Konsep dasar dalam Bioteknologi Marvel, M.Farm., Apt. OUTLINE • Transkripsi • Translasi • Regulasi ekspresi gen SEL PROKARIOT EKSPRESI GEN • Informasi genetik pada struktur DNA diturunkan kepada sel anak melalui proses replikasi DNA • Kemudian, diekspresikan oleh proses transkripsi DNA menjadi RNA. • Terakhir, Proses Translasi RNA dikonversi menjadi protein. • Konsep ini disebut “DOGMA SENTRAL BIOLOGI” EKSPRESI GEN EKSPRESI GEN • Banyak gen eukariot yang di ekspresi dengan cara berbeda dari konsep dogma sentral • Beberapa jenis mRNA yang dihasilkan dari proses transkripsi pada sel eukariot mengalamai proses splicing terlebih dahulu sebelum di transportasi keluar dari nukleus. • Bagian tertentu dari DNA yang disebut “intron” tetap berada di dalam nukleus. • Sedangkanbagian ekson akan digabung menjadi mRNA, dan akan ditransportasikan ke dalam sitoplasma sel, digunakan dalam proses translasi menjadi protein. REPLIKASI DNA • Replikasi sel berlangsung melalui proses transfer informasi genetik pada sel induk ke sel anak, setelah proses replikasi DNA kromosomal. • Untai DNA terdiri dari 4 komponen penyusun yaitu deoksiribonukleotida, masing-masing dATP, dCTP, dGTP, dTTP. • A : adenin, C : sitosin, G : guanin, T : timin • A selalu berpasangan dengan T • C selalu berpasangan dengan G • Adenin dan Guanin : Purin • Sitosin (C) dan Timin , Uracil (RNA) : Pirimidin REPLIKASI DNA Replikasi DNA membutuhkan beberapa jenis enzim • Enzim topoisomerase (melonggarkan pilinan dan memperbaiki rotasi DNA heliks ganda) • Enzim helicase (mengkatalisis untuk membuka DNA heliks ganda) • DNA Polimerase (yang menjalin penambahan basa-basa nukleotida dan pemanjangan untai DNA yang komplementer dengan cetakan DNA. REPLIKASI DNA REPLIKASI DNA • Selama proses replikasi masing-masing untai DNA bertindak sebagai cetakan dan direplikasi menjadi untai DNA yang komplementer, berjalan dari arah ujung 5’ ke ujung 3’. • Replikasi DNA dimulai dari situs DNA yang spesifik yang disebut dengan titik awal replikasi (origin of replication = ori) • Bakteri dan plasmid hanya punya 1 ori. • Eukariot memiliki ratusan ori. • Plasmid bakteri memiliki ori sendiri dan bersifat otonom. • Replikasi DNA berjalan mengikuti prinsip replikasi semikonservatif, dimana masing-masing untai DNA pada RNA heliks ganda bertindak sebagai cetakan (template). URUTAN PROSES REPLIKASI DNA • Enzim topoisomerase melonggarkan pilinan DNA untai ganda • Enzim DNA Helikase membuka ikatan hidrogen diantara basa-basa penyusun DNA • Untai ganda yang dibuka ini akan distabilkan oleh single strand binding protein, sehingga basa-basa tersebut tidak berikatan kembali. • Untai tunggal ini disebut : replication fork, dilokasi ini akan dimulai awal replikasi yg disebut origin of replication (ori). URUTAN PROSES REPLIKASI DNA • Enzim RNA primase akan mensintesis primer RNA berupa RNA untai pendek untuk mengawali sintesi DNA • Kemudian dilanjutkan oleh enzim DNA polimerase III melakukan polimerisasi dengan menambahkan nukleotida baru pada ujung 3’. • Proses replikasi DNA mengikuti prinsip replikasi semi konservatif, dimana masing2 untai tunggal akan bertindak sebagai cetakan DNA • Maka satu untai DNA baru akan disintesis secara kontinyu oleh DNA polimerase III mengikuti arah replikasi dari ujung 5’ ke ujung 3’ yg disebut sebagai leading strand. URUTAN PROSES REPLIKASI DNA • Sedangkan untai DNA yang lain disebut sebagai lagging strand, karena disintesis dalam bentuk fragmen-fragmen pendek yang disebut sebagai fragmen okazaki. • Proses replikasi DNA akan diakhiri dengan dilepaskannya primer RNA oleh enzim DNA polimerase I, dan proses penyambungan fragmen-fragmen DNA pendek oleh enzim DNA ligase • Skema proses replikasi DNA ada pada gambar 1.8. URUTAN PROSES REPLIKASI DNA URUTAN PROSES REPLIKASI DNA TRANSKRIPSI • Transkripsi adalah proses dimana gen (informasi genetik pada segmen DNA kromosomal) disalin menjadi mRNA yang komplementer oleh enzim RNA polimerase. • Proses transkripsi dimulai dengan terikatnya enzim RNA polimerase pada situs spesifik yang terdapat pada untai DNA yang disebut sebagai promotor beberapa pasang basa di bagian atas (upstream) dari gen atau dari beberapa gen yang bertindak sebagai unit operasional dari gen yang akan ditranskripsikan yang disebut “OPERON”. TRANSKRIPSI • Setelah enzim RNA polimerase terikat, pilinan DNA heliks ganda akan terbuka, kemudian akan berlangsung proses transkripsi. • Sintesis RNA terjadi dengan menggunakan basa-basa penyusunnya yaitu adenosin triposfat (ATP), sitidin triposfat (CTP), guanosin triposfat (GTP), dan uridin triposfat (UTP). • Salah satu untai tunggal dari DNA gen bertindak sebagai untai cetakan (template strand), sedangkan untai lainnya sebagai untai penyandi (coding strand). TRANSKRIPSI • Sintesis RNA berjalan anti paralel dari ujung 5’ ke arah ujung 3’. • Pemanjangan basa-basa RNA oleh enzim RNA polimerase sesuai dengan komplementaritas basa-basa yang tersusun pada untai cetakan, dimana basa G akan berpasangan dengan C. • Basa T akan berpasangan dengan U pada untai RNA. • Serangkaian nukleotida yang terdapat pada gen menyandi urutan asam amino dalam polipeptida disebut sebagai sandi genetik. • Triplet nukleotida pada untai DNA yang telah ditranskripsi menjadi mRNA, menyandi asam amino spesifik yang menjadin komponen penyusun protein. • Sandi genetik berlaku secara universal pada setiap mahluk hidup. TRANSKRIPSI TRANSKRIPSI TRANSKRIPSI • Triplet nukleotida yang disebut dengan “KODON” dalam mRNA menyandi asam amino yang sama pada setiap organisme. • Pada molekul mRNA, di ujung 5’ terdapat triplet spesifik yang menyandi asam amino metionin yang memulai sintesis polipeptida yang disebut dengan kodon pertama (start kodon). • Pada ujung 3’ terdapat triplet spesifik yang mengakhiri sintesis polipeptida disebut dengan stop codon. TRANSLASI • Translasi merupakan suatu proses reaksi yang kompleks dimana molekul mRNA, ribosom, tRNA, asam amino, aminoasil sintetase, dan beberapa faktor translasi, bekerja bersama secara terpadu untuk memproduksi protein sesuai dengan sandi genetik yang dibawa oleh mRNA. • Proses translasi dimulai dari pembentukan formasi spesifik yang disebut dengan kompleks inisiasi. • Pada sel bakteri, fase inisiasi dimulai dari reaksi antara Ribosom subunit 30S, tRNA yang membawa asam amino metionin dan beberapa faktor inisiasi yang terpadu bergabung bersama pada posisi kodon pertama (AUG) pada untai mRNA. • Pada kompleks inisiasi ini, kemudian ribosom subunit 50S bergabung membentuk ribosom 70S yang fungsional. TRANSLASI • Translasi berlangsung dengan bantuan faktor elongasi spesifik. • Ribosom 70S berjalan sepanjang molekul mRNA, dibawah koordinasi tiap kodon yang terdapat pada mRNA dengan “antikodon” yang dibawa oleh tRNA spesifik. • Asam amino yang dilepaskan oleh molekul tRNA spesifik berturut-turut akan berikatan satu dengan yang lain dengan ikatan peptida membentuk rantai polipeptida. TRANSLASI • Proses tranlasi berhenti apabila di bagian akhir molekul mRNA terdapat satu atau beberapa stop kodon. • Triplet nukleotida stop kodon ini tidak dapat menerima molekul aminoasil-tRNA sehingga sintesis asam amino terhenti. • Setelah tahap terminasi, protein dilepaskan dari ribosom 70S. • Ribosom 70S terurai kembali menjadi ribosom 30S dan 50S, yang kemudian akan digunakan pada siklus translasi berikutnya. TRANSLASI REGULASI EKSPRESI GEN • Pada sel prokariot, regulasi ekspresi gen terjadi pada tahap transkripsi. • Mekanisme regulasi transkripsi, pada sel prokariot dan sel eukariot, pada dasarnya terdiri dari : 1. Mekanisme penyesuaian diri dengan perubahan kondisi lingkungan. Ekspresi gen bisa berjalan (turn on) dalam kondisi tertentu, dan bisa terhenti (turn off) pada kondisi lingkungan yang berbeda. 2. Mekanisme ekspresi gen yang terprogram dengan seksama (preprogrammed circuits) REGULASI EKSPRESI GEN • Mekanisme regulasi yang pertama biasanya terjadi pada sel prokariot yang dapat menyesuaikan diri dalam kondisi lingkungan yang ekstrim. • Mekanisme regulasi kedua terjadi pada sel eukariot. • Pada mekanisme kedua (programmed circuits), produk suatu gen dapat mempengaruhi transkripsi gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen lainnya, secara terprogram dan berurutan. • Ekspresi gen yang terprogram secara berurutan tersebut saling mengontrol ekspresi gen lainnya, sehingga ekspresinya tidak bisa terjadi diluar urutan yang telah terprogram tersebut. REGULASI EKSPRESI GEN • OPERON adalah segmen DNA yang terdiri dari klaster gen yang ditranskripsi sebagai satu unit. • Sistem operon terdiri dari : promotor operon atau promotor bagi gen struktural, operator, dan gen struktural. REGULASI EKSPRESI GEN • Secara umum dikenal 2 macam regulasi ekspresi gen yaitu : regulasi negatif dan regulasi positif. • Regulasi positif pada operon adalah operon tersebut dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. • Regulasi negatif berarti operon dinonaktifkan oleh ekspresi gen regulator. REGULASI EKSPRESI GEN • • • • Produk gen regulator terdiri dari : AKTIVATOR, berperan dalam regulasi positif. REPRESOR, berperan dalam regulasi negatif. Produk gen tersebut bekerja dengan cara berikatan pada sisi pengikatan protein regulator pada daerah promotor gen yang diaturnya. • Pengikatan aktivator atau represor pada promotor ditentukan oleh adanya suatu molekul efektor yang biasanya berupa asam amino, karbohidrat, atau metabolit lainnya. REGULASI EKSPRESI GEN • INDUSER adalah molekul efektor yang mengaktifkan ekspresi suatu gen • REPRESOR adalah molekul yang bersifat menekan ekspresi gen. • Pada model operon, gen yang mengatur transkripsi gen struktural, terdiri dari gen represor dan gen operator yang letaknya berdekatan dengan gen-gen struktural yang diaturnya. REGULASI EKSPRESI GEN • Gen REPRESOR menyandi pembentukan suatu protein yang disebut dengan protein represor. • Pada kondisi tertentu represor akan berikatan dengan operator, menyebabkan terhalangnya transkripsi gen-gen struktural. • Hal ini terjadi karena enzim RNA polimerase tidak dapat berikatan dengan promotor yang letakan berdekatan, atau bahkan tumpang tindih dengan operator SISTEM OPERON LAKTOSA • Sistem operon laktosa (lac) merupakan sistem regulasi ekspresi gen yang berperan dalam metabolisme laktosa. • Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari glukosa dan galaktosa. • Jika bakteri E coli dibiakkan dalam medium yang mengandung glukosa dan laktosa maka bakteri E coli akan menunjukkan pola pertumbuhan yang spesifik dimana pertumbuhannya terdiri dari 2 fase eksponensial. SISTEM OPERON LAKTOSA SISTEM OPERON LAKTOSA REGULASI EKSPRESI GEN
