Fractionation of Flavonoid Group from Kepel

4
merah jauh (50–1000 µm) (Giwangkara
2007). Spektrofotometer inframerah dibagi
menjadi 3 jenis yaitu spektrofotometer
Inframerah
dispersive
(kualitatif),
spektrofotometer inframerah tak dispersive
(kuantitatif), dan spektrofotometer inframerah
transformasi
fourier
(kualitatif
dan
kuantitatif).
Spektroskopi FTIR menggunakan prinsip
interferometer (Skoog et al. 2004).
Spektroskopi FTIR mengukur vibrasi
dominan dari gugus fungsi dan ikatan yang
memiliki kepolaran yang tinggi (Thor &
Jeffery 2005). Prinsip FTIR adalah ketika
sampel berinteraksi dengan sinar (radiasi
elektromagnetik), maka ikatan kimia pada
panjang gelombang tertentu akan menyerap
sinar ini dan akan bervibrasi. Vibrasi ini dapat
berupa vibrasi tekuk atau vibrsi ulur.
Absorbans atau vibrasi ini dihubungkan
dengan ikatan tunggal atau gugus fungsi dari
molekul untuk identifikasi senyawa yang tidak
diketahui (Dunn & David 2005).
penangkap radikal superoksida. Hamdiyati et
al. (2008) melaporkan bahwa senyawa aktif
dari daun patikan kebo yang dapat
menghambat pertumbuhan S. epidermidis
adalah flavonoid, tanin, alkaloid, dan
terpenoid. Sukadana (2009) melaporkan
bahwa isolat flavonoid fraksi FB dari ekstrak
kental air buah belimbing manis diduga
termasuk golongan katekin yang dapat
menghambat bakteri gram positif (S. aureus)
dan gram negatif (E. coli), masing-masing
mulai dari konsentrasi 500 ppm dan 100 ppm.
Isolat flavonoid yang berhasil diisolasi dari
kulit akar awar-awar adalah
golongan
flavanon yang mempunyai aktivitas sebagai
antibakteri terhadap Vibrio cholera dan E.
coli (Sukadana 2010).
Flavonoid
Flavonoid (Gambar 2) merupakan salah
satu metabolit sekunder, kemungkinan
keberadaannya dalam daun dipengaruhi oleh
adanya proses fotosintesis sehingga daun
muda belum terlalu banyak mengandung
flavonoid (Markham 1988). Lebih dari 2000
flavonoid yang berasal dari tumbuhan telah
diidentifikasi, namun ada tiga kelompok yang
umum dipelajari, yaitu antosianin, flavonol,
dan flavon. Flavonoid sering terdapat di sel
epidermis.
Sebagian
besar
flavonoid
terhimpun di vakuola sel tumbuhan walaupun
tempat sintesisnya ada di luar vakuola
(Salisbury & Ross 1995)
Flavonoid berupa senyawa yang larut
dalam air dan dapat diekstrak dengan etanol
70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah
ekstrak ini dikocok dengan eter. Flavonoid
berupa senyawa fenol karena itu warnanya
berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi
mereka mudah dideteksi pada kromatogram
atau dalam larutan. Flavonoid terdapat dalam
semua tumbuhan pembuluh dan dalam bentuk
campuran, jarang sekali dijumpai hanya
flavonoid tunggal. Penggolongan jenis
flavonoid dalam jaringan tumbuhan mulamula didasarkan kepada telaah sifat kelarutan
dan reaksi warna (Harbone 1987).
Menurut Cos et al. (1998), aktivitas
flavonoid sebagai penurun kadar asam urat
melalui penghambatan enzim xantin oksidase.
Selain itu juga bersifat sebagai antioksidan
Gambar 2 Struktur Umum Flavonoid
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah
serbuk daun kepel, akuades, heksana, etil
asetat, kloroform metanol, etil asetat, pelarut
DMSO, silika gel, media trypticase soy broth
(TSB), bakteri S. epidermidis, tetrasiklin,
TCC, dan pelat aluminium jenis silika gel
G60F254 dari Merck.
Peralatan yang digunakan adalah peralatan
gelas, cawan porselen, oven, eksikator, neraca
analitik, penguap putar, bejana kromatografi,
kromatografi kolom, autoklaf, inkubator, 96well plates, spektrofotometer UV-tampak
(Shimadzu), dan FTIR (Brucker).
Metode
Metode penelitian yang akan dilakukan
mengikuti diagram alir pada Lampiran 1 yaitu
penentuan kadar air, kadar abu, penentuan
ekstrak
dengan maserasi, uji flavonoid
ekstrak daun kepel, fraksinasi ekstrak dengan
eluen terbaik menggunakan kromatografi
kolom. Uji aktivitas antimikroba dari semua
fraksi yang diperoleh. Selanjutnya, penentuan
5
senyawa yang terkandung dalamfraksi teraktif
dengan spekrtofotometer UV-tampak dan
FTIR.
Identifikasi dan Pengumpulan Sampel
Daun kepel (Stelechocarpus burahol) yang
digunakan dalam penelitian ini berasal dari
Cilacap pulau Jawa Indonesia. Identifikasi dan
spesimen contoh disimpan di Laboratorium
Uji Pusat Studi Biofarmaka, Institut Pertanian
Bogor.
Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)
Cawan porselin dikeringkan pada suhu
105 ºC selama 30 menit lalu didinginkan
dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g
contoh daun kepel dimasukkan dalam cawan
dan dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 3
jam sampai diperoleh bobot konstan,
kemudian didinginkan dalam eksikator dan
ditimbang. Penetapan kadar air ini dilakukan
berdasarkan penentuan jumlah bobot kering
contoh. Penentuan kadar air dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan (triplo).
Kadar air (%) = A  B 100%
A
Keterangan:
A = bobot contoh sebelum dikeringkan (g)
B = bobot contoh setelah dikeringkan (g)
Penentuan Kadar Abu (AOAC 2006)
Cawan porselin dikeringkan di dalam
tanur listrik bersuhu 600 °C selama 30 menit.
Selanjutnya cawan didinginkan dalam
eksikator selama 30 menit, kemudian
ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 1 g
contoh dimasukkan ke dalam cawan,
kemudian dipijarkan di atas nyala api
pembakar bunsen sampai tidak berasap lagi.
Setelah itu, dimasukkan ke dalam tanur listrik
dengan suhu 600 °C sampai contoh menjadi
abu. Setelah abu berwarna putih, cawan yang
berisi abu diangkat dari dalam tanur dan
didinginkan dalam eksikator, lalu ditimbang.
Penentuan kadar abu dilakukan sebanyak tiga
kali ulangan (triplo).
Kadar abu (%) = B  100%
A
Keterangan:
A = bobot contoh (g)
B = bobot abu (g)
Ekstraksi (Sukadana 2009)
Serbuk daun kepel dimaserasi dengan
metanol sebanyak 3 kali selama 24 jam.
Ekstraksi dilakukan dengan perbandingan 1 g
serbuk daun kepel : 10 mL metanol. Ekstrak
metanol yang diperoleh dipekatkan dengan
penguap putar vakum pada suhu 60 °C
sampai diperoleh ekstrak kental metanol.
Ekstrak
kental metanol disuspensikan
kedalam campuran pelarut metanol:air (7:3)
kemudian dipartisi dengan n-heksana 25
mL. Ekstrak n-heksana yang diperoleh
diuapkan sampai kental, sedangkan bagian
metanol:air
dipartisi
dengan 25 mL
kloroform
sehingga didapat ekstrak
metanol:air dan ekstrak kloroform
yang
selanjutnya masing-masing ekstrak tersebut
diuapkan sehingga diperoleh ekstrak kental
metanol:air dan ekstrak kental kloroform.
Masing-masing
ekstrak kental
yang
diperoleh (ekstrak kental n-heksana, ekstrak
kental kloroform
dan
ekstrak
kental
metanol:air)
dilakukan
uji fitokimia
flavonoid. Ekstrak yang positif flavonoid
dilanjutkan
untuk
dipisahkan
dan
dimurnikan dengan teknik kromatografi
kolom.
Uji Fitokimia (Harborne 1987)
Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 g ekstrak
daun kepel yang diperoleh ditambahkan 10
mL air panas kemudian dididihkan selama 5
menit dan disaring. Sebanyak 10 mL filtrat
ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 mL HCl
pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran
dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan
munculnya warna merah, kuning, atau jingga
pada lapisan amil alkohol.
Pemilihan Eluen Terbaik(Houghton &
Raman 1998)
Pelat kromatografi lapis tipis (KLT) yang
digunakan adalah pelat alumunium jenis silika
gel G60F254 dari Merck. Ekstrak daun kepel
ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 15 kali
totolan. Setelah kering, langsung dielusi
dalam bejana kromatografi yang telah
dijenuhkan oleh uap eluen pengembang.
Eluen yang digunakan yaitu n-heksana, etil
asetat, aseton, kloroform, butanol dan
metanol. Spot yang dihasilkan dari masingmasing eluen diamati di bawah lampu UV
pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.
Eluen yang menghasilkan spot terbanyak dan
terpisah dipilih sebagai eluen terbaik. Jika
lebih dari 1 eluen menghasilkan spot
terbanyak dan terpisah, maka eluen-eluen
6
tersebut dicampurkan dengan perbandingan
mengikuti metode konstruksi segitiga.
Fraksionasi
Fraksionasi dilakukan dengan pengemasan
kolom sebanyak 15 g silika gel untuk
memisahkan 1.5 g ekstrak dengan diameter
kolom 1 cm dan tinggi kolom 30 cm. Ekstrak
daun kepel yang paling banyak mengandung
flavonoid dilarutkan dalam metanol:air (7:3).
Komponen-komponennya
kemudian
dipisahkan menggunakan kolom kromatografi
dengan elusi isokratik. Eluat ditampung setiap
5 mL dalam tabung reaksi yang telah diberi
nomor kemudian diuji dengan KLT. Noda
pemisahan dideteksi di bawah lampu UV pada
panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
Eluat yang memiliki nilai Rf dan pola KLT
yang sama digabungkan sebagai satu fraksi.
Semua fraksi yang diperoleh, diuji aktivitas
antibakterinya. Fraksi yang memiliki aktivitas
antibakteri paling tinggi dipisahkan lebih
lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis
preparatif sehingga diperoleh fraksi traktif
yang memiliki noda tunggal.
Pendugaan
Senyawa
dengan
spektrofotometer UV-tampak
Sebanyak 1 mg fraksi teraktif dilarutkan
dengan metanol, lalu dimasukkan ke dalam
labu takar 50 mL dan ditera dengan akuades.
Setelah itu, larutan dimasukkan kedalam
kuvet dan ditempatkan ke dalam tempat
sampel pada alat spektrofometer UV-tampak
untuk dianalisis.
Pendugaan Senyawa dengan FTIR
Sedikit fraksi teraktif (kira-kira 1−2 mg)
ditambahkan bubuk KBr murni (kira-kira 200
mg) kemudian diaduk hingga rata. Campuran
ditempatkan dalam cetakan dan ditekan
dengan menggunakan alat penekan mekanik.
Tekanan ini dipertahankan beberapa menit,
kemudian sampel (pelet KBr yang terbentuk)
diambil dan ditempatkan dalam tempat sampel
pada alat spektrofotometer FTIR untuk
dianalisis.
Uji Aktivitas Antibakteri (Batubara et al
2009)
Organisme yang digunakan dalam
penelitian
ini
adalah
Staphylococcus
epidermidis. Media yang digunakan trypticase
soy broth (TSB). Sebanyak 100 µL medium
steril, 40 µL sampel dilarutkan dalam DMSO
20% atau kontrol dan 5 µL inokulum bakteri
dimasukkan ke dalam masing-masing sumur
(96-well plate). Inokulum telah disiapkan
pada konsentrasi 10-2 CFU/mL. S. epidermidis
diinkubasi dalam media selama 48 jam pada
suhu 37 oC. Konsentrasi ekstrak yang tidak
menunjukkan pertumbuhan bakteri (bening)
secara
visual
dideskripsikan
sebagai
konsentrasi hambat minimum (KHM).
Sebanyak 100 µL dari media yang tidak
menunjukkan
pertumbuhan
bakteri
diinokulasikan pada 100 µL media baru.
Kemudian diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37 oC. Konsentrasi yang tidak
menunjukkan pertumbuhan bakteri setelah
inokulasi kedua dideskripsikan sebagai
konsentrasi bunuh minimum (KBM). Kontrol
negatif yang digunakan adalah DMSO dan
kontrol positifnya adalah tetrasiklin dan TCC.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kadar air dan Kadar Abu
Kadar
air
ditentukan
untuk
mengidentifikasi
banyaknya
air
yang
terkandung dalam sampel sebagai persen
bahan kering. Selain itu, penentuan kadar air
berfungsi mengetahui masa simpan serbuk
kering sampel dan sebagai salah satu syarat
bahan baku herbal (Depkes RI 1995). Suatu
sampel dikatakan baik dan dapat disimpan
dalam jangka waktu yang lama apabila
memiliki kadar air <10%, karena pada tingkat
kadar air tersebut sampel dapat terhindar dari
pertumbuhan jamur yang cepat (Soetarno &
Soediro 1997). Air yang terkandung dalam
serbuk daun kepel dihilangkan dengan
pemanasan pada suhu 105 oC. Menurut
Harjadi (1993), air yang terikat secara fisik
dapat dihilangkan dengan pemanasan pada
suhu 100−105 oC. Pada penelitian ini, kadar
air serbuk daun kepel diperoleh sebesar
12.79%(b/b) (Lampiran 2). Kadar air tersebut
lebih dari 10%, sehingga tidak memenuhi
standar mutu MMI (1995). Kadar air dalam
suatu sampel dapat dipengaruhi oleh
kelembapan udara, cara penyimpanan, dan
lama pengeringan.
Penentuan
kadar
abu
bertujuan
memberikan gambaran kandungan mineralmineral logam dalam daun kepel. Dalam hal
ini, serbuk daun kepel dipanaskan hingga
senyawa organik dan turunannya terdestruksi
dan menguap dan tertinggal unsur mineralnya
saja. Kadar abu serbuk daun kepel diperoleh
sebesar 11.44%(b/b) (Lampiran 3). Dilihat
dari standar mutu, hasil tersebut memenuhi
standar mutu MMI (1995), yaitu di bawah
12.00%.