Fatal Purpureocillium lilacinum pneumonia in a green tree python Jean Meyer, Igor Loncaric, Barbara Richter, Joachim Spersgser Abstract Seekor green tree python (Morelia viridis) betina berumur 10 tahun mati akibat pneumonia yang disebabkan oleh fungi Purpureocillium lilacinum, yang telah dikonfirmasi secara histologi dan dengan PCR serta DNA sekuens. Spesies fungi yang sama ditumbuhkan dari swab yang diambil dari terarium tempat ular itu disimpan. Secara klinis dan lingkungan, isolat P. lilacinum tidak dapat dibedakan dengan jenis metode yang diterapkan, sehingga sangat menunjukkan keterkaitan klonal antara kedua isolat. Tidak ditemukan adanya faktor predisposisi yang menyebabkan infeksi saluran respirasi yang dapat dideteksi dengan PCR virus-specific atau dengan histopatologi, sehingga P. lilacinum dianggap sebagai patogen utama paru pada ular python tersebut. Key words: Green tree python; Morelia viridis; Purpureocillium lilacinum; mikosis, pneumoni, reptil, ular Purpureocillium lilacinum (sebelumnya Paecilomyces lilacinus) adalah fungi yang tersebar di mana-mana, bersifat saprofitik, berfilamen yang umum terdapat di tanah, di vegetasi yang telah membusuk, di serangga dan nematoda, di air, di udara dalam ruangan, dan di berbagai zat kental. Fungi ini terkenal karena entomopatogenisitasnya dan telah banyak digunakan sebagai agen biokontrol pertanian. Dengan derajat virulensi moderat, P. lilacinum dapat bertindak sebagai patogen primer menyebabkan penyakit di berbagai reptil termasuk chelonian, buaya, dan squamata. Kemampuan fungi ini untuk berkolonisasi di bahan sintetis, seperti kateter atau implan plastik, mengindikasikan bahwa fungi ini mungkin juga memilikinya potensi untuk berkolonisasi di rak anorganik dan terrarium. Pengambilan sampel permukaan anorganik terarium ular dilakukan sebagai bagian dari penelitian kami untuk memvalidasi hipotesis ini. Identifikasi patogen yang akurat penting untuk pendekatan terapeutik karena kerentanan terhadap agen antifungi mungkin berbeda bahkan di luar level spesies. Di sini kami menyajikan kasus infeksi P. lilacinum paru yang fatal pada green tree python (Morelia viridis) dan diidentifikasi dengan histopatologi, kultur fungi, PCR, dan DNA sequens. Green tree python (Morelia viridis) betina berumur 10 tahun ditemukan mati di terariumnya dengan posisi berbaring di lantai terarium dengan anamnesa kesulitan bernapas selama 5 hari. Ular tersebut ditempatkan secara individual di terarium polivinil klorida besar dengan tanaman plastik sebagai tempat persembunyian dan 2 cabang kayu sebagai perabotan organik tunggal. Lantai wadah dilapisi dengan koran yang diganti secara teratur. Pencahayaan terdiri dari lampu LED dan tabung neon. Aerasi dilakukan dengan membuat slot ventilasi di dinding terarium. Kelembaban dicapai dengan menyemprotkan kontainer setiap hari dengan penyemprot bertekanan menggunakan air keran. Semprotan dibilas secara teratur dengan air bersih dan deterjen, tetapi pipa penyemprot dan pipa pemasok air belum dibersihkan selama beberapa tahun. Saat nekropsi, ular memiliki status gizi yang baik tetapi terdapat nodul di paru yang telah menyebar, lunak dan kuning (Gbr. 1). Organ-organ lain secara makroskopis tidak terlihat ada kelainan. Pemeriksaan mikroskopis menunjukkan paru-paru berisi akumulasi heterofil, histiosit, dan debris nekrotik di dalam saluran udara faveolar dan inflamasi proses menyusup ke trabekula paru-paru (Gbr. 2). Hifa fungi tidak terlihat dengan pewaarnaan hematoxylin dan eosin (HE); menggunakan Grocott methenamine silver (GMS) dan Periodic Acid Schiff (PAS), hifa terlihat banyak di dalam eksudat inflamasi dan jarang menyusup ke jaringan paru-paru. Memiliki septa hifa yang tidak teratur dengan 45 ° dan 90 ° cabang (Gbr. 3). Baik HE maupun pewarnaan khusus menunjukkan struktur reproduksi, seperti phialides dan konidia, sebagai tanda sporulasi adventif pada sampel jaringan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Dengan demikian, secara histologis genus fungi tidak dapat ditentukan. Daerah paru-paru tidak dikolonisasi oleh fungi. Paru memiliki lesio limfoplasmacytic sedang interstitial multifokal, infiltrasi histiositik, dan heterofilik, hiperplasia epitel ringan, dan akumulasi cairan edema derajat sedang, lendir, darah, dan heterofil di dalam saluran udara. Epikardium agak edema, dan pankreas mengalami inflamasi interstitial lymphoplasmacytic subakut moderat dengan degenerasi hidropik sel asinar. Gambar 1–4. Pneumonia granulomatosa multinodular dalam python pohon hijau (Morelia viridis) sebagai hasil dari infeksi Purpureocillium lilacinum Gambar 1. Nodul milier di paru-paru. Gambar 2. Fokus heterogranulomatosa pneumonia dengan akumulasi eksudat di ruang udara faveolar dan infiltrat campuran septa faveolar (HE). Bar = 150 μm. Gambar 3. Jaringan paru-paru dengan hifa fungi bercabang dalam eksudat inflamasi. Grocott methenamine silver. Bar = 30 μm. Gambar 4. Konidiofor Purpureocillium lilacinum dengan sel phialidic dan rantai konidia ellipsoidal dari kultur in vitro. Lactophenol Cotton Blue. Bar = 20 μm. Paru-paru, hati, ginjal, limpa, dan otak diuji terhaddap beberapa virus patogen termasuk adenovirus, arenavirus (California academy of science virus, Golden Gate virus, and Colierville virus), nidovirus, paramyxovirus, dan reovirus dengan uji PCR di laboratorium komersial (Laboklin, Bad Kissingen, Jerman). Semua hasil uji negatif. Jaringan paru-paru dan swab diserahkan untuk pemeriksaan mikrobiologis. Beberapa potong dari tanaman plastik, cabang-cabang kayu, dan koran di terarium dijadikan sampel, dan sampel swab diambil dari sudut bawah terarium serta pipa penyemprot dan pipa semprotan yang bertekanan. Isolasi bakteri dan fungi dari spesimen dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya menghasilkan pertumbuhan fungi yang berlimpah, yang dianalisis secara rinci dengan pendekatan multifase. Setelah dikultur pada suhu 28 ° C selama 5 hari pada Sabouraud agar dengan gentamicin dan chloramphenicol (SAB, Becton Dickinson, Heidelberg, Jerman), isolat fungi dari jaringan paru-paru (isolat 2058) dan tambahan isolat dari sudut bawah (isolat BA1) menunjukkan morfologi koloni yang mirip kemudian dikultur kembali pada SAB menggunakan kondisi yang sama. Setelah 5 hari inkubasi, koloni kedua isolat berdiameter 2030 mm terdiri dari basal yang kompak yang tertutup oleh pertumbuhan gumpalan udara berlebih, dengan aspek bagian belakang yang pucat. Koloni yang awalnya berwarna putih kemudian berubah menjadi sedikit ungu setelah inkubasi yang lebih lama. Secara mikroskopis, konidiofor dengan kelompok sel phialidic yang padat dan rantai konidia ellipsoidal dari kehadiran konidiogenus sel. (Gbr. 4). DNA kedua isolat diekstraksi dan amplifikasi PCR dari ITS1-5.8S-ITS2, domain D1 dan D2 dari gen 28S rRNA (D1-D2), dan sebuah fragmen 18S rDNA selanjutnya diurutkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. BLASTn dengan pengaturan default (http: digunakan untuk membandingkan urutan yang diperoleh ke urutan basis data DNA yang tidak berlebihan. Urutan DNA disejajarkan dengan urutan paling mirip dari spesies yang tersimpan di GenBank menggunakan MEGA v.6 untuk mengetahui tingkat hubungan. Perangkat lunak yang sama digunakan untuk analisis filogenetik. Kemungkinan maksimum berdasarkan pada parameter Tamura 3- , koreksi jarak nukleotida yang diperoleh dari data urutan DNA dari 3 lokus (D1D2 28S rDNA, 18S rDNA, dan ITS1-5.8S-ITS2) dengan 1.000 tali sepatu digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetik. Perbandingan dengan rDNA 18S yang sesuai, 28S rDNA, dan urutan ITS1-5.8S-ITS2 menunjukkan bahwa kedua isolat berbagi skor kesamaan tinggi dengan strain P. lilacinum (Gbr 5). Urutan nukleotida parsial diendapkan di GenBank: gen 18S rRNA, KY410346-KY410347; ITS1-5.8S-ITS2, KY410342 – KY410343; dan D1-D2, KY410345 – KY410346. Selain itu, kedua isolat P. lilacinum (2058, BA1) diidentifikasi secara acak dengan amplifikasi DNA polimorfik (RAPD) -PCR menggunakan 5 primer yang berbeda (5`-GTGGATGCGA-3`, 5`-ACGCGCATGT3`, 5` ACGGCCGACC-3`, 5`AGGCCGCTTA-3`, 5`-AGCGGGCCAA-3`, dan 5` AGCGTCACTG-3`). Analisis RAPD sangat disarankan untuk mengetahui hubungan klonal isolat P. lilacinum secara klinis dan lingkungan, dengan dua jenis isolat yang tidak bisa dibedakan dengan jenis metode yang digunakan.
