakarta,.
46