SEMINAR HASIL TUGAS AKHIR 2 AKTIVITAS SENYAWA FLAVONOID FRAKSI ETIL ASETAT DARI TANAMAN COCOR BEBEK (Kalanchoe tomentosa) TERHADAP PENGENGHAMBATAN AKTIVITAS ENZIM α-AMILASE Delia Ilfani 3211151031 Pembimbing : Dr. Lilis Siti Aisyah,M.Si Dr. Yenny Febriani Yun, M.Si. Koordinator : Dr. Valentina Adimurti K, M.Si Penguji : Sukrido,Drs.,M.Si. Anggi Suprabawati,S.Si., M.Si. Latar Belakang Penelitian 382 juta orang tahun 2013, 2015 592 juta orang tahun 2035, (WHO, 2013) Enzim α-Amilase 2017 Efek samping Obat jangka Panjang Pemanfaatkan senyawa bahan alam dari tumbuhan Latar Belakang Penelitian Tanaman dari Genus Kalanchoe kaya akan Senyawa Flavonoid 2015 Gain dan Gupta tahun 1971-1973 2017 Kalanchoe telah banyak dilaporkan memiliki berbagai Aktivitas, seperti Anticancer, antimalaria, andibakteri dan Antidiabetes Penelitian antidiabetes dari genus Kalanchoe Peneliti Spesies / Bagian Tanaman Hasil Penelitian Dewiyanti, et al., 2012 K.pinnata Lam.Pers / Daun Memiliki aktivitas anti-diabetes dengan IC50 kurang dari 100 ppm. Shashank, et al., 2013 K.pinnata Lam.Pers / Daun Swapnil, et al., 2013 K.pinnata Lam.Pers / Daun Kalyan,et al., 2015 K.pinnata Lam.Pers / Daun Sunayana, et al., 2016 K.pinnata Lam.Pers / Daun aktivitas inhibisi enzim α-amilase yang signifikan dibandingkan dengan ekstrak air. glukosa darah puasa diturunkan menjadi 116 mg / dl dari 228 mg / dl pada perlakuan dengan berat 10 mg / kg berat badan fraksi DCM. farmakologis penelitian telah dilaporkan memiliki aktivitas antidiabetes. Glukosa serum darah berkurang menjadi 117 mg / dL. Yuliani, et al., 2016 K.pinnata Lam.Pers / Daun Ekstrak memiliki efek hipoglikemik terbaik dan peningkatan jumlah langerhans sel β pankreas sebesar 11,6 mg/kg. 4 6 6 6 C H O H 2 C H O H 2 C H O H 2 5 5 5 O H O H H 3 2 H H O H O H H 3 2 H H 1a 4 O O H O H H 3 2 H H 1a O 4 1a O Enzim α-Amilase Senyawa Flavonoid Kalanchoe tomentosa Flavonoid diketahui dapat menghambat aktivitas enzim α-Amilase (Gu et al., 2015 dalam Puspitayanti R, 2016). Identifikasi Masalah 01 Bagaimana aktivitas senyawa flavonoid fraksi etil asetat daun K. tomentosa terhadap penghambatan enzim α-amilase. 02 Bagaimana karakterisasi senyawa flavonoid dari fraksi etil asetat daun K. tomentosa. Maksud dan Tujuan Penelitian 01 Mengetahui aktivitas karakterisasi senyawa flavonoid dari fraksi etil asetat daun K.tomentosa 02 Mengetahui aktivitas senyawa flavonoid terhadap penghambatan enzim α-Amilase Kegunaan Penelitian Adapun kegunaan penelitian ini yaitu untuk memberikan informasi mengenai karakterisasi senyawa flavonoid dari ekstrak Etil Asetat daun K. tomentosa serta aktivitas senyawa flavonoid terhadap penghambatan enzim α-Amilase. Metodologi Penelitian Contents Here Preparasi Sampel Contents Here Isolasi Senyawa Contents Here Pembuatan Ekstrak Contents Here Identifikasi Senyawa Contents Here Penentuan Struktur Contents Here Uji Penghambatan Enzim Waktu dan Tempat Penelitian Dilaksanakan pada bulan Oktober 2018 sampai dengan Juli 2019 1. Laboratorium Kimia Bahan Alam FSI UNJANI, Cimahi 2. Laboratorium Pusat Penelitian Bioteknologi dan Bioindustri, Bogor 3. Laboratorium Kimia PUSPITEK, Serpong Tinjauan Pustaka Kingdom Divisi Kelas Subkelas Ordo Famili Genus Spesies : Plantae :Magnoliophyta : Magnolyopsida : Rosidae : Sxaifragales : Crassulaceae : Kalanchoe :K.tomentosa Menurut Milad dkk. (2014),genus Kalanchoe mempunyai beberapa aktivitas farmakologi yaitu: AntiViral Antileishimal Sitotoksik Antikonvulsan Obat Pereda nyeri Anti-depresan Antimikroba Antidiabetik Antiinflamatori Antioksidan Tinjauan Pustaka Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder pada Tanaman Kalanchoe Senyawa Flavonoid dari Kalanchoe OH O H3C HO O Gambar 2. 4 Senyawa flavonoid dari K. streptantha O O R3 OR2 OH (Costa dkk., 2006) O (4) R1 = R2 = Ac, R3 = H H3C R3O OH (5) R1 = R3 = Ac, R2 = H OH O (6) R2 = Ac, R1 = R3 = H H3C O Gambar 2.3 Senyawa Flavonoid 2-4 dari K. brasiliensis (Costa dkk, 1994) O O OH OH HO OH O O OH HO OH Tinjauan Pustaka OH OH HO O OH OH OR OH O OH O N H OH Kuersitrin: R = ramnopiranosa Gambar 2. 5 Senyawa flavonoid dari K. pinnata (Muzitano dkk., 2006) OH O CH3 OH O 10 Gambar 2. 6 Senyawa 9-10 flavonoid dari K. pinnata 9 (Okwu dan Nnamdi, 2011) OH Tinjauan Pustaka HO HO O OH O HO O CH3 O O HO HO OH OH OH O O OH OH OH O H3C HO HO OH O HO O O O O O OH HO O HO HO HO O OH HO HO OH HO HO OH OH OH O HO O O O O OH OH OH O OH O O O HO HO HO OH HO OH HO HO Gambar 2. 7 Senyawa Flavonoid 11-16 dari K. prolifera (Aisyah dkk, 2017) Daun K.tomentossa - maserasi - Saring dengan n-heksana Residu Ekstrak cair n-heksana -maserasi dengan diklorometana - saring -evaporasi Ekstrak pekat n-Heksana Metoda Penelitian Residu Ekstrak cair diklorometana -maserasi dengan etil asetat - saring Add Text Ekstrak cair Etil Asetat A Residu - evaporasi - evaporasi Ekstrak pekat diklorometana Ekstrak pekat Etil Asetat -isolasi dan pemurian dengan berbagai metoda kromatografi dan rekristalisasi Senyawa Murni -penentuan stuktur dengan UV,IR,IH-NMR. Data fisik, spektrum dan senyawa flavonoid aktif -uji Penghambatan Enzim Data aktivitas dan nilai IC50 ekstrak pekat Etil asetat Pembahasan, Kesimpulan dan dilaporan dalam bentuk skripsi Alat Gelas yang umum digunakan untuk pemisahan dan pemurnian, UV, IR dan NMR Alat dan Bahan Tanaman K.tomentosa dan Bahan Kimia lainnya Hasil dan Pembahasan Pembuatan Ekstrak Proses Isolasi Pemurnian Senyawa Uji Penghambatan Enzim 10 gram extract of K.tomentossa KCV Running 2 KCV Running 1 5 gram extract of K.tomentossa 5 gram extract of K.tomentossa VLC with eluent N-Heksan ; EA VLC with eluent N-Heksan ; EA 24 Fraction 26 Fraction VLC with eluent n-heksana: Ea (6:4) Merging Fractions VLC with eluent n-heksana: Ea (6:4) Merging Fractions 15 Fraction 36-4 36-1 36-2 36-3 (4-5) TLC with eluent n-heksana: Ea (6:4) Merging Fractions 28-1 28-2 28-3 28-4 28-5 28-6 28-7 36-5 (6-7) 28-9 28-8 (9-11) 28-10 28-11 28-12 28-13 TLC with eluent n-heksana: Ea (6:4) Merging Fractions 30-1 30-2 30-3 30-4 30-5 30-6 30-7 30-8 (10-11) Digabung VLC 1 dan VLC 2 41-1 (1a-2b) 41-2 (1b) 41-3 (2a-3b) 41-4 (3b) 41-5 41-6 41-7 (4a-6a) (4b-6b) (7a-7b) 41-8 (8a) 41-9 (8b) 41-10 (9b-10) Senyawa 41-8 17.9 mg 36-6 (8-9) 36-7 36-8 (10-14) (15-17) 36-9 18+20 36-10 (21-24) PROSES REKRISTALISASI DAN HASIL KLT ISOLAT A KLT dengan 3 eluen yang berbeda Rekristalisasi dg Hexan panas ʎ : 365 nm ʎ : 254 nm ʎ : 254 nm ʎ : 365 nm SPOT SENYAWA ISOLAT A YANG LEBIH MURNI KLT 2D ʎ : 254 nm ʎ : 365 nm ʎ : 254 nm ʎ : 365 nm Analisa dengan Spektrofometer UV Pita I (365 nm) Pita II (260 nm) Add Text A O B A Benzoil O Sinamoil Analisa dengan Spektrofometer IR C=C O-H C=O C=C C=O C=C Analisa dengan Spektrofometer 1H-NMR H 3` H H 8 H OH J m e t a = 2 . 3 H z6A 6 2` J m e t a = 1 .7 H z H Add Text 5` H J o r t o = 6 .9 H z A 2ʹ J m e t a = 2 .3 H z 3ʹ 86 5 6ʹ 5ʹ B 5` 2 1` 6` C 3 4 5 4` 6` O 4a OH B 1` H H 3` H 8a A H 5 J o r t o = 6 .9 H z 8 7 7 2` 1 O H OH OH 4` H Perbandingan data spektroskopi 1H-NMR Kaempferol menurut Kuncoro et al., 2018 dengan isolat A Add Text A Perbandingan Analisa KLT isolate A dengan Senyawa Kaempferol Standar ʎ 254 nm ʎ 365 nm Kaemferol Isolat A Kaemferol Isolat A Senyawa 3,7,4'-trihidroksiflavonol / Kaempferol. H 3` H H OH 1 8a O 5` 2 1` 6` 3 6 H 4a 4 5 OH OH 2` 8 7 4` H H OH O Padatan Kuning, spektrum Uv : ʎmaks 275: nm, Spektrum IR (KBr) cm-1 : 3412, 1498 dan 1606 dan Spektrum 1H-NMR (aseton d6) δH 6.272 Uji Penghambatan Aktivitas Enzim α-Amilase Tabel Hasil Uji Penghambatan Enzim α-Amilase Kontrol Uji Sampel Hasil Pengujian (Inhibisi Amilase) Konsentrasi Kadar Satuan Enzim * - 319.35 mU/mL Akarbosa ** 25 ppm 163.63 mU/mL 50 ppm 145.01 mU/mL 25 ppm 300.23 mU/mL 50 ppm 298.73 mU/mL 25 ppm 349.18 mU/mL 50 ppm 298.26 mU/mL Ekstrak Isolat Grafik %inhibisi terhadap konsentrasi Isolat Ekstrak Inhibisi 10 Линейная (Inhibisi ) 5 Inhibisi 6 4 y = 0.1292x + 0.9233 R² = 0.8031 2 0 0 10 10 20 30 KONSENTRASI 40 50 30 40 50 60 y = 0.1322x - 4.215 R² = 0.1701 -15 0 20 -5 -10 0 Линейная (Inhibis ) Inhibis 60 Konsentrasi Akarbosa 80 Inhibisi INHIBISI 8 60 40 y = 1.0918x + 7.1583 R² = 0.829 20 IC50 = 0 0 10 Inhibisi 20 30 40 Konsentrasi 50 Линейная (Inhibisi ) 60 (𝟓𝟎−𝒂) 𝒃 Tabel Nilai % inhibisi dan IC50 Ekstrak, Isolat dan Akarbosa Konsentrasi Ekstrak 0 ppm 25 ppm 50 ppm 0 6 6.4 % Inhibisi Isolat Akarbosa 0 6.61 9.34 0 48.77 54.60 IC50 (µU/ml) Ekstrak Isolat Akarbosa 379.8 346 39.2 Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa isolat diidentifikasi sebagai senyawa golongan flavonoid yaitu kaempferol atau 3,7,4'-trihidroksiflavonol dapat menghambat aktivitas enzim α-Amilase dan α-glukosidase (Daud et al., 2019). 4 6 6 6 CH2OH CH2OH CH2OH 5 O 5 O 5 O H OH H H OH H H OH H 3 2 3 2 3 2 H H H H H H 4 1a Sesuai dengan literatur menurut Ariani et al., 2017 gugus hidroksi pada pada cincin A dan cincin B pada senyawa flavonoid meningkatkan kemampuan inhibisi enzim. Gugus hidorksi C3’ dan C4’ merupakan faktor utama dalam penghambatan enzim α-amilase. O 1 4 a O H 3` H OH 7 6 H H 8 5 OH B 2 1` C 4a 3 4 O O 4` OH 2` 1 O 8a A 1a 5` 6` H OH H Kesimpulan A. Kesimpulan 1 2 Hasil isolasi senyawa dari ekstrak Etil Asetat daun K.tomentosa diperoleh senyawa metabolit sekunder yang teridentifikasi sebagai senyawa kaempferol. Uji aktivitas penghambatan enzim α-amilase menunjukan nilai IC50 pada ekstrak dan isolat sebesar 379.8 µU/ml dan 346 µU/ml. hasil menunjukan nilai IC50 yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol akarbosa yaitu sebesar 39.3 µU/ml. B. Saran 1 2 Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa metabolit sekunder lainnya yang masih terkandung dalam daun K.tomentosa . Uji aktivitas Penghambatan Enzim sebaiknya dilakukan dengan variasi konsentrasi yang lebih banyak untuk mengetahui konsentrasi aktivitas hambat yang opitimal pada isolat dan ekstrak. Daftar Pustaka Aisyah,L.S., Yun, Y.F., Abdillah, A. A., Herlina, T., Julaeha, E.,dan Supratman, U. 2016. Flavonoid Compound From The Leaves of Kalanchoe tomentosa And Their Cytotoxic Activity Against P-388 Murine Leukima Cell. Akta Kimia Indonesia 1(1)1 : 1-4. Aisyah,L.S., Yun, Y.F., T., Julaeha, E., Herlina, T., Zainuddin, A., Hermawan, W., Supratman, U., Hayashi, H.2015. Flavonoids from the Fresh Leaves of Kalanchoe tomentosa (Crassulaceae). Open Chemistry Journal 2. pp 36-39. Ariani,N., Irma Ratna Kartika., Fera Kurniadewi.2017. Uji Aktivitas Inhibisi Enzim α-Glukosidase secara In Vitro dari Ekstrak Metanol Daun Cryptocarya densiflora Blume dan Fraksi-Fraksinya.Jurnal Riset Sains dan Kimia Terapan.Vol. 7, No.1. Achmad, S., A. 1986. Buku Materi Pokok Kimia Organik Bahan Alam. Jakarta. Penerbit Karunika Universitas Terbuka. AK.M Daud.,Juliani., Sugianto., Mahdi Abrar.2019. α-Amylase And α-Glucosidase Inhibitors From Plant Extracts. Jurnal Medika Veterinaria.pp 13(2): 1-8. Costa, S. S., Jossang, A., dan Bodo, B. 1994. Patuletin Acetylrhamnosides from Kalanchoe brasiliensis as Inhibitors of Human Lymphocyte Proliferative Activity. Journal of Natural Products 57(11): 1503-1510. Costa, S.S. De Souza, M.L.M. Ibrahim, T. De Melo, J. Nat. Prod., 69, G.O. De Almeida, A.P., Guette, C., Ferezou, J.P., dan Koatz, V.L.G. 2006. Kalanchosine dimalate, an Anti-inflammatory Salt from Kalanchoe brasiliensis (5), pp 815-818. Costa, S.S. Muzitano, M.F. Camargo, L.M.M. dan Coutinho, M.A.S. 2008. Therapeutic Potential of Kalanchoe Species: Flavonoids and other Secondary Metabolites, Nat. Pro. Communication., 3(12), pp 2151-2164. Supratman, U. Fujita, T. Akiyama, K. dan Hayashi, H. 2000. New Insecticidal Bufadienolide, Bryophyllin C, from Kalanchoe pinnata. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (6), pp 1310-1312. TERIMA KASIH Aktivitas Sampel Konsentrasi Enzim Enzim 319.35 25 163.63 Akarbosa 50 145.01 25 300.23 Ekstrak 50 298.73 25 349.18 Isolat 50 298.26 Persentase Amilase = Persentase Amilase Persentase Inhibisi 51.2 45.4 94.0 93.5 109 93 49 55 6.0 6.5 6.60 9.3 (𝑨𝒌𝒕𝒊𝒗𝒊𝒕𝒂𝒔 𝑬𝒏𝒛𝒊𝒎 +𝑺𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍) 𝑨𝒌𝒕𝒊𝒗𝒊𝒕𝒂𝒔 𝑬𝒏𝒛𝒊𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎 Persentase Inhibisi = 𝟏𝟎𝟎 – Persentase Amilase Persentase Inhibisi = 𝟏𝟎𝟎 – IC50 39.2 279.8 346 IC50 = (𝟓𝟎−𝒂) 𝒃
